Method Article

Изогенный чип почечного клубочка, разработанный из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток

DOI:

10.3791/63821

⸱

November 4th, 2022

 , 
1Department of Biomedical Engineering, Pratt School of Engineering, Duke University, 2Department of Medicine, Division of Nephrology, Duke University School of Medicine, 3Department of Cell Biology, Duke University, 4Center for Biomolecular and Tissue Engineering, Duke University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь представлен протокол для разработки персонализированной системы «орган на чипе», которая рекапитулирует структуру и функцию клубочкового фильтрационного барьера почек путем интеграции генетически согласованных эпителиальных и сосудистых эндотелиальных клеток, дифференцированных от индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток. Эта биоинженерная система может продвигать прецизионную медицину почек и связанные с ней приложения.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Хроническая болезнь почек (ХБП) поражает 15% взрослого населения США, но создание таргетной терапии было ограничено отсутствием функциональных моделей, которые могут точно предсказать биологические реакции человека и нефротоксичность. Достижения в области прецизионной медицины почек могут помочь преодолеть эти ограничения. Однако ранее установленные in vitro модели клубочка почек человека — первичного участка фильтрации крови и ключевой мишени многих заболеваний и токсичности лекарств — обычно используют гетерогенные клеточные популяции с ограниченными функциональными характеристиками и непревзойденным генетическим фоном. Эти характеристики значительно ограничивают их применение для моделирования конкретных заболеваний пациента и терапевтического открытия.

В этой статье представлен протокол, который интегрирует индуцированный человеком плюрипотентный стволовый (iPS) клеточный клубочковый эпителий (подоциты) и эндотелий сосудов от одного пациента для разработки изогенного и васкуляризированного микрофлюидного чипа почечного клубочка. Полученный чип клубочка состоит из эндотелиальных и эпителиальных клеточных слоев, полученных из стволовых клеток, которые экспрессируют специфические для линии маркеры, продуцируют белки базальной мембраны и образуют интерфейс ткань-ткань, напоминающий клубочковый фильтрационный барьер почки. Спроектированный чип клубочка избирательно фильтрует молекулы и рекапитулирует лекарственное повреждение почек. Способность восстанавливать структуру и функцию почечного клубочка с использованием изогенных типов клеток создает возможность моделировать заболевание почек со специфичностью пациента и продвигать полезность органов на чипах для прецизионной медицины почек и связанных с ней применений.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Устройства «орган на чипе» представляют собой динамические 3D-модели in vitro, которые используют молекулярную и механическую стимуляцию, а также васкуляризацию для формирования ткане-тканевых интерфейсов, которые моделируют структуру и функцию конкретных органов. Ранее установленные устройства «орган на чипе», целью которых было повторение клубочка почки (клубочковые чипы), состояли из клеточных линий животных1 или первичных и увековеченных клеточных линий человека гетерогенных источников 2,3. Использование генетически гетерогенных клеточных источников представляет вариации, которые значительно ограничивают исследования специфических для пациента реакций и генетики или механизмов заболевания 4,5. Решение этой проблемы зависит от наличия изогенных клеточных линий, происходящих от конкретных людей с сохраненными молекулярными и генетическими профилями, чтобы обеспечить более точную микросреду для разработки моделей in vitro 2,3,6. Изогенные клеточные линии человеческого происхождения теперь могут быть легко сгенерированы благодаря достижениям в культуре iPS-клеток человека. Поскольку человеческие iPS-клетки, как правило, неинвазивно получены, могут самообновляться бесконечно и дифференцироваться практически в любой тип клеток, они служат привлекательным источником клеток для создания моделей in vitro, таких как чип клубочка 7,8. Клубочковый фильтрационный барьер является первичным участком для фильтрации крови. Кровь сначала фильтруется через эндотелий сосудов, клубочковую базальную мембрану и, наконец, через специализированный эпителий, называемый подоцитами. Все три компонента фильтрационного барьера способствуют селективной фильтрации молекул. Здесь представлен протокол для создания устройства «орган на чипе», сопряженного с эндотелием сосудов и клубочковым эпителием из одного источника iPS-клеток человека. Хотя этот протокол особенно полезен для разработки изогенного и васкуляризированного чипа для рекапитуляции клубочкового фильтрационного барьера, он также обеспечивает план для разработки других типов персонализированных органов на чипах и мультиорганных платформ, таких как изогенная система «тело на чипе».

Протокол, описанный в настоящем описании, начинается с дивергентной дифференцировки iPS-клеток человека в две отдельные линии - боковые клетки мезодермы и мезодермы, которые впоследствии дифференцируются в эндотелий сосудов и клубочковый эпителий соответственно. Для генерации боковых клеток мезодермы человеческие iPS-клетки были посеяны на пластинах с покрытием 1-слойной базальной мембраны и культивированы в течение 3 дней (без обмена средой) в среде N2B27, дополненной активатором Wnt, CHIR 99021, и мощным индуктором мезодермы, костно-морфогенетическим 4 (BMP4). Полученные боковые клетки мезодермы ранее характеризовались экспрессией брахиуры (Т), смешанного парного гомеобокса (MIXL) и эомезодермина (EOMES)9. Впоследствии боковые клетки мезодермы культивировали в течение 4 дней в среде, дополненной VEGF165 и Forskolin, чтобы индуцировать сосудистые эндотелиальные клетки, которые были отсортированы на основе экспрессии VE-cadherin и / или PECAM-1 с использованием магнитно-активированной сортировки клеток (MACS). Полученные сосудистые эндотелиальные клетки (viEC) расширяли путем культивирования их на колбах с 3-покрытым базальной мембраной матрикс до готовности к посеву в микрофлюидном устройстве.

Для генерации клеток мезодермы человеческие iPS-клетки были посеяны на пластинах с покрытием 2-слойной базальной мембраны и культивированы в течение 2 дней в среде, содержащей активин А и CHIR99021. Полученные клетки мезодермы характеризовались экспрессией HAND1, гусеницы и брачуры (Т), как описано ранее 2,10,11. Чтобы индуцировать дифференцировку клеток промежуточной мезодермы (IM), клетки мезодермы культивировали в течение 14 дней в среде, дополненной BMP-7 и CHIR99021. Полученные IM-клетки экспрессируют опухоль Вильма 1 (WT1), парный бокс-ген 2 (PAX2) и нечетно пропущенный родственный белок 1 (OSR-1)2,10,11.

Двухканальный микрофлюидный чип на основе полидиметилсилоксана (PDMS) был разработан для рекапитуляции структуры клубочкового фильтрационного барьера in vitro. Мочевой канал составляет 1000 мкм x 1000 мкм (Ш х В), а размер капиллярного канала составляет 1000 мкм х 200 мкм (Ш х В). Циклические циклы растяжения и релаксации облегчались полыми камерами, присутствующими с каждой стороны флюидных каналов. Клетки были посеяны на гибкую мембрану PDMS (толщиной 50 мкм), которая разделяет мочевой и капиллярный каналы. Мембрана оснащена гексагональными порами (диаметр 7 мкм, 40 мкм друг от друга), чтобы способствовать межклеточной сигнализации (рисунок 1A)2,12. За два дня до завершения индукции IM микрофлюидные чипы были покрыты базальной мембранной матрицей 2. viEC были посеяны в капиллярный канал микрофлюидного чипа с использованием эндотелиальной поддерживающей среды за 1 день до завершения индукции IM, и чип был перевернут вверх ногами, чтобы обеспечить адгезию клеток на базальной стороне мембраны PDMS, покрытой ECM. В день завершения индукции IM клетки были засеяны в мочевой канал микрофлюидного чипа с использованием среды, дополненной BMP7, активином A, CHIR99021, VEGF165 и всей трансретиноевой кислотой, чтобы индуцировать дифференцировку подоцитов внутри чипа. На следующий день резервуары среды были заполнены средой индукции подоцитов и средой эндотелиального обслуживания, и на микросхемы была нанесена 10% механическая деформация при 0,4 Гц и поток жидкости (60 мкл/ч).

Клеточные микрофлюидные чипы культивировали в течение 5 дополнительных дней с использованием среды индукции подоцитов (в мочевом канале) и эндотелиальной поддерживающей среды (в сосудистом канале). Полученные чипы почечного клубочка культивировали в течение 7 дополнительных дней в поддерживающей среде как для подоцитарных, так и для эндотелиальных клеток. Дифференцированные подоциты положительно экспрессировали специфические для линии белки, включая подоцин и нефрин 13,14, в то время как viECs положительно экспрессировали белки идентификации линии PECAM-1 и VE-Cadherin, все из которых являются необходимыми молекулами для поддержания целостности клубочкового фильтрационного барьера15,16 . Было обнаружено, что подоциты и viEC секретируют наиболее распространенный белок клубочковой базальной мембраны, коллаген IV, который также важен для созревания и функции тканей.

Было обнаружено, что трехкомпонентная система фильтрационного барьера - эндотелий, базальная мембрана и эпителий - в клубочковых чипах избирательно фильтрует молекулы и реагирует на химиотерапевтическое, нефротоксическое лекарственное лечение. Результаты медикаментозного лечения показали, что чип клубочков может быть использован для исследований нефротоксичности и для моделирования заболеваний. Этот протокол обеспечивает общее руководство по разработке функционального микрофлюидного чипа почечного клубочка из иззогенных производных iPS-клеток. Последующий анализ инженерного чипа может быть выполнен по желанию исследователя. Для получения дополнительной информации об использовании чипа клубочка для моделирования клубочкового повреждения, вызванного лекарственными средствами, обратитесь к предыдущим публикациям 2,12.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка растворов базальной мембранной матрицы и покрытых подложек

  1. Оттаивание фундаментальной мембранной матрицы 1 ночью на льду при 4 °C. Аликвота в соответствии с предложением завода-изготовителя в отношении коэффициента разрежения. Используя коническую трубку объемом 50 мл и пипетку, тщательно перемешайте соответствующее количество матрицы базальной мембраны 1 в 25 мл холодного DMEM/F12 до полного размораживания и растворения.
    1. Чтобы растворить замороженную аликвоту, возьмите ~200 мкл из 25 мл холодного DMEM/F12 и перенесите его в замороженную аликвотную трубку. Пипетка вверх и вниз до тех пор, пока матрица не будет тщательно разморожена и растворена. Перенос полного содержания трубчатого матрикса 1 базальной мембраны в остальную часть холодного DMEM/F12.
  2. Пипетка 1 мл раствора матрицы базальной мембраны 1 в каждую скважину из 6-луночной пластины. Чтобы использовать покрытые пластины в тот же день, инкубируйте при 37 °C в течение 2 ч.
    1. Альтернативно, пластины с покрытием могут быть обернуты парапленкой и храниться при 4 °C в течение 2 недель. Когда будет готова к использованию хранящаяся пластина, инкубируют при 37 °C в течение 30 мин.
  3. Разбавляют основную мембранную матрицу 2 в 9 мл стерильной дистиллированной воды для достижения конечной концентрации 5 мкг/мл. Пипетка 700 мкл раствора матрицы 2 базальной мембраны в каждую скважину 12-луночной пластины. Оберните основную мембранную матрицу 2 пластинами с покрытием парапленкой и храните при 4 °C до 2 недель.
  4. Восстанавливают лиофилизированную матрицу базальной мембраны 3 для достижения конечной концентрации 1 мг/мл в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS, Ca+2- и Mg+2-free), как это предлагается производителем. Развести одну аликвоту 250 мкл до конечной концентрации 25 мкг/мл в 9,75 мл PBS (Ca+2 и Mg+2 свободно). Используйте 6 мл этого раствора для покрытия одной колбы T75 (конечная концентрация 2 мкг/см2). Хранить колбы с матричным покрытием при температуре 4 °C до 1 недели.

2. Культура iPS-клеток человека

ПРИМЕЧАНИЕ: Линия DU11, используемая в этом протоколе, была протестирована и оказалась свободной от аномалий микоплазмы и кариотипа.

  1. Инкубировать основную мембранную матрицу пластин с 1-м покрытием при 37°С в течение 1-2 ч.
  2. Промывайте каждую лунку 6-луночной плиты 3x 1 мл теплого (37 °C) DMEM/F12. Добавьте 2 мл питательной среды iPS-клеток человека (CCM) (Дополнительная таблица S1) к каждой лунке 6-луночной пластины. Инкубируйте пластины при 37 °C, пока клетки готовятся к посеву, как описано ниже.
  3. Промывайте каждую лунку 6-луночной пластины, содержащей человеческие iPS-клетки, 1 мл теплого DMEM/F12.
  4. Аспирируйте DMEM/F12. Добавьте 1 мл теплого буфера отслоения клеток к каждой скважине 6-луночной пластины. Инкубировать при 37 °C в течение 1 мин.
  5. Визуально осмотрите каждую лунку под микроскопом на предмет диссоциации вокруг краев клеточной колонии. Осторожно аспирируйте буфер отслоения клеток из клеток. Аккуратно промыть каждую лунку 1 мл теплого DMEM/F12.
  6. Осмотрите пластины под микроскопом, чтобы убедиться, что клетки не полностью отсоединились от пластины или не были случайно аспирированы.
  7. Добавьте 3 мл теплого человеческого iPS CCM в каждую лунку 6-луночной пластины с клетками. Используя клеточный лифтер, аккуратно соскоблите колонии. Используя серологическую пипетку объемом 5 мл, осторожно перемешайте клеточную суспензию в каждой лунке вверх и вниз один раз.
  8. Извлеките из инкубатора новую основную мембранную матрицу с 1-м покрытием. Перенесите 0,5 мл клеточной суспензии в каждую скважину новой пластины матрицы базальной мембраны с 1-покрытием. Переместите пластину в восьмерку, чтобы равномерно распределить ячейки. Инкубировать при 37 °C в 5% CO2 инкубаторе.
  9. Аспирируйте отработанную среду и заменяйте 3 мл человеческого iPS CCM каждый день культивирования до тех пор, пока клетки не станут на 70% сливающимися (примерно через 4 дня после прохождения).

3. Дни 0-16: дифференцировка ИПСК человека в промежуточные клетки мезодермы

  1. Дни 0-2: индукция мезодермы
    1. Перемещайте пластины матрицы базальной мембраны с 2-м покрытием от 4 °C до комнатной температуры в течение 2 ч для уравновешивания после хранения.
    2. Аспирировать отработанную среду из каждой скважины 6-луночной пластины, содержащей примерно 70% сливающихся iPS-клеток человека. Аккуратно промыть ячейки 3x с 1 мл теплого DMEM/F12.
    3. Аспирируйте DMEM/F12. Добавьте 1 мл буфера отслоения клеток к каждой лунке 6-луночной пластины человеческих iPS-клеток. Инкубировать при 37 °C в течение 5-7 мин.
    4. Визуально осмотрите каждую лунку под микроскопом на предмет диссоциации вокруг краев клеточной колонии. Используя клеточный лифтер, аккуратно соскоблите колонии.
    5. Перенесите клеточные суспензии из всех колодцев 6-луночной пластины в коническую трубку объемом 15 мл и используйте P1000 для пипетки вверх и вниз несколько раз, чтобы получить одноэлементную суспензию iPS-клеток.
    6. Наполните клеточную суспензию в конической трубке до 14 мл DMEM/F12. Центрифуга в течение 5 мин при 200 × г при комнатной температуре.
    7. Аспирировать супернатанта. Повторно суспендировать ячейку гранулы в 14 мл теплого DMEM/F12. Центрифугирование повторяют в течение 5 мин при 200 × г при комнатной температуре.
    8. Аспирировать супернатанта. Повторное суспендирование клеток в 1 мл мезодермной индукционной среды (Дополнительная таблица S1). Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Разбавляют в индукционной среде Мезодермы для достижения конечной концентрации 1 × 105 клеток/мл.
    9. Аспирировать покрытие из основы мембраны матрицы 2 с покрытием пластины. Промыть каждую лунку базальной мембранной матрицей 2-слойной пластины 2x с 1 мл теплого DMEM/F12.
    10. Аккуратно пипеткой суспензию ячейки вверх и вниз в 2 раза. Переложить 1 мл клеточной суспензии на каждую лунку фундаментальной мембраны матрицы с 2-м покрытием пластины. Осторожно переместите пластину в восьмерке, чтобы равномерно распределить ячейки.
    11. Инкубируйте пластину при температуре 37 °C в течение ночи. На следующий день (день 1) аспирировать отработанную среду из каждой скважины 12-луночной плиты. Заменить 1 мл теплой индукционной среды Мезодермы. Инкубировать при 37 °C в течение ночи.
  2. Дни 2-16: промежуточная индукция мезодермы
    1. Аспирируйте отработанную мезодермную индукционную среду. Заменить 1 м л теплой промежуточной мезодермной индукционной среды (Дополнительная таблица S1). Аспирировать отработанную среду и заменять 1 мл теплой промежуточной мезодермной индукционной среды каждый день в течение 14 дней.

4. Дни 0-15: дифференцировка и расширение ИПСК человека в эндотелиальные клетки сосудов

  1. День 0: посев iPS-клеток человека
    1. Приготовьте 15 мл человеческого iPS CCM с ингибитором ROCK (Дополнительная таблица S1). Держите в тепле при 37 °C.
    2. Инкубируют одну основную мембранную матрицу с 1-покрытием пластины в течение 1-2 ч при 37 °C. Аспирировать матрицу базальной мембраны 1. Промыть 3x с 1 мл теплого DMEM/F12.
    3. Аспирируйте DMEM/F12. Добавьте 2 мл человеческого iPS CCM с ингибитором ROCK к каждой лунке 6-луночной пластины. Инкубируйте пластины при 37 °C, пока клетки готовятся к посеву, как описано ниже.
    4. Аспирировать отработанную среду из каждой скважины 6-луночной пластины, содержащей примерно 70% сливающихся iPS-клеток человека. Аккуратно промыть ячейки 3x с 1 мл теплого DMEM/F12.
    5. Аспирируйте DMEM/F12. Добавьте 1 мл буфера отслоения клеток к каждой лунке 6-луночной пластины человеческих iPS-клеток. Инкубируют при 37 °C в течение 5-7 мин, чтобы диссоциировать клетки на отдельные клетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за присущих различий между клеточными линиями iPS пользователю необходимо будет визуально осмотреть клетки через 5 минут, чтобы определить оптимальное время инкубации.
    6. Переведите клетки в коническую трубку объемом 15 мл. Доведите клеточную суспензию до 14 мл с теплым DMEM/F12, чтобы нейтрализовать буфер отсоединения. Центрифуга в течение 5 мин при 200× г при комнатной температуре.
    7. Осторожно аспирировать супернатант. Повторное суспендирование клеток в 1 мл человеческого iPS CCM с ингибитором ROCK. Подсчитайте общее количество клеток с помощью гемоцитометра.
    8. Засейте клетки от 37 000 до 47 000 клеток /см2 (от 355 200 до 451 200 клеток / лунка 6-луночной пластины). Инкубировать при 37 °C в течение ночи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за присущих различий между линиями ячеек iPS пользователю необходимо будет определить оптимальную плотность посева.
  2. Дни 1-3: латеральная индукция мезодермы
    1. На следующий день (день 1) аспирировать отработанную среду из каждой лунки 6-луночной пластины iPS-клеток человека. Замените каждую скважину 6-луночной плиты 5 мл латеральной мезодермной индукционной среды (Дополнительная таблица S1). При масштабировании сосуда для культивирования (например, колб), как правило, заменяют в 3 раза больший рабочий объем в сосуде для культивирования.
    2. Не меняйте эту среду в течение 3 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Боковая индукционная среда мезодермы в скважинах обычно меняет цвет с красного на желтый, поскольку клетки используют питательные вещества. Однако мутная среда или среда с ростом бактерий не является нормальной и должна быть обеззаражена и выброшена как таковая.
  3. Дни 4-6: индукция эндотелиальных клеток
    1. Аспирируйте отработанную среду из каждой скважины 6-луночной плиты. Замените каждую лунку 6-луночной плиты 3 мл теплой эндотелиальной индукционной среды (Дополнительная таблица S1). Инкубируйте пластину при температуре 37 °C в течение ночи.
    2. В течение следующих 2 дней (дни 5 и 6) соберите отработанную среду из всех скважин в коническую трубку объемом 50 мл. Храните коническую трубку при температуре 4 °C. Пополняйте клетки 3 мл теплой эндотелиальной индукционной среды. Инкубировать пластину при 37 °C.
  4. День 7: сортировка эндотелиальных клеток (viEC)
    1. Вынимаем основную мембранную матрицу 3 колбы и оставляем при комнатной температуре на 1 ч.
    2. Подготовьте 50 мл буфера MACS (Дополнительная таблица S1).
    3. Поместите буфер отслоения клеток, буфер MACS, эндотелиальный CCM и PBS (Ca2+ и Mg2+ свободный) на льду в тканевом культуральном капюшоне.
    4. Поместите магнит на подставку MACS. Поместите две конические трубки по 50 мл и одну коническую трубку объемом 15 мл в держатель конической трубки.
    5. Поместите подставку MACS (с прикрепленным магнитом) и одну колонку LS в вытяжку для культивирования тканей. Установите держатель конической трубки (с коническими трубками внутри) на подставке MACS, под магнитом (дополнительный рисунок S1A).
    6. Соберите отработанную среду из каждой скважины 6-луночной плиты в коническую трубу объемом 50 мл со стадии 4.3.2. Промыть каждую лунку 6-луночной пластины PBS (Ca2+ и Mg2+ свободно).
    7. Аспирировать PBS. Добавьте 1 мл буфера отсоединения клеток. Инкубируют при 37 °C в течение 5-7 мин, чтобы полностью диссоциировать клетки.
    8. Переведите клетки в коническую трубку объемом 50 мл. Доведите клеточную суспензию до 15 мл с холодным эндотелиальным СКК. Центрифуга при 200 × г в течение 5 мин при комнатной температуре.
    9. Аспирировать супернатанта. Повторное суспендирование клеток в 1 мл холодного буфера MACS. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.
    10. Добавьте 10 мл буфера MACS в суспензию ячейки. Центрифуга в течение 5 мин при 200 × г при комнатной температуре.
    11. Аспирировать супернатанта. Повторное суспендирование клеток в 80 мкл буфера MACS на 10 миллионов клеток. Добавьте 20 мкл на 10 миллионов клеток блокирующего реагента FcR, микрошариков CD31 и микрошариков CD144. Инкубировать в течение 15 мин на льду.
    12. Пока клеточная суспензия инкубируется, центрифугируют среду, собранную из эндотелиальной индукции (стадия 4.3.2), при 200 × г в течение 10 мин.
    13. Соберите супернатант в вакуумный фильтр объемом 500 мл 0,22 мкм. Готовят эндотелиальную кондиционированную среду (дополнительная таблица S1). Отфильтруйте среду в стерильных условиях и держите среду теплой при 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость пролиферации эндотелиальных клеток начнет уменьшаться после прохождения 3. Для достижения экспоненциального роста после пассажа 3 эндотелиальная кондиционированная и поддерживающая среда может быть дополнена ингибитором TGF-Beta (SB431542) 10 мкМ, начиная с пассажа 1.
    14. После 15-минутной инкубации на стадии 4.4.11 добавьте 10 мл буфера MACS на 10 миллионов клеток (максимум 30 мл буфера MACS) к клеточной суспензии. Центрифуга по 200 × г в течение 5 мин.
    15. Аспирировать супернатанта. Повторное суспендирование в 1 мл буфера MACS.
    16. Возьмите колонну LS и вытащите поршень из шприца. Поместите плунжер обратно в пластиковую втулку. Поместите колонку на магнит.
    17. Поместите первую коническую трубку объемом 50 мл под колонну. Добавьте в столбец 1 мл буфера MACS. Соберите в коническую трубку объемом 50 мл под ней.
    18. Дайте жидкости течь, хотя и не полностью, чтобы предотвратить высыхание колонны. Когда капли жидкости начнут медленно струиться, добавьте клеточную суспензию в колонку. Соберите проточную трубу в ту же коническую трубку объемом 50 мл.
    19. Когда капли жидкости начнут медленно просачиваться, поместите под колонну следующую коническую трубку объемом 50 мл. Добавьте в столбец начальное прохождение (шаг 4.4.18). Соберите в коническую трубку объемом 50 мл под ней.
    20. Когда капли жидкости начнут медленно просачиваться, добавьте 500 мкл буфера MACS 3x для промывки колонны.
    21. Снимите колонку с магнита. Поместите колонну на коническую трубку объемом 15 мл. Добавьте в столбец 1 мл холодной PBS.
    22. Чтобы собрать клетки, возьмите поршень из пластикового рукава и плотно протолкните его в колонну.
    23. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Доведите клеточную суспензию до 5 мл с PBS. Центрифуга в течение 5 мин при 200 × г.
    24. Пока клетки подвергаются центрифугированию, промывайте основную мембранную матрицу с 3-покрытым колбой 3x с 5 мл PBS для подготовки к посеву клеток. Аспирировать PBS и добавить 20 мл эндотелиальной кондиционированной среды в основную мембранную матрицу с 3-покрытым колбой.
    25. Извлеките клетки из центрифуги и аспирируйте супернатант. Повторное суспендирование клеток в эндотелиальной кондиционированной среде для посева в 26 000 клеток /см2 (1,95 × 106 клеток / колба T75). Засейте клетки.
    26. Чтобы рассчитать эффективность сортировки и выход ячеек, разделите количество ячеек из шага 4.4.23 на количество ячеек из шага 4.4.9.
  5. Дни 8-15: расширение ВЭС
    1. На следующий день (8 день) аспирировать отработанную среду из колбы. Заменить 10 мл эндотелиальной кондиционированной среды. Заменяйте эндотелиальную кондиционированную среду через день до тех пор, пока колба не станет на 90% сливающейся или пока флакон с эндотелиальным кондиционированным носителем не будет полностью использован.
    2. Аспирировать отработанную среду и заменять 10 мл эндотелиальной поддерживающей среды (Дополнительная таблица S1) через день для продолжения расширения.
    3. Для прохождения виЭК подготовьте две базальные мембранные матричные 3-покрытые Т75 колбы. Оставьте колбы комнатной температуры на 1 ч. Тщательно вымойте свежеприготовленные колбы 3x с 5 мл PBS.
    4. Аспирировать PBS. Добавьте 10 мл теплой эндотелиальной поддерживающей среды к каждой свежеприготовленной колбе. Инкубируйте пластины при 37 °C, пока клетки готовятся к посеву, как описано ниже.
    5. Добавьте 5 мл буфера отсоединения клеток в 90% сливающуюся колбу T75 с виЭК. Инкубировать при 37 °C в течение 5-7 мин. Переведите клетки в коническую трубку объемом 15 мл. Добавьте 5 мл теплого DMEM/F12. Центрифуга по 200 × г в течение 5 мин.
    6. Аспирировать супернатанта. Повторное суспендирование в 1 мл теплой эндотелиальной поддерживающей среды. Добавьте 500 мкл клеточной суспензии в каждую из свежеприготовленных колб T75.
    7. На следующий день аспирируйте отработанную среду. Заменить 10 мл эндотелиальной поддерживающей среды. Аспирировать отработанную среду и заменять 10 мл эндотелиальной поддерживающей среды через день до тех пор, пока колба не станет на 90% сливающейся.

5. День 14: Подготовка микрофлюидных чиповых устройств органов для клеточной культуры

  1. Плазменная обработка и покрытие матрицы базальной мембраны 2
    1. Готовят раствор основыальной мембранной матрицы 2 (этап 1.3). Отложите его в сторону.
    2. В вытяжке для культивирования стерильных тканей распакуйте стерильную чашку Петри размером 100 мм х 15 мм. Поместите чашку Петри сверху вниз под дно чашки Петри (дополнительный рисунок S1B).
    3. С помощью пинцета выньте микрофлюидные чипсы из упаковки и поместите их внутрь чашки Петри. Закройте чашку Петри крышкой из-под чашки.
    4. На плазменном ашере поместите крышку чашки Петри под чашку, сверху вниз, удерживая их вместе, как единое целое. Поместите блок чашки Петри в камеру плазменного ашера. Запустите плазменный ашер с кислородом при 100 Вт, 15 SCCM, 30 с.
    5. Чувствительность ко времени: Как только лечение будет завершено, выньте чашку Петри из плазменной ашера. Быстро и слегка протрите крышку чашки Петри 70% этанолом, распыленным на лабораторную салфетку. Накройте чашку Петри крышкой.
    6. Поднесите чашку Петри к вытяжке для культивирования стерильных тканей. Осторожно добавляют 25 мкл раствора основы мембранной матрицы 2 в мочевой (верхний) канал чипа. Добавьте 20 мкл раствора матрицы 2 базальной мембраны в капиллярный (нижний) канал чипа.
    7. Возьмите два стерильных 15 мл конических колпачков и заполните их стерильной дистиллированной водой (~ 500 мкл). Поместите колпачок в чашку Петри, чтобы предотвратить высыхание каналов стружки и мембраны. Поставьте крышку на блюдо. Инкубировать при 37 °C в течение ночи.

6. Посев виЭК и промежуточных клеток мезодермы в микрофлюидные устройства

  1. День 15: ViEC
    1. Аспирировать среду из Т75-колб, содержащих 90% сливающихся виЭК. Добавляют 5 мл буфера отслоения клеток и инкубируют при 37 °C в течение 5-7 мин.
    2. Переведите клетки в коническую трубку объемом 15 мл. Добавить 5 мл DMEM/F12. Центрифуга по 200 × г в течение 5 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая колба T75 с приблизительно 90% сливающихся viEC даст ~ 3 миллиона клеток.
    3. Аспирировать супернатанта. Повторно суспендируют клетки в 300 мкл эндотелиальной поддерживающей среды для получения примерно 2 миллионов клеток / 300 мкл. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Отложите суспензию ячейки в сторону.
    4. Перенесите чашку Петри, содержащую микрофлюидные чипсы, на вытяжку для культивирования тканей. Прикрепите защитный наконечник P200 к наконечнику аспиратора.
    5. Промывайте верхний и нижний каналы микрофлюидного чипа 200 мкл DMEM/F12, одновременно аспирируя периферию розетки.
    6. Крепко держите стружку с помощью барьерного наконечника P200, прикрепленного к аспиратору, вдали от выходного отверстия нижнего канала. Плотно вводят 20 мкл суспензии viEC с приблизительно 134 000 клеток в капиллярный (нижний) канал чипа. Осторожно аспирировать среду с периферии выхода.
    7. Проверьте под микроскопом наличие пузырьков или неравномерной плотности посева viEC.
    8. Осторожно переверните чип, чтобы перевернуть его, чтобы viEC могли прилипать к базальной стороне гибкой мембраны PDMS. Поместите чип в картридж держателя. Добавьте 3 мл PBS в картридж держателя чипа, чтобы предотвратить высыхание мембраны. Инкубируйте чип при 37 °C в течение 3 ч.
    9. Проверьте нижний канал под микроскопом на наличие сливающегося слоя виЭК, прикрепленного к гибкой мембране PDMS. Опустите 200 мкл эндотелиальной поддерживающей среды на входное отверстие нижнего канала и дайте ей течь по каналу, чтобы промыть канал неприкрепленных эндотелиальных клеток, осторожно аспирируя с периферии капиллярного (нижнего) канала выходного отверстия.
    10. Замените чип обратно в картридж держателя. Инкубировать при 37 °C в течение ночи.
  2. День 16: промежуточные клетки мезодермы (IM)
    1. Осторожно промывайте капиллярный (нижний) канал 200 мкл эндотелиальной поддерживающей среды, тщательно аспирируя периферию выходного отверстия.
    2. Промывайте мочевой (верхний) канал 200 мкл DMEM/F12, тщательно аспирируя периферию выхода. Поместите ~50 мкл DMEM/F12 на входной и выходной порты.
    3. Аспирировать промежуточную мезодермную индукционную среду из каждой скважины 12-луночной плиты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая лунка в конце дифференцировки дает приблизительно 1,5 миллиона IM клеток.
    4. Добавьте 1 мл трипсина-ЭДТА в каждую лунку 12-луночной плиты и инкубируйте при 37 °C в течение 5 мин.
    5. Аккуратно соскребите клетки с помощью подъемника клеток, а также пипетку вверх и вниз, чтобы диссоциировать клетки с помощью P1000. Добавьте 2 мл раствора для нейтрализации трипсина (дополнительная таблица S1) в каждую лунку. Переведите клетки в коническую трубку объемом 50 мл. Доведите объем клеточной суспензии до 50 мл с ПОМОЩЬЮ DMEM/F12 и центрифуги при 200 × г в течение 5 мин.
    6. Аспирировать супернатанта. Повторно суспендируют клетки в 500 мкл промежуточной мезодермной индукционной среды для получения примерно 3 миллионов клеток на 500 мкл. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.
    7. Крепко держите чип с помощью барьерного наконечника P200, прикрепленного к аспиратору, вдали от выходного отверстия мочевого (верхнего) канала. Плотно вводят 25 мкл клеточной суспензии с приблизительно 112 500 IM клетками в мочевой (верхний) канал чипа и осторожно аспирируют среду с периферии выхода.
    8. Проверьте под микроскопом наличие пузырьков или неравномерной плотности посева IM-клеток. Добавьте 3 мл PBS в картридж держателя чипа. Инкубировать при 37 °C в течение 3 ч.
    9. Промывайте оба канала 200 мкл соответствующей клеточной культуральной среды, тщательно аспирируя периферию выходов чипа, чтобы предотвратить обратный поток отработанной среды и клеточного мусора.
    10. Прикрепите пустые барьерные наконечники P200 в оба выхода мочевого и капиллярного каналов. Пипетка 200 мкл эндотелиальной поддерживающей среды и вводят половину ее во входное отверстие капиллярного канала. Отпустите наконечник пипетки внутрь входного отверстия таким образом, чтобы и входное, и выходное отверстие канала теперь были прикреплены к наконечникам пипетки, заполненным средой.
    11. Пипетка 200 мкл поддерживающей среды IM и вводят половину во входной канал мочевыводящих путей. Отпустите наконечник пипетки внутрь входного отверстия таким образом, чтобы и входное, и выходное отверстие канала теперь были прикреплены к наконечникам пипетки, заполненным средой. Инкубируйте чипы с помощью наконечников, встроенных при температуре 37 °C в течение ночи.
  3. Подключите чипы к биореактору Organ Chip для применения потока жидкости и механического напряжения.
    1. Удалите кончики P200 из мочевыводящих и капиллярных каналов. Добавьте капли соответствующих сред на вход и выход мочевого и капиллярного каналов, чтобы предотвратить высыхание.
    2. Добавьте 3 мл теплой среды индукции подоцитов (дополнительная таблица S1) во входной резервуар для мочевыводящих путей. Добавьте 3 мл теплой эндотелиальной поддерживающей среды в резервуар капиллярного входа.
    3. Добавьте 300 мкл теплой среды индукции подоцитов в выходной резервуар мочевого канала непосредственно над выходным отверстием. Добавьте 300 мкл теплой эндотелиальной поддерживающей среды в выходной резервуар капиллярного канала непосредственно над выходным отверстием.
    4. Поместите капсулы на лоток и в биореактор Organ Chip.
    5. Используйте поворотный циферблат на биореакторе органного чипа, чтобы выбрать и начать основной цикл (2 мин). Визуально осмотрите нижнюю сторону капсулы на наличие мелких капель во всех четырех жидкостных портах.
    6. Чтобы обеспечить контакт жидкости и жидкости между нижней стороной Pod и микрофлюидными портами чипа, осторожно вставьте держатель микросхемы в модуль. Осторожно нажмите на выступ держателя чипа внутрь и вверх. Аспирируйте избыточную среду с поверхности чипа.
    7. Установите скорость потока биореактора чипа органа на уровне 60 мкл/ч. Установите циклическую деформацию на 10% при 0,4 Гц. Используйте поворотный циферблат на биореакторе Organ Chip, чтобы выбрать цикл регулирования и работать в течение 2 часов.
    8. Визуально осмотрите выпускные резервуары на предмет повышения уровня среды.
    9. Используйте поворотный циферблат на биореакторе Organ Chip для выбора цикла регулирования.

7. Дни 17-21 и далее: индукция подоцитов и поддержание чипа

  1. Аспирируйте среду из выходных резервуаров мочевого канала по диагонали от порта, но держите некоторую среду в резервуаре каждый день культуры. Пополняйте входной резервуар мочевого канала до 3 мл среды индукции подоцитов каждые 2 дня в течение 5 дней.
    1. Через 5 дней аспирируйте среду из мочевого канала, но держите некоторую среду в резервуаре. Ежедневно пополняйте резервуар входного отверстия мочевого канала 3 мл поддерживающей среды подоцитов.
  2. Аспирируйте среду из выходных резервуаров капиллярного канала по диагонали от порта, но держите некоторую среду в резервуаре каждый день культуры. Ежедневно пополняйте резервуар на входе капиллярного канала до 3 мл эндотелиальной поддерживающей среды.

8. Функциональный анализ и иммунофлуоресцентная визуализация

ПРИМЕЧАНИЕ: См. Дополнительный файл 1 для получения подробной информации об анализе проточной цитометрии, ИФА для сточных вод чипа и выделении мРНК.

  1. Функциональный анализ (молекулярная фильтрация) с использованием инулина и альбумина
    1. Аспирируйте среду из капиллярного канала выходного резервуара по диагонали от порта, но держите некоторую среду в резервуаре. Заменить 3 мл эндотелиальной поддерживающей среды, дополненной инулином и альбумином (Дополнительная таблица S1) в течение 6 ч.
    2. Используя серологическую пипетку 5 мл, измерьте объем (в мл) среды из мочевого канала и переведите в коническую трубку объемом 15 мл. Оберните трубку в алюминиевую фольгу для защиты от света и минимизации фотоотбеливания флуорофорно-конъюгированного инулина и альбумина. Пополняйте резервуар 3 мл поддерживающей среды подоцитов.
    3. Приготовьте запасной раствор инулина в поддерживающей среде подоцитов. Начиная с 25 мкг/мл инулина, готовят восемь стандартов инулина путем 2-кратного последовательного разведения в поддерживающей среде подоцитов.
    4. Аналогично готовят запасной раствор альбумина в поддерживающей среде подоцитов. Начиная со 150 мкг/мл альбумина, готовят восемь стандартов альбумина путем 2-кратного последовательного разведения в поддерживающей среде подоцитов.
    5. Пипетка в дублировании 100 мкл каждой стандартной концентрации инулина в каждую скважину черной 96-луночной пластины (или 16 общих скважин инулина). Пипетка в дублировании 100 мкл каждой стандартной концентрации альбумина в каждую скважину той же 96-луночной пластины (всего 16 лунок альбумина). Пипетка в дублирующей 100-мкл среде поддержания подоцитов служит заготовкой (или двумя общими лунками поддерживающей среды подоцитов).
    6. Пипетка в дублировании 100 мкл сточных вод из мочевого канала в каждую лунку той же 96-луночной пластины. Пипетка в дубликате 100 мкл сточных вод из капиллярного канала.
    7. Вставьте пластину в считыватель пластин и измерьте флуоресценцию альбумина при возбуждении 550 нм и излучении 615 нм. Измерьте одну и ту же пластину для инулина при возбуждении 513 нм и излучении 577 нм.
    8. На основе сгенерированных данных усредните дубликаты измерений (на чип). Вычтите пустое значение, соответствующее показаниям этой пластины, из остальных данных на листе.
    9. Построение значений, соответствующих стандартам альбумина, для создания стандартной кривой с концентрацией [мкг/мл] на оси x и флуоресценцией на оси Y. Построение значений, соответствующих эталонам инулина, для создания стандартной кривой с концентрацией [мкг/мл] на оси x и флуоресценцией на оси Y.
    10. Используйте пакет программного обеспечения для статистического анализа и линейную интерполяцию для определения концентрации инулина и альбумина в моче, соответственно, в сточной среде из чипов.
    11. Определите мочевой клиренс инулина/альбумина из чипов с помощью уравнения (1)2:
      Мочевой клиренс = ([U] × УФ) / [P] (1)
      Где [U] - концентрация в моче со стадии 8.1.10, UV - объем собранных стоков мочевого канала со стадии 8.1.2, а [P] - капиллярная концентрация инулина или альбумина (10 мкг/мл инулина или 100 мкг/мл альбумина).
  2. Иммунофлуоресцентная визуализация
    1. Введите пустой наконечник P200 в выходные отверстия мочевого и капиллярного каналов. Чтобы зафиксировать клетки, пипетку 200 мкл 4% формальдегида и вводят половину его в нижний канал на входе. Отпустите наконечник пипетки внутрь входного отверстия.
    2. Пипетка 200 мкл 4% формальдегида и вводит половину его в мочевой канал на входе. Отпустите наконечник пипетки внутри входного отверстия таким образом, чтобы и входное, и выходное отверстие канала теперь были прикреплены к наконечникам пипетки, заполненным фиксатором.
    3. Инкубировать чипсы при комнатной температуре в течение 20 мин.
    4. Через 20 минут выбросьте все наконечники пипеток. Вводите чистые, пустые наконечники P200 в выходные отверстия мочевого и капиллярного каналов. Для проникновения в клетки пипетку 200 мкл 0,125% Тритона X-100/PBS и вводят половину ее во входное отверстие капиллярного канала. Отпустите наконечник пипетки внутрь входного отверстия.
    5. Пипетка 200 мкл 0,125% тритона X-100/PBS и вводит половину его во входной канал мочевыводящих путей. Отпустите наконечник пипетки внутрь входного отверстия. Инкубировать чип при комнатной температуре в течение 5 мин.
    6. Выбросьте все наконечники пипеток. Вводите чистые, пустые наконечники P200 в выходные отверстия мочевого и капиллярного каналов. Чтобы блокировать клетки, пипетку 200 мкл 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в 0,125% Triton X-100/PBS и вводят половину его во входной капиллярный канал. Отпустите наконечник пипетки внутрь входного отверстия.
    7. Пипетка 200 мкл 1% BSA в 0,125% Triton X-100/PBS и вводит половину его во входной канал мочевыводящих путей. Отпустите наконечник пипетки внутрь входного отверстия. Инкубировать при комнатной температуре в течение 30 мин.
    8. Выбросьте все наконечники пипеток. Промывайте оба канала 3x путем пипетки 200 мкл 0,125% Triton X-100/PBS в каждый канал и инкубации при комнатной температуре в течение 5 мин.
    9. Готовят 100 мкл первичного антитела на канал с рекомендуемым производителем разведением в 0,125% Triton X-100/PBS. Вводите чистые, пустые наконечники P200 в выходные отверстия мочевого и капиллярного каналов. Пипетка 100 мкл первичного антитела и вводит половину в соответствующие каналы. Отпустите наконечник пипетки внутрь входного отверстия.
    10. Инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре или, для лучшего результата, на ночь при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько первичных антител могут применяться одновременно; однако раствор первичного антитела должен быть разбавлен в соответствии с инструкциями производителя.
    11. Промывайте каналы 3 x 10 мин, как описано в шаге 8.2.8.
    12. Готовят 100 мкл вторичного антитела на канал с рекомендуемым производителем коэффициентом разбавления в 0,125% Triton X-100/PBS. Вводите чистые, пустые наконечники P200 в выходные отверстия мочевого и капиллярного каналов. Пипетка 100 мкл вторичного антитела и вводит половину в соответствующие каналы. Отпустите наконечники пипетки внутри входного отверстия. Инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждое вторичное антитело должно применяться отдельно. Промывайте не менее 3 х 10 минут между каждым нанесением в соответствии с этапом 8.2.8.
    13. Промывайте каналы 3 x 10 мин, как описано в шаге 8.2.8.
    14. Промывайте оба канала один раз 200 мкл дистиллированной воды, аспирируя остаточную жидкость с периферии выходных отверстий чипа.
    15. Вводите чистый, пустой P200 в выходные отверстия мочевого и капиллярного каналов. Для контрокрашения клеток пипетку 200 мкл 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI, разведение 1:1000 в дистиллированной воде) и вводят половину ее во входной капиллярный канал. Отпустите наконечник пипетки внутрь входного отверстия, а пипетку 200 мкл DAPI и введите половину ее во входное отверстие мочевого канала. Отпустите наконечник пипетки внутрь входного отверстия и инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 минут.
    16. Выбросьте все наконечники пипеток. Вводите чистые, пустые наконечники P200 в выходные отверстия мочевого и капиллярного каналов. Чтобы контрокрашить клетки, пипетку 200 мкл фаллоидина (разведение 1:1000 в PBS без Ca2+ и Mg2+) и вводят половину ее во входное отверстие капиллярного канала и освобождают наконечник пипетки внутри входного отверстия. Пипетка 200 мкл фаллоидина (разведение 1:1000 в PBS без Ca2+ и Mg2+) и вводят половину его во входное отверстие мочевого канала и освобождают кончик пипетки внутри входного отверстия. Инкубировать при комнатной температуре в течение 15 мин.
    17. Промывайте каналы 3x 200 мкл PBS без Ca2+ и Mg2+ и аспирируйте избыточную жидкость с периферии выходных портов.
    18. Визуализируйте чипы.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы показываем, что функциональная 3D-модель клубочка in vitro может быть васкуляризирована и эпителизирована из изогенного источника человеческих iPS-клеток. В частности, этот протокол предоставляет инструкции о том, как применять технологию iPS-клеток человека, в частности, их способность дифференцироваться в специализированные типы клеток, генерировать почечный клубочковый эпителий (подоциты) и сосудистый эндотелий (viECs), которые могут быть интегрированы с микрофлюидными устройствами для моделирования ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом отчете мы описываем протокол для получения эндотелия сосудов и клубочкового эпителия (подоцитов) из изогенной клеточной линии iPS человека и использование этих клеток для разработки 3D-системы «орган на чипе», которая имитирует структуру, интерфейс ткани-ткань и молекулярную фильтрационную функцию почечного клубочка. Этот клубочковый чип оснащен эндотелием и клубочковым эпителием, которые вместе обеспечивают барьер для селективной фильтрации молекул.

Исследователи, заинтересованные в а...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

С.М. является изобретателем патента, связанного с дифференцировкой подоцитов из iPS-клеток человека. Другому автору нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Инженерной школой Пратта в Университете Дьюка, Отделом нефрологии в Департаменте медицины Дьюка, стипендией Уайтхеда в области биомедицинских исследований и премией Genentech Research Award для С. Мусы. Ю. Рой является стипендиатом Университета Дьюка-Альфреда. Слоуна и стипендии Уильяма М. «Монти» Райхерта с факультета биомедицинской инженерии Университета Дьюка. Клеточная линия iPS DU11 (клон #11 Университета Дьюка) была сгенерирована на объекте Duke iPSC Core Facility и предоставлена нам лабораторией Bursac в Университете Дьюка. Авторы благодарят Н. Абуталеба, Дж. Холмса, Р. Бхаттачарью и Ю. Чжоу за техническую помощь и полезные обсуждения. Авторы также хотели бы поблагодарить членов лаборатории Мусах за полезные комментарии к рукописи. Авторы благодарят лабораторию Segura за подарок проточного цитометра Acuri C6.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<сильные>антитела
Alexa Fluor 488- и Alexa Fluor 594-конъюгированные вторичные антителаThermo/Life TechnologiesA32744; А32754; А-11076; А32790; А21203; A11015
Коллаген IVThermo/Life Technologies14-9871-82
НефринПрогенGP-N2
PECAM-1R& D SystemsAF806
PodocinAbcamab50339
VE-CadherinSanta Cruzsc-9989
Матрицы базальной мембраны
Corning Fibronectin, HumanCorning356008Basement membrane (3)
iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) фрагментIwai Северная АмерикаN8922012Матрица базальной мембраны (2)
Матрица с квалификацией Matrigel hESC, флакон объемом 5 млBD Biosciences354277матрица базальной мембраны (1); может демонстрировать вариацию от партии к партии
<сильно>Клетки
DU11 iPS-клеткичеловекаКлеточная линия iPS DU11 (клон #11 Университета Дьюка) была создана в центре ядра iPSC Университета Дьюка и предоставлена нам лабораторией Бурсака в Университете Дьюка. Линия была протестирована и признана свободной от микоплазмы (последнее испытание в ноябре 2021 года) и аномалий кариотипа (июль 2019 года)
Culture medium growth factors and media supplements
0.5M EDTA, pH 8,0Invitrogen15575020
2-меркаптоэтанолThermo/Life Technologies21985023
альбумин из бычьей сыворотки, Texas Red конъюгатThermo/Life TechnologiesA23017
All-trans ретиноевая кислота (500 мг)Stem Cell Technologies72262
B27 бессывороточная добавкаThermo/Life Technologies17504044
добавка B-27 (50 раз) без витамина АThermo/Life Technologies12587010
бычьим сывороточным альбуминомSigma-AldrichA9418
CHIR99021Stemgent04-0004May показать вариации от партии к партии
Полный средний набор с CultureBoost-RCell Systems4Z0-500-RСреда для поддержания подоцитов
DMEM/F12Thermo/Life Technologies12634028
DMEM/F12 с добавкой GlutaMAXThermo/Life Technologies10565042DMEM/F12 с глутамином
Форсколин (активатор аденилатциклазы)Abcamab120058
Добавка GlutaMAXThermo/Life Technologies35050061добавка с глютамином
Термоинактивированный FBSThermo/Life Technologies10082147
раствор гепарина StemCell Technologies7980
Активин человека AThermo/Life TechnologiesPHC9544
Human BMP4Preprotech120-05ET
Human BMP7Thermo/Life TechnologiesPHC9544
человека VEGFThermo/Life TechnologiesPHC9394
Inulin-FITCSigma-AldrichF3272
mTeSR1 средниетехнологии стволовых клеток05850Среды для культивирования iPS-клеток человека (КМК). Добавьте 5x добавку в соответствии с производителем. КМК для иPS человека может храниться до 6 месяцев при температуре -20°С.
N-2 добавка (100x)Thermo/Life Technologies17502048
Нейробазальные средыThermo/Life Technologies21103049Латеральная мезодерма базальная среда
PBS (фосфатно-солевой буфер)Thermo/Life Technologies14190-250
Пенициллин-стрептомицин, жидкий (100x)Thermo/Life Technologies15140-163
ROCK ингибитор (Y27632)Tocris1254
StemPro-34 SFMThermo/Life Technologies10639011среда для культивирования эндотелиальных клеток (CCM). Добавьте добавку в зависимости от производителя. Эндотелиальная КМК может храниться до двух недель при температуре 4 °°; С или -20 °°; C на срок до 6 месяцев.
Ингибитор TGF-Beta (SB431542)Stem Cell Technologies72234
Enzymes and other reagents
AccutaseThermo/Life TechnologiesA1110501Буфер для отделения клеток
Диметилсульфоксид (ДМСО)Sigma-AldrichD2438
Раствор этанола, 70% (об/об.), биотехнологический классVWR97065-058
Параформальдегид (PFA)Thermo/Life Technologies28906
Стерильная дистиллированная водаThermo/Life Technologies15230162
Triton X-100VWR97062-208
Equipment
Trypsin EDTA, 0,05%Thermo/Life Technologies25300-120
(Orb) Модуль ступицыЭмуляцияORB-HM1
100 мм x 15 мм круглая чашкаПетри FisherbrandFB087579B
120 x 120 мм квадратная чашка для клеточной культурыVWR688161
Accuri C6BD Biosciences
Аспирационные пипетки, индивидуально упакованныеCorning29442-462
Аспирационная установкаSP Bel-ArtF19917-0150
Центрифуга Avanti J-15R BeckmanCoulterB99516
Коническая центрифужная трубка, 15 млCorning352097
коническая центрифужная трубка, 50 млCorning352098
EVOS M7000Thermo/Life TechnologiesAMF7000флуоресцентный микроскоп для получения изображений неподвижных и окрашенных Клетки.
ГемоцитометрVWR100503-092
Heracell VIOS 160i CO2 инкубаторThermo/Life Technologies51030403
перевернутый Zeiss Axio Observer оснащен камерой AxioCam 503 CarlZeiss Micrscopy491916-0001-000 (микроскоп) ; 426558-0000-000 (камера)
Kimberly-Clark нитриловые перчаткиVWR40101-346
Kimwipes, большиеVWR21905-049
Leoca SP8 Вертикальный конфокальный микроскоп
ЭмуляцияAK-CCR
прецизионные барьерные наконечники для пипетокDenville ScientificP1096-FR
P100 барьерные наконечники для пипетокDenville ScientificP1125
P1000 барьерные наконечники для пипетокDenville ScientificP1121
P20 барьерные наконечники для пипетокDenville ScientificP1122
P200 барьерные наконечники для пипетокDenville ScientificP1122
Технология Plasma AsherQuorum TechK1050X RFЭтот аппарат плазменного травления/ашера/очистителя использовался в составе Центра общих материалов (SMiF) Университета Дьюка.
Пробирка из полистирола с круглым дном и защелкивающимся колпачком для клеточного фильтраCorning352235
серологическая пипетка, 10 мл, в индивидуальной упаковкеCorning356551
серологическая пипетка, 25 мл, в индивидуальной упаковкеCorning356525
серологическая пипетка, 5 мл, в индивидуальной упаковкеCorning356543
Steriflip, 0,22 и микро; m, PESEMD МиллипоровыеSCGP00525
стерильные микроцентрифужные пробиркиThomas Scientific1138W14
T75cm2 колба для клеточных культур с вентиляционным колпачкомCorning430641U
Обработанные тканевой культурой 12-луночные планшетыCorning353043
Обработанные тканевой культурой 6-луночные планшетыCorning353046
Вакуумный модулятор и перстальтический насос (модуль Zoe Culture)ЭмуляцияZOE-CM1Органный чип
VE-Cadherin CD144 антитело к человеку - конъюгированное APCMiltenyi Biotec130-126-010
Широкоскосекальный клеточный лифтерCorning3008
MACS
CD144 Микрогранулы, человеческиеMiltenyi Biotec130-097-857
CD31 Набор микрошариков, человекMiltenyi Biotec130-091-935
LS колонныMiltenyi Biotec130-042-401
Медиа резервуар (портативный модуль POD)Эмуляция POD-1 Шейкер микропластин VWR 12620-926 Эмуляция чипа органа S-1 Чип держатель органной микросхемы P10 биореактора

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, L., et al. A disease model of diabetic nephropathy in a glomerulus-on-a-chip microdevice. Lab on a Chip. 17 (10), 1749-1760 (2017).
  2. Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1 (5), 1-12 (2017).
  3. Petrosyan, A., et al. A glomerulus-on-a-chip to recapitulate the human glomerular filtration barrier. Nature Communications. 10 (1), 3656(2019).
  4. Hass, R., Kasper, C., Böhm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Communication and Signaling. 9, 12(2011).
  5. Altschuler, S. J., Wu, L. F. Cellular heterogeneity: when do differences make a difference. Cell. 141 (4), 559-563 (2010).
  6. Da Sacco, S., et al. A novel source of cultured podocytes. PloS One. 8 (12), 81812(2013).
  7. Singh, V. K., Kalsan, M., Kumar, N., Saini, A., Chandra, R. Induced pluripotent stem cells: applications in regenerative medicine, disease modeling, and drug discovery. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 2(2015).
  8. Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal of cardiovascular pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
  9. Patsch, C., et al. Generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 17 (8), 994-1003 (2015).
  10. Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip. Nature Protocols. 13 (7), 1662-1685 (2018).
  11. Burt, M., Bhattachaya, R., Okafor, A. E., Musah, S. Guided differentiation of mature kidney podocytes from human induced pluripotent stem cells under chemically defined conditions. Journal of Visualized Experiments. (161), e61299(2020).
  12. Roye, Y. A personalized glomerulus chip engineered from stem cell-derived epithelium and vascular endothelium. Micromachines. 12 (8), 967(2021).
  13. Roselli, S., et al. Podocin localizes in the kidney to the slit diaphragm area. The American Journal of Pathology. 160 (1), 131-139 (2002).
  14. Ruotsalainen, V., et al. Nephrin is specifically located at the slit diaphragm of glomerular podocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (14), 7962-7967 (1999).
  15. Privratsky, J. R., Newman, P. J. PECAM-1: regulator of endothelial junctional integrity. Cell and Tissue Research. 355 (3), 607-619 (2014).
  16. Menon, M. C., Chuang, P. Y., He, C. J. The glomerular filtration barrier: components and crosstalk. International Journal of Nephrology. 2012, 749010(2012).
  17. Abutaleb, N. O., Truskey, G. A. Differentiation and characterization of human iPSC-derived vascular endothelial cells under physiological shear stress. STAR Protocols. 2 (2), 100394(2021).
  18. Pammolli, F., Magazzini, L., Riccaboni, M. The productivity crisis in pharmaceutical R&D. Nature Reviews. Drug Discovery. 10 (6), 428-438 (2011).
  19. Atchison, L., et al. iPSC-derived endothelial cells affect vascular function in a tissue-engineered blood vessel model of Hutchinson-Gilford progeria syndrome. Stem Cell Reports. 14 (2), 325-337 (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Kidney Glomerulus ChipInduced Pluripotent Stem CellsIsogenic Organ ChipGlomerular Filtration BarrierPodocyte DifferentiationVascular Endothelial CellsMicrofluidic ChipNephrotoxicity TestingPrecision MedicinePatient Specific Disease Modeling

Related Articles