Безметочная визуализация со сверхвысоким разрешением, основанная на вибрационной визуализации набухшей ткани и анализе

Краткое содержание

Сочетая химию гидрогеля с расширением образца с безметочной химически специфической химически стимулированной микроскопией комбинационного рассеяния, протокол описывает, как достичь объемной визуализации сверхвысокого разрешения без меток в биологических образцах. С помощью дополнительного алгоритма сегментации изображений с помощью машинного обучения были получены белок-специфические многокомпонентные изображения в тканях без мечения антителами.

Аннотация

Повсеместное использование флуоресцентной микроскопии, особенно микроскопии сверхвысокого разрешения, значительно продвинуло вперед знания о современной биологии. С другой стороны, требование флуорофорного мечения в флуоресцентных методах создает значительные проблемы, такие как фотообесцвечивание и неравномерное мечение флуоресцентных зондов, а также длительная обработка образцов. В этом протоколе подробно описаны рабочие процедуры вибрационной визуализации набухшей ткани и анализа (VISTA). VISTA обходит препятствия, связанные с флуорофорами, и обеспечивает безмаркерную объемную визуализацию со сверхвысоким разрешением в биологических образцах с пространственным разрешением до 78 нм. Процедура устанавливается путем встраивания клеток и тканей в гидрогель, изотропного расширения гибридного образца гидрогеля и визуализации распределения эндогенных белков с помощью вибрационной визуализации с помощью вынужденной микроскопии комбинационного рассеяния. Метод демонстрируется как на клетках, так и на тканях мозга мыши. Были получены высококоррелятивные изображения VISTA и иммунофлуоресцентные изображения, подтверждающие белковое происхождение специфичности визуализации. Используя такую корреляцию, алгоритм сегментации изображений на основе машинного обучения был обучен для достижения многокомпонентного прогнозирования ядер, кровеносных сосудов, нейронных клеток и дендритов по изображениям мозга мышей без меток. Процедура была дополнительно адаптирована для исследования патологических агрегатов полиглутамина (polyQ) в клетках и бляшек бета-амилоида (Aβ) в тканях мозга с высокой пропускной способностью, что оправдывает ее потенциал для крупномасштабных клинических образцов.

Введение

Развитие методов оптической визуализации произвело революцию в понимании современной биологии, поскольку они предоставляют беспрецедентную пространственную и временную информацию о мишенях в различных масштабах, от субклеточных белков до целых^{органов.} Среди них наиболее хорошо зарекомендовала себя флуоресцентная микроскопия с большой палитрой органических красителей с высокими коэффициентами экстинкции и квантовыми^{выходами2}, простыми в использовании генетически кодируемыми флуоресцентными белками³ и методами сверхвысокого разрешения, такими как STED, PALM и STORM, для визуализации структур нанометрового ^{масштаба4,5}. Кроме того, последние достижения в области пробоотборной инженерии и консервационной химии, которые расширяют образцы, встроенные в набухающие полимерные гидрогели ^6,7,8, позволяют использовать субдифракционное ограниченное разрешение на обычных флуоресцентных микроскопах. Например, типичная расширяющая микроскопия (ExM) эффективно повышает разрешение изображения в четыре раза за счет четырехкратного изотропного расширения образца⁷.

Несмотря на свои преимущества, флуоресцентная микроскопия со сверхвысоким разрешением имеет ограничения, которые возникают из-за мечения флуорофорами. Во-первых, фотообесцвечивание и инактивация флуорофоров ставят под угрозу способность к повторным и количественным оценкам флуоресценции. Фотообесцвечивание является неизбежным явлением, когда свет продолжает накачивать электроны в электронно-возбужденные состояния⁹. Во-вторых, маркировка флуорофоров по нужным мишеням не всегда является простой задачей. Например, иммуноокрашивание требует длительного и трудоемкого процесса подготовки образцов и затрудняет производительность визуализации¹⁰. Он также может вносить артефакты из-за неоднородного мечения антителами, особенно глубоко внутри тканей¹¹. Более того, правильные стратегии мечения, нацеленные на флуорофоры для желаемых белков, могут быть недостаточно разработаны. Например, для выявления эффективных антител к бляшкам Aβ¹² требовался обширный скрининг. Более мелкие органические красители, такие как конголезский красный, часто имеют ограниченную специфичность, окрашивая только ядро Aβ-бляшки. Таким образом, крайне желательно разработать безмаркерный метод сверхвысокого разрешения, который обходит недостатки флуорофорного мечения и обеспечивает дополнительную визуализацию с высоким разрешением от клеток к тканям и даже к крупномасштабным образцам человека.

Рамановская микроскопия обеспечивает безмаркерный контраст для структур, специфичных для химических веществ, и составляет карту распределения невидимых в противном случае химических связей, рассматривая возбужденные колебательные^{переходы.} В частности, было продемонстрировано, что визуализация методом вынужденного комбинационного рассеяния света (SRS) на образцах без меток или с крошечными метками имеет скорость, аналогичную флуоресцентной микроскопии^14,15. Например, здоровая область мозга была легко дифференцирована от инфильтрированной опухолью области в тканях человека и мыши^16,17. Бляшки Aβ также были четко визуализированы путем нацеливания на белки CH₃ vibration (2940 ^см-1) и амид I (1660 ^см-1) на свежезамороженном срезе мозга без какой-либо^{маркировки}. Таким образом, комбинационное рассеяние дает мощный контраст без меток, который преодолевает ограничения флуорофоров. Тогда вопрос заключался в том, как можно достичь сверхвысокого разрешения с помощью комбинационного рассеяния, которое могло бы выявить наноразмерные структурные детали и функциональные последствия в биологических образцах.

Несмотря на то, что были предприняты значительные усилия для достижения сверхвысокого разрешения для рамановской микроскопии с помощью элегантных оптических инструментов, повышение разрешения на биологических образцах было довольно ограниченным 19,20,21. Здесь, основываясь на последних работах^22,23, мы представляем протокол, который сочетает в себе стратегию расширения выборки со стимулированным комбинационным рассеянием для вибрационной визуализации без меток со сверхвысоким разрешением, названный Vibrational Imaging of Soured Ttissue and Analysis (VISTA). Во-первых, клетки и ткани были встроены в гидрогелевые матрицы с помощью оптимизированного протокола белок-гидрогелевой гибридизации. Затем гибриды гидрогелевых тканей инкубировали в богатых моющими средствами растворах для делипидации с последующим расширением в воде. Затем расширенные образцы были визуализированы с помощью обычного микроскопа SRS путем нацеливания на колебания_CH3 из сохраненных эндогенных белков. VISTA, благодаря своей функции безметочной визуализации, позволяет избежать фотообесцвечивания и неоднородного мечения, возникающих при флуорофорном мечении, с гораздо более высокой производительностью обработки образцов. Это также первая зарегистрированная визуализация без меток с длиной волны менее 100 нм (до 78 нм). Никаких дополнительных оптических приборов, кроме типичной настройки SRS^22,24, не требуется, что делает ее легко применимой. С помощью коррелятивных изображений VISTA и иммунофлуоресцентных изображений установленный алгоритм сегментации изображений с машинным обучением был обучен^25,26 для создания белково-специфических мультиплексных изображений из одноканальных изображений. В дальнейшем этот метод был применен для исследования Aβ-бляшек в тканях мозга мышей, что позволило получить целостное изображение, пригодное для субфенотипирования, основанное на тонких изображениях ядра бляшки и периферических филаментов, окруженных ядрами клеток и кровеносными сосудами.

Протокол

Все процедуры на животных, выполненные в этом исследовании, были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Калифорнийского технологического института (IACUC), а протокольные процедуры соответствовали всем соответствующим этическим нормам.

1. Подготовка стоковых растворов к фиксации и наращиванию образца

1. Приготовьте 40 мл фиксирующего раствора, предварительно растворив 12 г твердого акриламида (30% по массе) в 26 мл воды, не содержащей нуклеаз. Затем добавьте в смесь 10 мл 16% исходного раствора PFA. Наконец, добавьте 4 мл 10-кратного фосфатно-солевого буфера (PBS, pH 7,4). Приготовленный раствор можно хранить при температуре 4 °C до 2 недель.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Акриламид опасен, поэтому этап растворения твердого вещества акриламида в воде следует проводить в вытяжном шкафу.
2. Приготовьте раствор для гелеобразования (запас X) путем растворения 70 мг акрилата натрия (7% по массе), 200 мг акриламида (20% по массе) и 50 мкл N, N'-метиленбисакриламида (0,1% по массе) в 420 мкл сверхчистой воды. Добавьте 57 мкл стерильно отфильтрованного 10x PBS (pH 7,4) в конце и храните этот раствор при температуре −20 °C до 1 недели.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте твердого вещества акрилата натрия, которое образует комки; Убедитесь, что используемый акрилат натрия находится в виде дисперсионных порошков. Полученный запас X будет бесцветной жидкостью; Если жидкость выглядит светло-желтой, приобретите новый акрилат натрия.
3. Приготовьте раствор инициатора полимеризации, растворив 1 г персульфата аммония (АФС, 10% по массе) в 9 мл воды, не содержащей нуклеаз. Аналогичным образом приготовьте раствор ускорителя полимеризации, растворив 1 г тетраметилэтилендиамина (TEMED, 10% мас./вес) в 9 мл воды, не содержащей нуклеаз. Аликвотировать полученные растворы и хранить при температуре −20 °С.
4. Приготовьте 50 мл денатурирующего буфера, растворив 2,88 г додецилсульфата натрия (SDS, 200 мМ), 0,584 г натрия хлорида (200 мМ) и 2,5 мл 1М Tris-HCl буфера (50 мМ, pH 8) в воде, не содержащей нуклеаз.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация SDS близка к ухудшению состояния насыщения. Некоторая кристаллизация в буфере является нормальным явлением. Небольшой подогрев его до 37 °C может сделать раствор прозрачным и готовым к использованию.

2. Подготовка образцов клеток млекопитающих

1. Высадите 3,5 x 10⁴ клеток HeLa на боросиликатный покровный стекло диаметром 12 мм (#1,5) в 24-луночный планшет, а затем культивируйте клетки в 400 μл модифицированной орлиной среды Dulbecco (DMEM) с 10% эмбриональной бычьей сывороткой и 1% антибиотиками пенициллин-стрептомицин (полный DMEM) во влажной атмосфере с 5%_CO2 при 37 °C.
2. Чтобы получить клетки на разных митотических стадиях, инкубируйте клетки в полном DMEM до 60% конфлюенции. Затем обрабатывайте клетки DMEM без фетальной бычьей сыворотки в течение 20 часов для синхронизации клеточных стадий. После синхронизации переключите среду для клеток, чтобы они завершили DMEM, и инкубируйте еще 2-6 часов, чтобы нацелиться на различные стадии митоза.
3. Клетки HeLa на покровных стеклах промойте стерильным PBS и инкубируйте их с фиксирующим раствором (4% PFA, 30% акриламид [AA] в PBS) при 37 °C в течение 7-8 часов перед дальнейшей обработкой.
   Примечание: Более высокая температура фиксации в сочетании с высокой концентрацией акриламида помогает погасить межмолекулярные сшивки между белками во время процессов фиксации и, как сообщается, сохраняет детализированные ультраструктуры белков⁸.
4. Для клеток с агрегатами polyQ выращивайте клетки в полном DMEM до тех пор, пока они не достигнут 70%-90% конфлюенции. После перехода на новую полную DMEM трансфектируйте 1 г плазмиды, кодирующей mHtt97Q-GFP, в клетки с помощью трансфекционного агента (подробнее в таблице материалов). Выполняйте трансфекцию в соответствии с протоколом производителя.
5. Через 24-48 ч после трансфекции удалить питательную среду и добавить 800 мкл фиксирующего раствора (4% PFA, 30% AA) в покровные стекла с клетками. Инкубировать покровные стекла при температуре 37 °C в течение 6-8 часов. Промойте покровное стекло PBS 3x, и полученные образцы клеток готовы к дальнейшей обработке.

3. Подготовка образцов мозга мыши

1. Приобретите мышей C57BL/6J (от 6 до 8 недель, самец и самка, шесть мышей) и мышей с болезнью Альцгеймера (9 месяцев, самка, три мыши) из коммерческих источников (подробности в Таблице материалов). Проведение эвтаназии с помощью углекислого наркоза в соответствии со стандартным протоколом²⁷. Короче говоря, поместите мышей в камеру и заполните камеру потоком 100%_CO2 в размере 30%-70% объема камеры/мин и поддерживайте поток в течение как минимум 1 минуты после клинической смерти.
2. После подтверждения гуманной эвтаназии быстро обезглавьте мышей с помощью ножниц. Обнажите череп большим разрезом через кожу по средней линии. Потяните кожу к носу животного, чтобы полностью обнажить череп.
3. Разрежьте череп по средней линии тонкими ножницами и снимите две половины черепа в сторону. Используйте пинцет, чтобы вычерпать мозг в чашку Петри на льду с PBS. Промойте свежий мозг мыши ледяным PBS и перенесите мозг на 10 мл фиксирующего буфера (4% PFA, 30% AA).
4. Инкубируйте мозг мыши в фиксирующем буфере при температуре 4 °C в течение 24-48 часов, а затем перенесите его на ночь при температуре 37 °C. После промывки стерильным PBS разрежьте мозг мыши на участки размером 150 мкм с помощью вибратома и храните в PBS при температуре 4 °C.

4. Встраивание гидрогеля, денатурация и расширение образцов клеток и тканей

1. Убедитесь, что образцы инкубировались в фиксирующем буфере в течение необходимого количества времени, как указано выше. Размораживайте исходные растворы X, свободнорадикального инициатора и ускорителя и держите их на льду в течение всего процесса.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Недостаточное время инкубации может привести к уменьшению количества белков, удерживаемых в гидрогелевом гибриде, и, следовательно, вызвать снижение сигнала.
2. Возьмите в руки покровный лист с ячейками и поместите его на предметное стекло с помощью пинцета. Выберите срезы мозга (толщиной 150 мкм) и положите их на другое предметное стекло с помощью мягкошерстяной кисти, следя за тем, чтобы они были плоскими. Избавьтесь от лишней жидкости, которая поступает вместе с образцами.
3. Сложите два покровных стекла (#1.5), добавив капли воды между ними, с обеих сторон образца на предметное стекло, чтобы получилась камера гелеобразования. Поместите предметное стекло образцом вверх на ледяной термоблок и охладите его до 4 °C в течение 1 минуты.
4. Добавьте 10% (w/w) TEMED к исходному раствору X, а затем 10% раствор APS. Быстро сделайте вихревой процесс и, в течение 1 минуты после перемешивания, медленно капните полученный раствор в камеру на образцы, чтобы покрыть поверхность образца, не допуская образования пузырьков воздуха. Перед добавлением в образец держите раствор и образцы на льду (или в ледяном тепловом блоке), чтобы избежать образования геля (высокой степени полимеризации).
5. После того как образец будет полностью погружен в раствор, поместите поверх образца плоскую, прозрачную, покрытую пленкой защитную крышку в качестве крышки для камеры. Оставьте камеру на льду или в ледяном тепловом блоке еще на 1 минуту перед инкубацией в увлажняющем инкубаторе при температуре 37 °C в течение 30 минут.
6. Выньте камеру гелеобразования на предметном стекле из инкубатора при температуре 37 °C. После снятия крышки следует наблюдать за непрозрачным гелем. Извлеките гель, разрезав лезвием бритвы, или, в качестве альтернативы, поместите предметное стекло в денатурирующий буфер при комнатной температуре на 15 минут. Гель сам отделится от предметного стекла.
7. Инкубируйте выделенный гель в денатурирующем буфере в тепловых условиях для достижения дальнейшей денатурации и делипидации. Образцы клеток денатурировать при 95 °C в течение 1 ч. Для срезов мозга толщиной 150 мкм денатурацию следует провести при 70 °C в течение 3 ч, а затем при 95 °C в течение 1 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Гель может стать фигурным при первой инкубации с денатурирующим буфером при комнатной температуре. Это нормальное явление и после высокотемпературной денатурации становится плоским. При работе с более толстыми образцами тканей требуется более длительное время денатурации.
8. После термической обработки денатурированный образец 3 раза промыть PBS в течение 10 минут. К этому моменту гель должен был расшириться примерно в 1,5 раза по сравнению с первоначальным размером. Инкубируйте промытый гель со сверхчистой водой в большой емкости (не менее чем в 20 раз превышающей объем геля) для достижения более высокого коэффициента расширения. Меняйте воду каждые 1 час 3 раза и оставьте образец в темноте на ночь. Полученный гель готов к изображению.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Коэффициент расширения во многом зависит от механических свойств исходного образца. Получено расширение в 4,2 раза для образцов клеток и расширение в 3,4 раза для образца ткани мозга.

5. Безмаркерная визуализация распределения эндогенных белков в расширенных образцах клеток и тканей

1. Храните образцы расширенного геля в воде во время процесса визуализации. После расширения гель становится хрупким, поэтому с ним следует обращаться с осторожностью. Поместите расширенный гель на предметное стекло микроскопа (толщиной 1 мм) с микроскопической прокладкой с соответствующими размерами и глубиной отверстий, заполненное водой. Закройте распорку покровным стеклом (#1.5) и убедитесь, что она надежно закрыта, чтобы избежать перемещения образца.
2. Поместите образец с расширенной клеткой или тканью на моторизованный предметный столик так, чтобы покровное стекло было обращено к объективу. Нажмите «Окуляр » в программе, чтобы изменить траекторию света на яркое поле, и отрегулируйте положение по оси Z с помощью ручного ручки.
3. Добавьте погружное масло в верхнюю часть образца и отрегулируйте конденсор в правильное положение для освещения по Кёлеру, наблюдая за ним в светлом поле с 25-кратным увеличением от объектива. Ввод 791,3 нм в окно длины волны ОПО на лазерной панели для нацеливания на вибрацию белка_CH3 на частоте 2940 см⁻¹.
4. Переключите свет микроскопа с яркого поля (окуляра) в режим лазерного сканирования, нажав кнопку LSM , и откройте лазерный затвор SRS, нажав кнопку Shutter на панели управления лазером. Нажмите кнопку LIVE в программном обеспечении микроскопа, чтобы начать получение изображений в режиме реального времени.
5. Найдите правильный фокус, изменив z при просмотре изображения SRS при коротком времени задержки пикселей (12,5 μс/пиксель) и низком разрешении изображения (256 x 256 пикселей). Как только идеальное Z-положение будет найдено, измените размер сканирования и время задержки пикселей, потянув за соответствующую полосу в программном обеспечении микроскопа.
6. Получите изображение, нажав кнопку LSM , используя условие супердискретизации (1024 пикселя x 1024 пикселя) с более длительным временем задержки пикселей (80 μс/пиксель), которое соответствует постоянной времени синхронного усилителя. Получение объемных изображений путем сбора z-стека с шагом 1 мкм в направлении z. Обрабатывайте и анализируйте сохраненный файл OIR из программного обеспечения с помощью ImageJ.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подробная настройка SRS недавно была опубликована в Mutlu et ^al.24. Здесь перестраиваемый пикосекундный лазер с частотой следования 80 МГц и полосой пропускания 2 пс для накачки (770-990 нм) и Стокса (1031,2 нм) был направлен в лазерный сканирующий конфокальный микроскоп (подробно см. таблицу материалов). Оптимизируйте временное и пространственное перекрытие двух лучей для сигналов с чистым D₂O. Требуется некоторое усилие, чтобы найти правильное значение z для расширенного образца в светлом поле, потому что показатель преломления очень однороден по всему гелю.
7. Определите разрешение VISTA, сделав SRS-изображение гранул полистирола (100 нм) с использованием объектива 25x и объектива 60x. Установите накачку лазера на 784,5 нм, что соответствует рамановскому сдвигу в 3050 см⁻¹, характерному для ароматических растяжек C-H колебаний полистирола.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используемая здесь длина волны лазера накачки аналогична той, которая используется в VISTA для белков.
8. С объективом 60x экспериментальный полноволновой полумаксимум (FWHM, которая представляет собой ширину формы линии на половине амплитуды) изображения шарика составил 276,17 нм. Смоделируйте функцию объекта-бусины в виде полукруга.
   Примечание: Когда гауссова функция PSF имеет c (σ) = 269 нм/2,35, изображение извилистого шва будет иметь измеренную FWHM 276,17 нм. В результате разрешение системы SRS составляет 269 нм × 1,22 = 328 нм по критерию Рэлея. Поскольку VISTA имеет в среднем 4,2-кратное расширение образцов клеток, эффективное разрешение снижается до 328 нм/4,2 = 78 нм.

6. Корреляционная VISTA и флуоресцентная визуализация иммуномеченных и расширенных образцов тканей

1. После денатурации предварительно инкубируйте внедренные в гидрогель образцы (например, корональный срез мозга 150 мкм) в 1% (v/v) Triton X-100 (PBST) в течение 15 минут. Переключите инкубационный буфер на PBST с первичным антителом в соотношении 1:100. Если для мультиплексной визуализации требуется несколько белковых мишеней, разбавьте соответствующие первичные антитела для разных мишеней до нужных концентраций в одном и том же коктейле и инкубируйте с образцами одновременно.
2. Инкубируйте гели с разбавленными первичными антителами при 37 °C с легким встряхиванием при 80 об/мин в течение 16-18 ч, с последующим обширным 3-кратным промыванием PBST в течение 1-2 ч при 37 °C. Переворачивайте гель во время инкубации, чтобы предотвратить мечение неоднородных антител здесь и во всех последующих инкубациях.
3. Образцы инкубируют со вторичными антителами соответствующих видовых мишеней в разведении 1:100 с ПБСТ при 37 °С в течение 12-16 ч, защищенных от света. Промыть меченые гидрогелевые образцы 3 раза PBST в течение 1-2 часов при 37 °C с легким встряхиванием.
4. Разбавьте DAPI до 3 мкМ конечной концентрации в PBS. Добавьте к образцу гидрогель достаточный объем раствора DAPI так, чтобы гель был погружен в раствор. Выдерживать в течение 1-2 ч при комнатной температуре с легким встряхиванием при 80 об/мин. Промойте образец 3 раза с PBS.
5. Расширьте количество образцов геля, меченных иммуноликой, путем инкубации с большим объемом дважды деионизированного H₂O. Меняйте воду каждые 1 ч 3 раза и инкубируйте образцы в H₂O в течение ночи, защищенной от света. Во время мечения гель должен расширяться в 1,5 раза по сравнению с PBS-буфером.
6. Подготовьте образец изображения, как описано в шаге 5.1. Поместите образец изображения на лазерный сканирующий конфокальный микроскоп с объективом погружения в воду 25x (1,05 NA) для флуоресцентной визуализации.
7. Выберите подходящий канал с соответствующим возбуждающим лазером (405 нм, 488 нм, 561 нм и 640 нм) и парой ФЭУ в соответствии с целевыми антителами в выпадающем меню программного обеспечения микроскопа. Нажмите кнопку LIVE для получения изображения в режиме реального времени.
8. Отрегулируйте положение фокусировки с помощью ручного регулятора на основе сигнала флуоресценции в реальном времени. Оптимизируйте мощность лазера, время задержки пикселей и усиление ФЭУ в программном обеспечении микроскопа в соответствии с сигналом флуоресценции в реальном времени, чтобы избежать тусклого сигнала или перенасыщения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оцените внешний вид и особенности на основе сообщенных структур различных антител, чтобы устранить потенциальную перекрестную реактивность антител и избежать перекрестных помех между различными флуоресцентными каналами.
9. Нажмите кнопку LSM , чтобы начать получение коррелятивных SRS и флуоресцентных изображений. Во-первых, соберите объемные флуоресцентные изображения на образцах, меченных иммунитетом. После завершения флуоресцентной визуализации переключите световой путь микроскопа в инфракрасное (ИК) прозрачное состояние.
10. Измените канал обнаружения с флуоресцентной ФЭУ на SRS в программном обеспечении микроскопа. Откройте затвор для лазера SRS и выполните объемную визуализацию SRS в поле зрения того же образца с тем же диапазоном z. Нормальный диапазон составляет от 100 до 200 мкм и может доходить до 700 мкм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Существует небольшая хроматическая аберрация, которая вызывает смещение z-положения между флуоресцентными изображениями и изображениями SRS из-за разницы длин волн в лазерах возбуждения. Необходимо ручное параллельное сравнение между изображениями SRS и флуоресцентным z-стеком. Ищите точные совпадающие характеристики как от SRS, так и от флуоресцентного канала, чтобы точно совпасть с z-положением.

7. Построение, обучение и валидация архитектуры U-Net

ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется установка на Linux. Требуется видеокарта с оперативной памятью объемом >10 ГБ.

1. Настройка среды
   1. Установите Anaconda или Miniconda на 3-5.3.0-linux-x86_64. Клонируйте или скачайте следующие файлы: https://github.com/Li-En-Good/VISTA. Создайте среду Conda для платформы с помощью следующей командной строки:
      conda env create -f environment.yml
2. Обучение модели прогнозирования
   1. Сопряжение каталогов соответствующих изображений SRS с наземными изображениями в файле csv. Разместите каталоги изображений SRS в разделе path_signal и изображения наземных данных в path_target столбцах.
   2. Поместите файл csv в папку data/csvs. При необходимости измените конфигурацию в scripts/train_model_2d.sh. Активируйте окружение с помощью командной строки:
      conda activate fnet
   3. Инициируем обучение модели с помощью командной строки:
      ./scripts/train_model_2d.sh <имя файла csv> 0
      После этого начнется обучение. Потери для каждой итерации будут отображаться в командной строке и сохраняться вместе с моделью в папке save_models/<имя файла для файла csv>.
3. Проверьте изображения в обучающем наборе и тестовом наборе с помощью командной строки:
   ./scripts/train_model_2d.sh <имя файла csv> 0
   Результаты прогноза будут сохранены в папке results/<имя файла csv>.

8. VISTA в сочетании с предсказаниями U-Net для белок-специфической мультиплексии в безметочных изображениях

1. Измените файл csv в data/csvs/<имя файла файла csv>/test.csv. Замените каталоги path_signal и path_target каталогом новых изображений SRS.
2. Удалите результаты прогноза из обучения, которые являются папкой results/<имя файла csv>. Запустите прогнозы с помощью командной строки:
   ./scripts/train_model_2d.sh <имя файла csv> 0
   Результаты прогноза будут сохранены в папке results/<имя файла csv>/test.

Результаты

После установления принципа работы метода визуализации и анализа была проведена регистрация изображений для оценки коэффициента расширения и обеспечения изотропного расширения во время обработки образца (рис. 1A, B). Как необработанные, так и VISTA образцы были визуализированы с нацеливанием на вибрацию связи на уровне 2940 ^см-1, которая происходит из_CH3 эндогенных белков. В необработанных образцах богатые белком структуры, такие как ядра, были темными ...

Обсуждение

Таким образом, мы представляем протокол для VISTA, который представляет собой безмаркерный метод визуализации богатых белками клеточных и субклеточных структур клеток и тканей. Нацеливаясь на эндогенный_CH3 из белков в клетках и тканях, встроенных в гидрогель, метод достигает эффективного разрешения визуализации до 78 нм в биологических образцах и устраняет незначительную экструзию в агрегатах гентингтина и фибриллы в Aβ-бляшках. Этот метод является первым случаем, в котором со...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
1,0 М Трис pH 8	Сигма-Олдрич	648314
16% параформальдегид	Электронная микроскопия	наука 15710	разбавленный до 4% в PBS
25x цель погружения в воду	Olympus	XLPLN25XWMP2	NA 1,05
5XFAD мыши	мутантные мыши ресурсные и исследовательские центры и лаборатория Джексона	B6SJL-Tg (APPSwFlLon, PSEN1*M146L*L286 V) 6799Vas/Mmjax	Мозг Альцгеймера
60-кратный водяной иммерсионный объектив	Olympus	UPLSAPO60XWIR	NA 1.2
Акриламид	Sigma-Aldrich	A9099
персульфат аммония	Sigma-Aldrich	A3678
анти-MAP2	Клеточная сигнальная технология	8707
анти-NeuN	Клеточная сигнальная технология	24307
боросиликатный покровный лист #1.5	Fisher Scientific	1254581
C57BL/6J Мыши	Jackson Laboratory (JAX)	664	Нормальные мыши
D2O	Sigma-Aldrich	151882	для калибровки SRS
DAPI	Thermo Fisher	D1306
DMEM	GIBCO	10566-016
FBS	GIBCO	A4766
предметное стекло 3" x 1" x 1 мм	VWR	16004-430
козий анти-куриный IgY, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21449
козий анти-мышиный IgG, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21236
козий анти-кролик IgG, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11034
козий анти-крысиный IgG, Alexa Fluor 568	Invitrogen	A-11077
Grace Bio-Labs Press-To-Seal силиконовые изоляторы	Sigma-Aldrich	GBL664108	микроскоп
Spacer Htt-97Q-GFP	Plasmid Gift от профессора Р. Копито и профессора Ф.-У. Хартла.
Лазерный сканирующий микроскоп	Olympus	FV3000	лазерный сканирующий конфокальный микроскоп
lipofectamine 3000	Thermo Fisher	L3000001	средство для трансфекции
Lycopersicon Esculentum Lectin DyLight® 594 (лектин)	Vector Laboratories	DL-1177-1
Микроскоп спейсер	Grace Bio-Labs	621502
N,N′-метиленбисакриламид (BIS)	Sigma-Aldrich	M1533	куплен в виде 2% раствора в воде
без нуклеазы Thermo	Fisher	10977-015
Пенициллин-стрептомицин	GIBCO	15140-122
поли-стрен	бисер Sigma-Aldrich	43302	для определения разрешающей способности
Акрилат натрия	Sigma-Aldrich	408220
додецилсульфат натрия	Sigma-Aldrich	71725
мягкая шерстяная кисть #3	TANIS	000333
SRS Laser	A.P.E	picoEmerald	2ps длительность
импульсатетраметилэтилендиамин	Sigma-Aldrich	T9281
Колба для культуры тканей 25 см2	Corning	430639
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416
пинцет	Fine Science Tool	11295-51
Вибротом	Leica	VT1200S	вибратомом