Сочетая химию гидрогеля с расширением образца с безметочной химически специфической химически стимулированной микроскопией комбинационного рассеяния, протокол описывает, как достичь объемной визуализации сверхвысокого разрешения без меток в биологических образцах. С помощью дополнительного алгоритма сегментации изображений с помощью машинного обучения были получены белок-специфические многокомпонентные изображения в тканях без мечения антителами.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Безметочная визуализация со сверхвысоким разрешением, основанная на вибрационной визуализации набухшей ткани и анализе
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Повсеместное использование флуоресцентной микроскопии, особенно микроскопии сверхвысокого разрешения, значительно продвинуло вперед знания о современной биологии. С другой стороны, требование флуорофорного мечения в флуоресцентных методах создает значительные проблемы, такие как фотообесцвечивание и неравномерное мечение флуоресцентных зондов, а также длительная обработка образцов. В этом протоколе подробно описаны рабочие процедуры вибрационной визуализации набухшей ткани и анализа (VISTA). VISTA обходит препятствия, связанные с флуорофорами, и обеспечивает безмаркерную объемную визуализацию со сверхвысоким разрешением в биологических образцах с пространственным разрешением до 78 нм. Процедура устанавливается путем встраивания клеток и тканей в гидрогель, изотропного расширения гибридного образца гидрогеля и визуализации распределения эндогенных белков с помощью вибрационной визуализации с помощью вынужденной микроскопии комбинационного рассеяния. Метод демонстрируется как на клетках, так и на тканях мозга мыши. Были получены высококоррелятивные изображения VISTA и иммунофлуоресцентные изображения, подтверждающие белковое происхождение специфичности визуализации. Используя такую корреляцию, алгоритм сегментации изображений на основе машинного обучения был обучен для достижения многокомпонентного прогнозирования ядер, кровеносных сосудов, нейронных клеток и дендритов по изображениям мозга мышей без меток. Процедура была дополнительно адаптирована для исследования патологических агрегатов полиглутамина (polyQ) в клетках и бляшек бета-амилоида (Aβ) в тканях мозга с высокой пропускной способностью, что оправдывает ее потенциал для крупномасштабных клинических образцов.
Введение
Развитие методов оптической визуализации произвело революцию в понимании современной биологии, поскольку они предоставляют беспрецедентную пространственную и временную информацию о мишенях в различных масштабах, от субклеточных белков до целыхорганов. Среди них наиболее хорошо зарекомендовала себя флуоресцентная микроскопия с большой палитрой органических красителей с высокими коэффициентами экстинкции и квантовымивыходами2, простыми в использовании генетически кодируемыми флуоресцентными белками3 и методами сверхвысокого разрешения, такими как STED, PALM и STORM,....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все процедуры на животных, выполненные в этом исследовании, были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Калифорнийского технологического института (IACUC), а протокольные процедуры соответствовали всем соответствующим этическим нормам.
1. Подготовка стоковых растворов к фиксации и наращиванию образца
- Приготовьте 40 мл фиксирующего раствора, предварительно растворив 12 г твердого акриламида (30% по массе) в 26 мл воды, не содержащей нуклеаз. Затем добавьте в смесь 10 мл 16% исходного раствора PFA. Наконец, добавьте 4 мл 10-кратного фосфатно-солевого буфера (P....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
После установления принципа работы метода визуализации и анализа была проведена регистрация изображений для оценки коэффициента расширения и обеспечения изотропного расширения во время обработки образца (рис. 1A, B). Как необработанные, так и VISTA образцы были визуализированы с нацеливанием на вибрацию связи на уровне 2940 см-1, которая происходит изCH3 эндогенных белков. В необработанных образцах богатые белком структуры, такие как ядра, были темными .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Таким образом, мы представляем протокол для VISTA, который представляет собой безмаркерный метод визуализации богатых белками клеточных и субклеточных структур клеток и тканей. Нацеливаясь на эндогенныйCH3 из белков в клетках и тканях, встроенных в гидрогель, метод достигает эффективного разрешения визуализации до 78 нм в биологических образцах и устраняет незначительную экструзию в агрегатах гентингтина и фибриллы в Aβ-бляшках. Этот метод является первым случаем, в котором со.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.
Благодарности
Выражаем благодарность Калифорнийскому технологическому центру биологической визуализации за поддержку программного обеспечения. L.W. выражает признательность за поддержку Национальным институтам здравоохранения (NIH Director's New Innovator Award, DP2 GM140919-01), Amgen (Amgen Early Innovation Award) и стартовым фондам Калифорнийского технологического института.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1,0 М Трис pH 8 | Сигма-Олдрич | 648314 | |
| 16% параформальдегид | Электронная микроскопия | наука 15710 | разбавленный до 4% в PBS |
| 25x цель погружения в воду | Olympus | XLPLN25XWMP2 | NA 1,05 |
| 5XFAD мыши | мутантные мыши ресурсные и исследовательские центры и лаборатория Джексона | B6SJL-Tg (APPSwFlLon, PSEN1*M146L*L286 V) 6799Vas/Mmjax | Мозг Альцгеймера |
| 60-кратный водяной иммерсионный объектив | Olympus | UPLSAPO60XWIR | NA 1.2 |
| Акриламид | Sigma-Aldrich | A9099 | |
| персульфат аммония | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| анти-MAP2 | Клеточная сигнальная технология | 8707 | |
| анти-NeuN | Клеточная сигнальная технология | 24307 | |
| боросиликатный покровный лист #1.5 | Fisher Scientific | 1254581 | |
| C57BL/6J Мыши | Jackson Laboratory (JAX) | 664 | Нормальные мыши |
| D2O | Sigma-Aldrich | 151882 | для калибровки SRS |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| DMEM | GIBCO | 10566-016 | |
| FBS | GIBCO | A4766 | |
| предметное стекло 3" x 1" x 1 мм | VWR | 16004-430 | |
| козий анти-куриный IgY, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21449 | |
| козий анти-мышиный IgG, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21236 | |
| козий анти-кролик IgG, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11034 | |
| козий анти-крысиный IgG, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A-11077 | |
| Grace Bio-Labs Press-To-Seal силиконовые изоляторы | Sigma-Aldrich | GBL664108 | микроскоп |
| Spacer Htt-97Q-GFP | Plasmid Gift от профессора Р. Копито и профессора Ф.-У. Хартла. | ||
| Лазерный сканирующий микроскоп | Olympus | FV3000 | лазерный сканирующий конфокальный микроскоп |
| lipofectamine 3000 | Thermo Fisher | L3000001 | средство для трансфекции |
| Lycopersicon Esculentum Lectin DyLight® 594 (лектин) | Vector Laboratories | DL-1177-1 | |
| Микроскоп спейсер | Grace Bio-Labs | 621502 | |
| N,N′-метиленбисакриламид (BIS) | Sigma-Aldrich | M1533 | куплен в виде 2% раствора в воде |
| без нуклеазы Thermo | Fisher | 10977-015 | |
| Пенициллин-стрептомицин | GIBCO | 15140-122 | |
| поли-стрен | бисер Sigma-Aldrich | 43302 | для определения разрешающей способности |
| Акрилат натрия | Sigma-Aldrich | 408220 | |
| додецилсульфат натрия | Sigma-Aldrich | 71725 | |
| мягкая шерстяная кисть #3 | TANIS | 000333 | |
| SRS Laser | A.P.E | picoEmerald | 2ps длительность |
| импульсатетраметилэтилендиамин | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Колба для культуры тканей 25 см2 | Corning | 430639 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| пинцет | Fine Science Tool | 11295-51 | |
| Вибротом | Leica | VT1200S | вибратомом |
Ссылки
- Ntziachristos, V. Going deeper than microscopy: The optical imaging frontier in biology. Nature Methods. 7 (8), 603-614 (2010).
- Lavis, L. D., Bright Raines, R. T. ideas for chemical biology. ACS Chemical Biology. 3 (3), 142-155 (2008).
- Tsien, R. Y.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
