Method Article

Изогенный чип почечного клубочка, разработанный из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток

DOI:

10.3791/63821

⸱

November 4th, 2022

 , 
1Department of Biomedical Engineering, Pratt School of Engineering, Duke University, 2Department of Medicine, Division of Nephrology, Duke University School of Medicine, 3Department of Cell Biology, Duke University, 4Center for Biomolecular and Tissue Engineering, Duke University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь представлен протокол для разработки персонализированной системы «орган на чипе», которая рекапитулирует структуру и функцию клубочкового фильтрационного барьера почек путем интеграции генетически согласованных эпителиальных и сосудистых эндотелиальных клеток, дифференцированных от индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток. Эта биоинженерная система может продвигать прецизионную медицину почек и связанные с ней приложения.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Хроническая болезнь почек (ХБП) поражает 15% взрослого населения США, но создание таргетной терапии было ограничено отсутствием функциональных моделей, которые могут точно предсказать биологические реакции человека и нефротоксичность. Достижения в области прецизионной медицины почек могут помочь преодолеть эти ограничения. Однако ранее установленные in vitro модели клубочка почек человека — первичного участка фильтрации крови и ключевой мишени многих заболеваний и токсичности лекарств — обычно используют гетерогенные клеточные популяции с ограниченными функциональными характеристиками и непревзойденным генетическим фоном. Эти характеристики значительно ограничивают их применение для моделирования конкретных заболеваний пациента и терапевтического открытия.

В этой статье представлен протокол, который интегрирует индуцированный человеком плюрипотентный стволовый (iPS) клеточный клубочковый эпителий (подоциты) и эндотелий сосудов от одного пациента для разработки изогенного и васкуляризированного микрофлюидного чипа почечного клубочка. Полученный чип клубочка состоит из эндотелиальных и эпителиальных клеточных слоев, полученных из стволовых клеток, которые экспрессируют специфические для линии маркеры, продуцируют белки базальной мембраны и образуют интерфейс ткань-ткань, напоминающий клубочковый фильтрационный барьер почки. Спроектированный чип клубочка избирательно фильтрует молекулы и рекапитулирует лекарственное повреждение почек. Способность восстанавливать структуру и функцию почечного клубочка с использованием изогенных типов клеток создает возможность моделировать заболевание почек со специфичностью пациента и продвигать полезность органов на чипах для прецизионной медицины почек и связанных с ней применений.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Устройства «орган на чипе» представляют собой динамические 3D-модели in vitro, которые используют молекулярную и механическую стимуляцию, а также васкуляризацию для формирования ткане-тканевых интерфейсов, которые моделируют структуру и функцию конкретных органов. Ранее установленные устройства «орган на чипе», целью которых было повторение клубочка почки (клубочковые чипы), состояли из клеточных линий животных1 или первичных и увековеченных клеточных линий человека гетерогенных источников 2,3. Использование генетически гетерогенных клеточных источников представляет вариации, к....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка растворов базальной мембранной матрицы и покрытых подложек

  1. Оттаивание фундаментальной мембранной матрицы 1 ночью на льду при 4 °C. Аликвота в соответствии с предложением завода-изготовителя в отношении коэффициента разрежения. Используя коническую трубку объемом 50 мл и пипетку, тщательно перемешайте соответствующее количество матрицы базальной мембраны 1 в 25 мл холодного DMEM/F12 до полного размораживания и растворения.
    1. Чтобы растворить замороженную аликвоту, возьмите ~200 мкл из 25 мл холодного DMEM/F12 и перенесите его в замороженную аликвотную трубку. Пипетка вверх и вниз до тех пор, пока матрица не будет тщательно....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы показываем, что функциональная 3D-модель клубочка in vitro может быть васкуляризирована и эпителизирована из изогенного источника человеческих iPS-клеток. В частности, этот протокол предоставляет инструкции о том, как применять технологию iPS-клеток человека, в частности, их способность дифференцироваться в специализированные типы клеток, генерировать почечный клубочковый эпителий (подоциты) и сосудистый эндотелий (viECs), которые могут быть интегрированы с микрофлюидными устройствами для моделирования .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом отчете мы описываем протокол для получения эндотелия сосудов и клубочкового эпителия (подоцитов) из изогенной клеточной линии iPS человека и использование этих клеток для разработки 3D-системы «орган на чипе», которая имитирует структуру, интерфейс ткани-ткань и молекулярную фильтрационную функцию почечного клубочка. Этот клубочковый чип оснащен эндотелием и клубочковым эпителием, которые вместе обеспечивают барьер для селективной фильтрации молекул.

Исследователи, заинтересованные в а.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

С.М. является изобретателем патента, связанного с дифференцировкой подоцитов из iPS-клеток человека. Другому автору нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Инженерной школой Пратта в Университете Дьюка, Отделом нефрологии в Департаменте медицины Дьюка, стипендией Уайтхеда в области биомедицинских исследований и премией Genentech Research Award для С. Мусы. Ю. Рой является стипендиатом Университета Дьюка-Альфреда. Слоуна и стипендии Уильяма М. «Монти» Райхерта с факультета биомедицинской инженерии Университета Дьюка. Клеточная линия iPS DU11 (клон #11 Университета Дьюка) была сгенерирована на объекте Duke iPSC Core Facility и предоставлена нам лабораторией Bursac в Университете Дьюка. Авторы благодарят Н. Абуталеба, Дж. Холмса, Р. Бхаттачарью и Ю. Чжоу за техническую помощь и полезные обсуждения....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<сильные>антитела
Alexa Fluor 488- и Alexa Fluor 594-конъюгированные вторичные антителаThermo/Life TechnologiesA32744; А32754; А-11076; А32790; А21203; A11015
Коллаген IVThermo/Life Technologies14-9871-82
НефринПрогенGP-N2
PECAM-1R& D SystemsAF806
PodocinAbcamab50339
VE-CadherinSanta Cruzsc-9989
Матрицы базальной мембраны
Corning Fibronectin, HumanCorning356008Basement membrane (3)
iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) фрагментIwai Северная АмерикаN8922012Матрица базальной мембраны (2)
Матрица с квалификацией Matrigel hESC, флакон объемом 5 млBD Biosciences354277матрица базальной мембраны (1); может демонстрировать вариацию от партии к партии
<сильно>Клетки
DU11 iPS-клеткичеловекаКлеточная линия iPS DU11 (клон #11 Университета Дьюка) была создана в центре ядра iPSC Университета Дьюка и предоставлена нам лабораторией Бурсака в Университете Дьюка. Линия была протестирована и признана свободной от микоплазмы (последнее испытание в ноябре 2021 года) и аномалий кариотипа (июль 2019 года)
Culture medium growth factors and media supplements
0.5M EDTA, pH 8,0Invitrogen15575020
2-меркаптоэтанолThermo/Life Technologies21985023
альбумин из бычьей сыворотки, Texas Red конъюгатThermo/Life TechnologiesA23017
All-trans ретиноевая кислота (500 мг)Stem Cell Technologies72262
B27 бессывороточная добавкаThermo/Life Technologies17504044
добавка B-27 (50 раз) без витамина АThermo/Life Technologies12587010
бычьим сывороточным альбуминомSigma-AldrichA9418
CHIR99021Stemgent04-0004May показать вариации от партии к партии
Полный средний набор с CultureBoost-RCell Systems4Z0-500-RСреда для поддержания подоцитов
DMEM/F12Thermo/Life Technologies12634028
DMEM/F12 с добавкой GlutaMAXThermo/Life Technologies10565042DMEM/F12 с глутамином
Форсколин (активатор аденилатциклазы)Abcamab120058
Добавка GlutaMAXThermo/Life Technologies35050061добавка с глютамином
Термоинактивированный FBSThermo/Life Technologies10082147
раствор гепарина StemCell Technologies7980
Активин человека AThermo/Life TechnologiesPHC9544
Human BMP4Preprotech120-05ET
Human BMP7Thermo/Life TechnologiesPHC9544
человека VEGFThermo/Life TechnologiesPHC9394
Inulin-FITCSigma-AldrichF3272
mTeSR1 средниетехнологии стволовых клеток05850Среды для культивирования iPS-клеток человека (КМК). Добавьте 5x добавку в соответствии с производителем. КМК для иPS человека может храниться до 6 месяцев при температуре -20°С.
N-2 добавка (100x)Thermo/Life Technologies17502048
Нейробазальные средыThermo/Life Technologies21103049Латеральная мезодерма базальная среда
PBS (фосфатно-солевой буфер)Thermo/Life Technologies14190-250
Пенициллин-стрептомицин, жидкий (100x)Thermo/Life Technologies15140-163
ROCK ингибитор (Y27632)Tocris1254
StemPro-34 SFMThermo/Life Technologies10639011среда для культивирования эндотелиальных клеток (CCM). Добавьте добавку в зависимости от производителя. Эндотелиальная КМК может храниться до двух недель при температуре 4 °°; С или -20 °°; C на срок до 6 месяцев.
Ингибитор TGF-Beta (SB431542)Stem Cell Technologies72234
Enzymes and other reagents
AccutaseThermo/Life TechnologiesA1110501Буфер для отделения клеток
Диметилсульфоксид (ДМСО)Sigma-AldrichD2438
Раствор этанола, 70% (об/об.), биотехнологический классVWR97065-058
Параформальдегид (PFA)Thermo/Life Technologies28906
Стерильная дистиллированная водаThermo/Life Technologies15230162
Triton X-100VWR97062-208
Equipment
Trypsin EDTA, 0,05%Thermo/Life Technologies25300-120
(Orb) Модуль ступицыЭмуляцияORB-HM1
100 мм x 15 мм круглая чашкаПетри FisherbrandFB087579B
120 x 120 мм квадратная чашка для клеточной культурыVWR688161
Accuri C6BD Biosciences
Аспирационные пипетки, индивидуально упакованныеCorning29442-462
Аспирационная установкаSP Bel-ArtF19917-0150
Центрифуга Avanti J-15R BeckmanCoulterB99516
Коническая центрифужная трубка, 15 млCorning352097
коническая центрифужная трубка, 50 млCorning352098
EVOS M7000Thermo/Life TechnologiesAMF7000флуоресцентный микроскоп для получения изображений неподвижных и окрашенных Клетки.
ГемоцитометрVWR100503-092
Heracell VIOS 160i CO2 инкубаторThermo/Life Technologies51030403
перевернутый Zeiss Axio Observer оснащен камерой AxioCam 503 CarlZeiss Micrscopy491916-0001-000 (микроскоп) ; 426558-0000-000 (камера)
Kimberly-Clark нитриловые перчаткиVWR40101-346
Kimwipes, большиеVWR21905-049
Leoca SP8 Вертикальный конфокальный микроскоп
ЭмуляцияAK-CCR
прецизионные барьерные наконечники для пипетокDenville ScientificP1096-FR
P100 барьерные наконечники для пипетокDenville ScientificP1125
P1000 барьерные наконечники для пипетокDenville ScientificP1121
P20 барьерные наконечники для пипетокDenville ScientificP1122
P200 барьерные наконечники для пипетокDenville ScientificP1122
Технология Plasma AsherQuorum TechK1050X RFЭтот аппарат плазменного травления/ашера/очистителя использовался в составе Центра общих материалов (SMiF) Университета Дьюка.
Пробирка из полистирола с круглым дном и защелкивающимся колпачком для клеточного фильтраCorning352235
серологическая пипетка, 10 мл, в индивидуальной упаковкеCorning356551
серологическая пипетка, 25 мл, в индивидуальной упаковкеCorning356525
серологическая пипетка, 5 мл, в индивидуальной упаковкеCorning356543
Steriflip, 0,22 и микро; m, PESEMD МиллипоровыеSCGP00525
стерильные микроцентрифужные пробиркиThomas Scientific1138W14
T75cm2 колба для клеточных культур с вентиляционным колпачкомCorning430641U
Обработанные тканевой культурой 12-луночные планшетыCorning353043
Обработанные тканевой культурой 6-луночные планшетыCorning353046
Вакуумный модулятор и перстальтический насос (модуль Zoe Culture)ЭмуляцияZOE-CM1Органный чип
VE-Cadherin CD144 антитело к человеку - конъюгированное APCMiltenyi Biotec130-126-010
Широкоскосекальный клеточный лифтерCorning3008
MACS
CD144 Микрогранулы, человеческиеMiltenyi Biotec130-097-857
CD31 Набор микрошариков, человекMiltenyi Biotec130-091-935
LS колонныMiltenyi Biotec130-042-401
Медиа резервуар (портативный модуль POD)Эмуляция POD-1 Шейкер микропластин VWR 12620-926 Эмуляция чипа органа S-1 Чип держатель органной микросхемы P10 биореактора

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, L., et al. A disease model of diabetic nephropathy in a glomerulus-on-a-chip microdevice. Lab on a Chip. 17 (10), 1749-1760 (2017).
  2. Musah, S., et al. Mature induced-pluripot....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Kidney Glomerulus ChipInduced Pluripotent Stem CellsIsogenic Organ ChipGlomerular Filtration BarrierPodocyte DifferentiationVascular Endothelial CellsMicrofluidic ChipNephrotoxicity TestingPrecision MedicinePatient Specific Disease Modeling

Related Articles