Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Выделение лизатов цельноклеточного белка из процессов лица мыши и культивируемых клеток небной мезенхимы для анализа фосфопротеинов

2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/63834

⸱

1 апреля 2022 г.

 ,  , 
1Department of Craniofacial Biology, School of Dental Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В протоколе представлен метод выделения лизатов цельноклеточного белка из рассеченных лицевых процессов эмбриона мыши или культивируемых эмбриональных клеток мезенхимы неба мыши и выполнения последующего вестерн-блоттинга для оценки уровней фосфорилированного белка.

Аннотация

Черепно-лицевое развитие млекопитающих представляет собой сложный морфологический процесс, в ходе которого несколько клеточных популяций координируются для создания фронтоназального скелета. Эти морфологические изменения инициируются и поддерживаются посредством различных сигнальных взаимодействий, которые часто включают фосфорилирование белка киназами. Здесь приведены два примера физиологически значимых контекстов, в которых можно изучать фосфорилирование белков во время черепно-лицевого развития млекопитающих: лицевые процессы мыши, в частности верхнечелюстные процессы E11.5, и культивируемые эмбриональные клетки небного мезенхима мыши, полученные из вторичных небных полок E13.5. Для преодоления общего барьера дефосфорилирования при выделении белка обсуждаются адаптации и модификации к стандартным лабораторным методам, позволяющим выделять фосфопротеины. Кроме того, предоставляются лучшие практики для надлежащего анализа и количественной оценки фосфопротеинов после западного блоттирования лизатов цельноклеточного белка. Эти методы, особенно в сочетании с фармакологическими ингибиторами и/или мышиными генетическими моделями, могут быть использованы для получения более глубокого понимания динамики и роли различных фосфопротеинов, активных во время черепно-лицевого развития.

Введение

Черепно-лицевое развитие млекопитающих представляет собой сложный морфологический процесс, в ходе которого несколько клеточных популяций координируются для создания фронтоназального скелета. У мышей этот процесс начинается в эмбриональный день (Е) 9,5 с образования фронтоназального протуберанца и пар верхнечелюстного и нижнечелюстного отростков, каждый из которых содержит постмигрирующие черепно-нервные гребневые клетки. Боковые и медиальные носовые процессы возникают из фронтоназального протуберанца с появлением носовых ямок и в конечном итоге сливаются с образованием ноздрей. Кроме того, медиальные носовые процессы и верхнечелюстные процессы сливаются с образованием верхней губы. Одновременно начинается палатогенез с образованием отчетливых выростов — вторичных небных полок — с ротовой стороны верхнечелюстных отростков при Е11,5. Со временем небные полки растут вниз по обе стороны языка, поднимаются в противоположное положение над языком и в конечном итоге сливаются на средней линии, образуя непрерывное небо, которое разделяет носовую и ротовую полости E16.51.

Эти морфологические изменения на протяжении всего черепно-лицевого развития инициируются и поддерживаются посредством различных сигнальных взаимодействий, которые часто включают фосфорилирование белка киназами. Например, рецепторы клеточной мембраны, такие как подсемейства трансформирующего фактора роста (TGF)-β рецепторов, включая костные морфогенетические белковые рецепторы (BMPR), и различные семейства рецепторов тирозинкиназы (RTK), автофосфорилируются при связывании лигандов и активации в клетках нервного гребня черепа 2,3,4 . Кроме того, Сглаженный трансмембранный рецептор, связанный с G-белком, фосфорилируется в клетках черепного нервного гребня и черепно-лицевой эктодерме после связывания лиганда Sonic hedgehog (SHH) с рецептором Patched1, что приводит к сглаженному накоплению на цилиарной мембране и активации пути SHH5. Такие лиганд-рецепторные взаимодействия могут происходить через аутокринную, паракринную и/или юкстакринную передачу сигналов в черепно-лицевом контексте. Например, известно, что BMP6 сигнализирует аутокринным способом во время дифференцировки хондроцитов6, тогда как фактор роста фибробластов (FGF) 8 экспрессируется в эктодерме глоточной дуги и связывается с членами семейства FGF RTK, выраженными в мезенхиме глоточной дуги паракринным образом, чтобы инициировать паттернирование и рост глоточных дуг7, 8,9,10. Кроме того, передача сигналов Notch активируется как в хондроцитах, так и в остеобластах во время развития черепно-лицевого скелета посредством юкстакринной сигнализации, когда трансмембранные дельта и/или зубчатые лиганды связываются с трансмембранными рецепторами Notch на соседних клетках, которые впоследствии расщепляются и фосфорилируются11. Тем не менее, существуют и другие пары лигандов и рецепторов, важные для черепно-лицевого развития, которые обладают гибкостью для функционирования как в аутокринной, так и в паракринной сигнализации. Например, во время морфогенеза зуба мышей было продемонстрировано, что тромбоцитарный фактор роста (PDGF)-AA лиганд сигнализирует аутокринным способом для активации RTK PDGFRα в эпителии12 эмалированного органа. Напротив, в мышиных лицевых процессах в середине беременности транскрипты, кодирующие лиганды PDGF-AA и PDGF-CC, экспрессируются в черепно-лицевой эктодерме, в то время как рецептор PDGFRα экспрессируется в подлежащей мезенхиме, полученной из черепного нервного гребня, в результате чего паракрин сигнализирует 13,14,15,16,17 . Независимо от сигнального механизма, эти события фосфорилирования рецепторов часто приводят к набору адапторных белков и/или сигнальных молекул, которые часто фосфорилируются сами по себе, чтобы инициировать каскады внутриклеточной киназы, такие как митоген-активированный протеинкиназный путь (MAPK)18,19.

Концевые внутриклеточные эффекторы этих каскадов могут затем фосфорилировать массив субстратов, таких как факторы транскрипции, РНК-связывающие, цитоскелетные и внеклеточные матриксные белки. Runx220, Hand121, Dlx3/5 22,23,24, Gli1-3 25 и Sox926 относятся к числу факторов транскрипции, фосфорилированных в контексте черепно-лицевого развития. Эта посттрансляционная модификация (PTM) может непосредственно влиять на восприимчивость к альтернативным PTM, димеризацию, стабильность, расщепление и/или сродство связывания ДНК, среди других видов деятельности 20,21,25,26. Кроме того, РНК-связывающий белок Srsf3 фосфорилируется в контексте черепно-лицевого развития, что приводит к его ядерной транслокации27. В целом, было показано, что фосфорилирование РНК-связывающих белков влияет на их субклеточную локализацию, белково-белковые взаимодействия, связывание РНК и/или специфичность последовательности28. Кроме того, фосфорилирование актомиозина может привести к цитоскелетным перестройкам на протяжении всего черепно-лицевого развития29,30, а фосфорилирование белков внеклеточного матрикса, таких как небольшие интегрин-связывающие лиганд N-связанные гликопротеины, способствует биоминерализации во время развития скелета31. Из приведенных выше и многих других примеров очевидно, что существуют широкие последствия для фосфорилирования белка во время черепно-лицевого развития. Добавляя дополнительный уровень регуляции, фосфорилирование белка дополнительно модулируется фосфатазами, которые противодействуют киназам, удаляя фосфатные группы.

Эти события фосфорилирования как на уровне рецептора, так и на уровне эффекторной молекулы имеют решающее значение для распространения сигнальных путей и в конечном итоге приводят к изменениям в экспрессии генов в ядре, стимулируя специфические клеточные активности, такие как миграция, пролиферация, выживание и дифференцировка, которые приводят к правильному формированию лица млекопитающих. Учитывая контекстную специфичность белковых взаимодействий с киназами и фосфатазами, результирующие изменения в ПТМ и их влияние на активность клеток, крайне важно, чтобы эти параметры были изучены в физиологически значимых условиях, чтобы получить полное представление о вкладе событий фосфорилирования в черепно-лицевое развитие. Здесь приведены примеры двух контекстов, в которых изучаются фосфорилирование белков и, таким образом, активация сигнальных путей во время черепно-лицевого развития млекопитающих: лицевые процессы мыши, в частности верхнечелюстные процессы E11.5, и культивируемые эмбриональные клетки небной мезенхимы мыши, полученные из вторичных небных полок E13.5 - как первичных32 , так и увековеченных33 . При E11.5 верхнечелюстные отростки находятся в процессе слияния с боковыми и медиальными носовыми отростками1, тем самым представляя собой критическую временную точку во время черепно-лицевого развития мыши. Кроме того, здесь были выбраны верхнечелюстные процессы и клетки, полученные из небных полок, потому что последние структуры являются производными первых, тем самым предоставляя исследователям возможность исследовать фосфорилирование белка in vivo и in vitro в смежных контекстах. Однако этот протокол также применим к альтернативным процесскам лица и временным точкам развития.

Критическая проблема в изучении фосфорилированных белков заключается в том, что они легко дефосфорилируются во время выделения белка обильными фосфатазами окружающей среды. Для преодоления этого барьера обсуждаются адаптации и модификации стандартных лабораторных методов, позволяющих выделять фосфорилированные белки. Кроме того, предоставляется передовая практика для надлежащего анализа и количественной оценки фосфорилированных белков. Эти методы, особенно в сочетании с фармакологическими ингибиторами и/или мышиными генетическими моделями, могут быть использованы для получения более глубокого представления о динамике и роли различных сигнальных путей, активных во время черепно-лицевого развития.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры с участием животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Медицинского кампуса Университета Колорадо Аншутц и выполнены в соответствии с институциональными руководящими принципами и правилами. Для сбора эмбрионов использовали самок мышей 129S4 в возрасте 1,5-6 месяцев, размещенных при субтермнейтральной температуре 21-23 °C. Схематический рабочий процесс протокола представлен на рисунке 1. В Таблице материалов приведена подробная информация обо всех материалах, оборудовании, программном обеспечении, реагентах и животных, используемых в этом протоколе.

1. Сбор эмбрионов мышей E11.5

  1. Усыплите беременную самку мыши через 11,5 дней после обнаружения влагалищной пробки во время временного спаривания в камере CO2 с использованием одобренного IACUC скорости потока CO2 , необходимой для примерно 50% смещения (2,95 л / мин в 360 в3 камере) и продолжительности воздействия (см. Таблицу материалов). Выполняют вывих шейки матки как вторичный метод эвтаназии. Немедленно приступайте к рассечению.
  2. Положите тело мыши на рассекательную доску вентральной стороной вверх. Опрыскивайте брюшко мыши 70% этанолом.
  3. Откройте брюшную полость, защемляя и поднимая кожу спереди к влагалищному отверстию с помощью прямых щипцов Семкена и разрезая приподнятую кожу и нижележащие слои с помощью хирургических ножниц с прямым лезвием под углом 45 ° с обеих сторон, чтобы создать форму «V», которая распространяется на каждую боковую поверхность примерно на полпути между передними конечностями и задними конечностями.
  4. Используя щипцы Семкена, захватите один из рогов матки и срежьте хирургическими ножницами ниже яйцевода и над шейкой матки. Отрежьте мезометрий, чтобы обеспечить полное удаление рога матки.
  5. Перенесите рассеченный рог матки на 10 мл гистологического фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) [0,137 M NaCl, 2,68 мМ KCl, 1,76 мМ KH2PO4 моноосновного, 10,14 мМ Na2HPO4 двухосновного, рН 7,4] в чашку Петри 10 см.
  6. Удалите второй рог матки на противоположной стороне брюшной полости, используя ту же процедуру, описанную в шагах 1.4-1.5.
  7. Поместите 10 см чашку Петри, содержащую оба маточных рога, на лед, если не приступайте сразу к рассечению отдельных эмбрионов (т. Е. Если вторая самка мыши будет рассечена).
  8. Под рассекающим стереомикроскопом тщательно рассекните каждый эмбрион из рогов матки тонкими щипцами Дюмона No5. Медленно оттягивайте миометрий, децидууа и хорион. Разорвите и удалите относительно прозрачный амнион, окружающий эмбрион, и разорвите пуповину, соединяющую эмбрион с плацентой.
  9. Перенесите каждый рассеченный эмбрион на 2,5 мл гистологической PBS в индивидуальную лунку из 12-луночной клеточной культуральной пластины на льду с помощью разрезанной пластиковой переносной пипетки или ложки для эмбрионов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с пометом, который может содержать эмбрионы более одного генотипа, сохраните амнион, окружающий каждый эмбрион, для генотипирования, поместив каждый из них в свою собственную предварительно маркированную микроцентрифужную трубку объемом 0,5 мл на льду.

2. Рассечение верхнечелюстных отростков из эмбрионов мышей E11.5

  1. Приготовьте три 10 см чашки Петри, содержащие 10 мл гистологического PBS, и держите их на льду для использования при вращении между эмбрионами.
  2. Перенесите один эмбрион из индивидуального колодца 12-луночной пластины для культивирования клеток в одну из 10-сантиметровых чашек Петри с гистологической PBS на льду с помощью разрезанной пластиковой переносной пипетки или ложки для эмбрионов.
  3. Под рассекающим микроскопом отделите каждый верхнечелюстной процесс от лица с помощью тонких щипцов. Сначала разрезают переднюю сторону одного верхнечелюстного отростка вдоль естественного углубления, разделяющего боковой носовой отросток и верхнечелюстной отросток (рисунок 2А).
  4. Во-вторых, разрезайте заднюю сторону верхнечелюстного отростка вдоль естественного углубления, разделяющего верхнечелюстной отросток и нижнечелюстной отросток (рисунок 2А).
  5. В-третьих, чтобы полностью отделить верхнечелюстной отросток, сделайте вертикальный разрез от передней до задней стороны верхнечелюстного отростка на глазной стороне верхнечелюстного отростка, где естественные углубления, упомянутые выше, заканчиваются (рисунок 2A-C).
  6. Повторите эти три разреза для верхнечелюстного отростка на противоположной стороне лица.
  7. Используя 9-дюймовую пипетку Пастера с небольшой латексной колбой объемом 2 мл, перенесите рассеченную пару верхнечелюстных отростков и небольшую каплю приблизительно 30 мкл гистологического PBS в меченую 35-миллиметровую чашку Петри на льду (рисунок 2D).
  8. Выполните шаги 2.3-2.7 для каждого эмбриона, вращая три 10-сантиметровые чашки Петри, содержащие гистологию PBS на льду между эмбрионами. Поместите отдельные пары рассеченных верхнечелюстных отростков в отдельные 35 мм чашки Петри на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отделение эктодермы верхнечелюстного отростка и мезенхимы (этапы 2.9-2.17) может быть выполнено после рассечения верхнечелюстных отростков всех эмбрионов в подстилке. Если желательны интактные верхнечелюстные отростки, содержащие как эктодерму, так и мезенхиму, перейдите к шагу 2.18 ниже.
  9. Готовят 250 мкл свежего 2% трипсина в культуре тканей PBS и 250 мкл 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) в культуре тканей PBS и хранят на льду.
  10. Поместите вторую, небольшую каплю примерно 30 мкл 2% трипсина в 35-миллиметровую чашку Петри отдельно от первой, небольшой капли гистологического PBS, содержащего верхнечелюстные отростки. Переведите пару верхнечелюстных отростков в маленькую каплю 2% трипсина с помощью пипетки Пастера (рисунок 2D).
  11. Инкубировать блюдо на льду в течение 15 мин.
  12. Извлеките 35-миллиметровую чашку Петри изо льда и поместите под рассекающий микроскоп.
  13. Используя тонкие щипцы, медленно и осторожно стягивайте слой эктодермы с каждого верхнечелюстного отростка (рисунок 2Е).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если эктодерма не отделяется от мезенхимы в неповрежденном листе, инкубируйте в 2% трипсина при комнатной температуре (RT) в течение дополнительного 5 мин перед продолжением разделения. Если ткань начинает распадаться в 2% трипсина, переместите верхнечелюстные отростки на 10% FBS, как описано ниже, чтобы нейтрализовать трипсин и закончить отделение эктодермы и мезенхимы.
  14. Как только эктодерма верхнечелюстного отростка и мезенхима разделены (рисунок 2F), перенесите желаемые ткани из пары верхнечелюстных отростков в третью, небольшую каплю примерно 30 мкл 10% FBS - отдельно от двух предыдущих мелких капель - с помощью пипетки Пастера (рисунок 2D).
  15. Поместите 35-миллиметровую чашку Петри на лед, чтобы остановить трипсинизацию.
  16. Инкубируют ткани верхнечелюстного процесса на льду в 10% FBS в течение 1-2 мин, а затем переносят ткани из обоих верхнечелюстных отростков в четвертую, небольшую капельку примерно 30 мкл предварительно охлажденной гистологии PBS на льду - отдельно от трех предыдущих мелких капель - с помощью пипетки Пастера (рисунок 2D).
  17. Инкубируют ткани верхнечелюстного процесса в гистологии PBS в течение 1 мин, осторожно закручивая гистологический PBS вокруг тканей верхнечелюстного отростка кончиком пипетки Пастера, чтобы гарантировать, что все FBS смывается с ткани.
  18. Перенесите пару тканей верхнечелюстного процесса в меченую микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл на льду с помощью пипетки Пастера, минимизируя перенос гистологии PBS. Удалите все излишки гистологической PBS в микроцентрифужной трубке объемом 1,5 мл с помощью пипетки Пастера.
  19. Следуйте приведенным выше шагам, чтобы рассечь верхнечелюстные отростки от каждого эмбриона в помете.
  20. Немедленно обработайте образцы, чтобы выделить лизаты цельноклеточного белка (ниже) или хранить при -80 °C в течение длительного времени. Перед длительным хранением заморозьте микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл в ванне со 100% EtOH на сухом льду в течение 5 минут.

3. Выделение лизатов цельноклеточного белка из верхнечелюстных процессов мыши

  1. Если верхнечелюстные отростки ранее замерзали при -80 °С, разморозьте их на льду.
  2. Добавьте 0,1 мл ледяного буфера лизиса NP-40 (20 мМ Tris HCl pH 8, 150 мМ NaCl, 10% глицерина, 1% Nonidet P-40, 2 мМ ЭДТА; хранить при 4 °C) с ингибиторами протеазы и фосфатазы (1x полный коктейль ингибитора мини-протеазы [растворенный в воде; хранящийся при -20 °C], 1 мМ PMSF [растворенный в изопропаноле; хранящийся при 4 °C], 10 мМ NaF [хранить при -20 °C; избегать замораживания/оттаивания], 1 мМ Na3VO4 [хранить при -20 °C], 25 мМ β-глицерофосфата [хранить при 4 °C]), добавляемого непосредственно перед использованием на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фракционирование клеток может быть выполнено альтернативно для выделения цитоплазматических, ядерных, мембранных или митохондриальных белковых фракций.
  3. Пипетка вверх и вниз 10 раз с помощью пипетмана 200 мкл.
  4. Вихрь в течение 10 с, а затем пипетка вверх и вниз 10 раз с пипетманом 200 мкл. Избегайте образования пузырьков.
  5. Инкубировать при 4 °C в течение 2 ч, вращая конец за концом, используя весло 1,5 мл / 2 мл с трубчатым револьвером.
  6. Центрифугируйте образцы при 13 500 × г в течение 20 мин при 4 °C.
  7. Соберите супернатант в новую микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл на льду с пипетманом объемом 200 мл.
  8. Количественно оценить концентрацию белка с помощью набора для анализа белка, используя 10 мкл лизата белка + 10 мкл буфера лизиса NP-40 для экспериментальных образцов и 3-5 разведений бычьего сывороточного альбумина (фракция V) (BSA) в буфере лизиса NP-40 в диапазоне 0,25-2,0 мг / мл в качестве стандартов белка.
  9. Продолжайте электрофорез додецилсульфат-полиакриламидного геля натрия (SDS-PAGE) (этап 5) или быстро заморозьте оставшиеся лизаты на сухом льду и храните при -80 °C в течение длительного времени.

4. Выделение лизатов цельноклеточного белка из первичных и/или увековеченных клеток эмбриональной небной мезенхимы мыши (MEPM)

ПРИМЕЧАНИЕ: Выделение и культивирование первичных клеток MEPM из эмбрионов мышей E13.5 и увековеченных клеток MEPM были ранее описаны 32,33,34. Стимуляция клеток фактором роста (этапы 4.1-4.7) может быть выполнена до лизиса клеток. Если желательны нестимулированные клетки, перейдите к шагу 4.8 ниже.

  1. Аспирировать питательную среду [модифицированную среду Dulbecco Eagle's (DMEM) с 50 Ед/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина, 2 мМ L-глутамина, 10% FBS] из клеток MEPM при слиянии ~70% в чашке для культивирования клеток 6 см с помощью 5,75-дюймовой пипетки Пастера, прикрепленной к вакуумной системе.
  2. Промыть клетки 1 мл культуры тканей PBS.
  3. Добавьте 3 мл сывороточной голодной среды [DMEM с 50 Ед/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина, 2 мМ L-глутамина, 0,1% FBS], предварительно приготовленной на водяной бане с температурой 37 °C.
  4. Инкубировать при 37 °C и 5% CO2 в течение 23 ч.
  5. Замените среду для голодания сыворотки 3 мл свежей, предварительно приготовленной среды для голодания сыворотки.
  6. Инкубировать при 37 °C и 5% CO2 в течение 1 ч.
  7. Стимулируют клетки с помощью фактора роста выбора в эмпирически определенной концентрации в течение желаемого периода времени.
  8. Аспирировать среду из ячеек MEPM при 80%-100% слиянии с помощью 5,75-дюймовой пипетки Пастера, прикрепленной к вакуумной системе.
  9. Дважды промыть клетки ледяной культурой тканей PBS (1 мл для чашки для культивирования клеток 6 см); наклоните пластину в сторону во время последней промывки, чтобы убедиться, что вся культура тканей PBS аспирирована.
  10. Лизируйте клетки путем добавления ледяного буфера лизиса NP-40 с ингибиторами протеазы и фосфатазы, добавленными непосредственно перед использованием (0,1 мл для чашки для культуры клеток 6 см) на льду.
  11. Инкубируйте плиту на льду в течение 5 минут с вращением примерно каждые минуты, чтобы обеспечить полное покрытие плиты.
  12. Соскоблите ячейки с пластины с помощью предварительно охлажденного подъемника клеток и перенесите клеточную суспензию в предварительно охлажденную микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл на льду.
  13. Инкубируйте клеточную суспензию при 4 °C в течение 30 мин, вращая конец за концом, используя весло 1,5 мл / 2 мл с трубчатым револьвером.
  14. Перейдите к шагам 3.6-3.9, описанным выше.

5. Вестерн-блоттинг лизатов цельноклеточного белка из лицевых процессов мыши и/или клеток MEPM для фосфопротеинов

  1. Подготовьте образцы лизата цельноклеточного белка для SDS-PAGE.
    1. Определить количество белка, подлежащего загрузке, в зависимости от обилия белка в ткани/клетке; 12,5 мкг обычно достаточно для надежно экспрессируемых белков в лизатах цельноклеточных белков.
    2. Добавьте равный объем 2x буфера Laemmli [20% глицерина, 4% SDS, 0,004% бромфенола синего, 0,125 M Tris HCl pH 6,8] с 10% β-меркаптоэтанола, добавленного непосредственно перед использованием.
      ВНИМАНИЕ: β-меркаптоэтанол является коррозионным для кожи или глаз, токсичен, опасен при проглатывании и обладает водной токсичностью. Наденьте перчатки, лабораторное пальто, лицевой щиток и защитные очки в химическом вытяжном капюшоне. Утилизируйте в соответствии с руководящими принципами гигиены и безопасности окружающей среды.
    3. Перемешивать путем вихря.
    4. Нагревайте образцы при 100 °C в течение 5 минут в мини-сухой ванне.
    5. Перемешайте путем вихря и поместите образцы на лед.
    6. Центрифуга при 9 400 × г в течение 5 мин при 4 °C.
    7. Поместите образцы ненадолго на лед перед загрузкой в гель SDS-PAGE или храните при -20 °C в течение длительного времени.
  2. Выполняют SDS-PAGE с использованием ячейки электрофореза с 4%-15% сборным белковым гелем и буфером35 электрофореза.
  3. Электротрансферите белки на мембрану поливинилиденфторида (PVDF) с использованием буфера переноса с 0%-20% метанола (0%-10% для белков более 100 кДа; 20% для белков менее 100 кДа), добавленного непосредственно перед применением35.
  4. Блокируйте мембрану и зонд для интересующих фосфопротеинов.
    1. После переноса промывайте мембрану 1x трис-буферным физиологическим раствором (TBS) [20 мМ Tris, 0,137 M NaCl, рН 7,6] в течение 5 мин в вестерн-блот-боксе.
    2. Инкубируют мембрану в 5 мл блокирующего буфера [1x TBS, 0,1% Tween 20, 5% w/v BSA; хорошо перемешивают и фильтруют через шприцевой фильтр 25 мм с порами 0,2 мкм с использованием шприца 10 мл с наконечником люера] в течение 1 ч в западной блоточной коробке с перемешиванием на орбитальном шейкере.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте молоко в качестве блокирующего агента при характеристике фосфопротеинов, поскольку оно содержит фосфопротеин казеин, который может вызвать высокий, неспецифический фоновый сигнал.
    3. Промывайте мембрану три раза в течение 5 мин каждый в TBS-T [1x TBS, 0,1% Tween 20] в вестерн-блот-боксе с перемешиванием на орбитальном шейкере.
    4. Инкубируют мембрану в 5 мл первичного антитела, разбавленного в блокирующем буфере при 4 °C в течение ночи в конической трубке объемом 50 мл с использованием весла 50 мл с трубчатым револьвером.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к техническому описанию антител для получения соответствующей концентрации для вестерн-блоттинга.
    5. Промыть мембрану три раза при РТ в течение 5 мин каждый в TBS-T в вестерн-блот-боксе с перемешиванием на орбитальном шейкере.
    6. Инкубируют мембрану в 5 мл соответствующей пероксидазы хрена (HRP)-конъюгированного вторичного антитела, разбавленного в блокирующем буфере в течение 1 ч в западной блот-боксе с перемешиванием на орбитальном шейкере.
    7. Промыть мембрану три раза в течение 5 мин каждый в TBS-T в вестерн-блот-боксе с перемешиванием на орбитальном шейкере.
    8. Инкубируйте мембрану в усиленной хемилюминесцентной (ECL) западной блоттинговой подложке [смешивание равных объемов из бутылок 1 и 2; по 0,5 мл каждой для больших (8,6 см х 6,7 см) мембран] в течение 1 мин, гарантируя, что вся мембрана постоянно подвергается воздействию западного блоттингового субстрата ECL.
    9. Слейте мембрану избыточного ECL западного блоттингового субстрата и немедленно развивайте с помощью хемилюминесцентного тепловизора.
  5. Снимите мембрану и повторно прозондите для общего белка, представляющего интерес.
    1. Поместите мембрану PVDF в прозрачный мешочек с полиэтиленовой подкладкой, содержащий 5 мл буфера для зачистки [2% SDS, 62,5 мМ Tris HCl pH 6,8] с 8 мкл/мл β-меркаптоэтанола, добавленного непосредственно перед использованием.
    2. Инкубировать при 50 °C в течение 30 мин с раскачиванием в гибридизационной печи со скоростью 11 оборотов в минуту.
    3. Промыть мембрану три раза при РТ в течение 5 мин каждый в TBS-T в вестерн-блот-боксе с перемешиванием на орбитальном шейкере.
    4. Перейдите к этапам 5.4.2-5.4.9, описанным выше.
  6. Количественно оцените плотность полосы вестерн-блот с помощью программного обеспечения ImageJ, нормализовав уровни фосфорилированного белка, представляющего интерес, до уровней общего белка, представляющего интерес36.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

При попытке охарактеризовать фосфорилирование белков, выделенных из лицевых процессов мыши и / или культивируемых клеток небной мезенхимы, репрезентативные результаты в идеале выявят отчетливую, воспроизводимую полосу после западного блоттинга антифосфопротеиновым антителом, которое проходит на высоте или около высоты соответствующей общей белковой полосы (рисунок 3). ). Однако, если происходит обширное фосфорилирование белка, может наблюдаться небольшой сдвиг вверх фосфопротеиновой полосы п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Протокол, описанный здесь, позволяет исследователям исследовать критические сигнальные события, зависящие от фосфорилирования, во время черепно-лицевого развития надежным и воспроизводимым образом. В этом протоколе есть несколько важных шагов, которые обеспечивают надлежащий сбор данных и анализ результатов. Независимо от того, выделяют ли фосфопротеины из лицевых процессов мышей и / или культивируемых клеток небной мезенхимы, крайне важно двигаться быстро и эффективно, сохраняя все реагенты и материалы на льду, когда эт...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мыши 129S4 были подарком от доктора Филиппа Сориано, Медицинской школы Икана на горе Синай. Эта работа была поддержана средствами Национальных институтов здравоохранения (NIH)/Национального института стоматологических и черепно-лицевых исследований (NIDCR) R01 DE027689 и K02 DE028572 для K.A.F., F31 DE029976 для M.A.R. и F31 DE029364 для B.J.C.D.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Equipment
Block для мини-сухой ванныResearch Products International Corp400783
системой визуализации ChemiDoc XRS+ с программным обеспечением Image LabBio-Rad1708265хемилюминесцентным тепловизором
CO2 инкубатором, воздушной рубашкойVWR10810-902
Disculting доска, 11 x 13 вFisher Scientific09 002 12
Электрофорезная ячейка, 4-гель, для мини сборных гелей с мини-транс-блоттинговым модулемBio-Rad1658030
Гибридизационная печьFisher ScientificUVP95003001
Микроцентрифуга 5415 D с ротором F45-24-11 (Eppendorf)Sigma AldrichZ604062
Мини сухая ваннаИсследовательские продукты International Corp400780
Орбитальный шейкерVWR89032-092
pH-метрVWR89231-662
Блок питания для SDS-PAGEBio-Rad1645050
Прямоугольная сковорода для льда, макси 9 лFisher Scientific07-210-093
Стереомикроскоп Stemi 508 со стойкой K LAB, LED кольцевой светильникZeiss4350649020000000препарирующий микроскоп
ТаймерVWR62344-641
Трубчатый револьверFisher Scientific11 676 341
Вихревой смесительFisher Scientific02 215 414
Водяная баняVWR89501-472
Западный блот-боксFisher ScientificNC9358182
<сильный> Материалы
Чашки для клеточных культур, 6 смFisher Scientific12-565-95
Тарелки для клеточных культур, 12 лунокFisher Scientific07-200-82
Клеточные лифтерыFisher Scientific08-100-240
CO2AirgasCD USP50
Конические трубки, полипропилен, 50 mLFisher Scientific05-539-13
Тонкие щипцы Dumont #5Fine Science Tools11254-20
Ложка для эмбрионовFine Science Tools10370-17
Микроцентрифужные пробирки, 0,5 млVWR89000-010
Микроцентрифужные пробирки, 1,5 млVWR20170-038
Пастерская пипетка, 5,75"Fisher Scientific13-678-6A
Пастер пипетка, 9"VWR14672-380
Чашки Петри, 10 смFisher Scientific08-757-100D
Чашки Петри, 35 ммFisher ScientificFB0875711YZ
Подсумки, прозрачные, полиэтиленовая подкладкаFisher Scientific01-812-25B
PVDF мембранаFisher Щипцы ScientificIPVH00010
SemkenFine Science Tools11008-13
Маленькая латексная луковица, 2 млVWR82024-554
Хирургические ножницыFine Science Tools14002-12
Шприцевой фильтр, 25 мм, 0,2 шт; m размер порFisher Scientific09-740-108
Шприц с наконечником Люэра, 10 млVWRBD309604
Передаточная пипеткаFisher Scientific13-711-22
Рычаг открытия западной блот-кассетыBio-Rad4560000
Ватман 3MM хр хроматографическая бумагаFisher Scientific05-714-5
Реагенты
4-15% сборные протеиновые гели, 10-луночные, 30 и микро; LBio-Rad4561083
&бета;-глицерофосфат динатриевая соль гидратSigma AldrichG5422-25Gстоковая концентрация 1 M
&бета;-меркаптоэтанолSigma AldrichM3148-100ML
Бычий сывороточный альбумин, фракция V, испытан на тепловой шокFisher ScientificBP1600-100
Бромфенол синийFisher Scientific
Полный мини коктейль ингибиторов протеазыSigma Aldrich11836153001стоковой концентрации 25x
набор для анализа белка DC IIBio-Rad500-0112
DMEM, высокий уровень глюкозыGibco11965092
E7, мышиное моноклональное бета-тубулин первичное антитело, концентрат 0,1 млИсследования развития Hybridoma BankE71:1,000
ECL западный блоттинговый субстратFisher ScientificPI32106низкий пикограммный диапазон
ECL западный блоттинговый субстратGenesee Scientific20-302Bнизкий диапазон фемтограмм
Буфер для электрофореза, 5 лBio-Rad1610772стоковой концентрации 10x
Этанол, 200 proof, 1 галлонDecon Laboratories, Inc.2705HCEtOH
этилендиаминтетрауксусная кислота, дигидрат соли Di Na. (кристаллический поуд./электрофора.)Fisher ScientificBP120-500EDTA
Фетальная бычья сыворотка, охарактеризованная, происхождение из США, 500 млHyCloneSH30071,03
глицерина (сертифицированный ACS)Fisher ScientificG33-4
HRP-конъюгированное вторичное антитело, козье антимышиное антитело IgGJackson ImmunoResearch Laboratories115-035-1461:20 000
HRP-конъюгированное вторичное антитело, козье антикроличий IgGJackson ImmunoResearch Laboratories111-035-0031:20 000
Раствор соляной кислоты, 6N (сертифицированный)Fisher ScientificSA56-500HCl
Igepal Ca - 630 неионогенное моющее средствоFisher ScientificICN19859650Nonidet P-40
Изопропанол (ВЭЖХ)Fisher ScientificA451-1
L-глутаминGibco25030081стоковая концентрация 200 мМ
МетанолFisher ScientificA454-4
p44/42 MAPK (Erk1/2) первичное антителоCell Signaling Technology9102S1:1,000; анти-Erk1/2
PDGF-BB рекомбинантный лиганд, крысаFisher Scientific520BB050
PDGF рецептор &бета; первичное антителоТехнология клеточной сигнализации3169S1:1,000
Пенициллин-стрептомицинGibco15140122исходной концентрации 100 Ед/мл, 100 г/мл
фенилметансульфонилфторида, 99%Fisher ScientificAC215740100PMSF; стоковая концентрация 100 мМ
Фосфо-p44/42 MAPK (Erk1/2) первичное антителоТехнология клеточной сигнализации9101S1:1,000, антифосфо-Erk1/2
Фосфо-PDGF рецептор &альфа; /PDGF рецептор &бета; первичное антителоТехнология клеточной сигнализации3170S1:1,000
Хлорид калия (белые кристаллы)Fisher ScientificBP366-500KCl
Одноосновной фосфат калия (белые кристаллы)Fisher ScientificBP362-500KH2PO4
SDS раствор, 10%Bio-Rad161-0416
Sodium хлорид (кристаллический/биологический, сертифицированный)Fisher ScientificS671-3NaCl
Фторид натрия (порошок/сертифицированный ACS)Fisher ScientificS299-100NaF; аликвота для одноразового применения; исходная концентрация 1 М
Ортванадат натрия, 99%Fisher ScientificAC205330500Na<суб>3VO<суб>4; исходная концентрация 100 мМ
Натрия фосфат двухосновной безводный (гранулированный или порошкообразный/сертифицированный ACS)Fisher ScientificS374-500Na2HPO4
Tissue culture PBSFisher Scientific21-031-CV
Буфер для переноса, 5 лBio-Rad1610771исходной концентрацией 10x
трис-основание (белые кристаллы или кристаллический порошок/молекулярная биология)Fisher ScientificBP152-1
ТрипсинBioWorld21560033
Tween 20Fisher ScientificBP337-500
Western blot молекулярный маркер массыBio-Rad1610374
Software
ImageJ software NationalInstitutes of Health
Animals
Female 129S4 мышейдар доктора Филиппа Сориано, Медицинская школа Икана на горе Синай
AC403140050

Ссылки

  1. Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139 (2), 231-243 (2012).
  2. Chai, Y., Ito, Y., Han, J. TGF-beta signaling and its functional significance in regulating the fate of cranial neural crest cells. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14 (2), 78-88 (2003).
  3. Nie, X., Luukko, K., Kettunen, P. BMP signalling in craniofacial development. TheInternational Journal of Developmental Biology. 50 (6), 511-521 (2006).
  4. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Receptor tyrosine kinase signaling: regulating neural crest development one phosphate at a time. Current Topics in Developmental Biology. 111, 135-182 (2015).
  5. Xavier, G. M., et al. Hedgehog receptor function during craniofacial development. Developmental Biology. 415 (2), 198-215 (2016).
  6. Grimsrud, C. D., et al. BMP-6 is an autocrine stimulator of chondrocyte differentiation. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (4), 475-482 (1999).
  7. MacArthur, C. A., et al. FGF-8 isoforms activate receptor splice forms that are expressed in mesenchymal regions of mouse development. Development. 121 (11), 3603-3613 (1995).
  8. Tucker, A. S., Yamada, G., Grigoriou, M., Pachnis, V., Sharpe, P. T. Fgf-8 determines rostral-caudal polarity in the first branchial arch. Development. 126 (1), 51-61 (1999).
  9. Trumpp, A., Depew, M. J., Rubenstein, J. L., Bishop, J. M., Martin, G. R. Cre-mediated gene inactivation demonstrates that FGF8 is required for cell survival and patterning of the first branchial arch. Genes & Development. 13 (23), 3136-3148 (1999).
  10. Tabler, J. M., et al. Fuz mutant mice reveal shared mechanisms between ciliopathies and FGF-related syndromes. Developmental Cell. 25 (6), 623-635 (2013).
  11. Pakvasa, M., et al. Notch signaling: Its essential roles in bone and craniofacial development. Genes & Diseases. 8 (1), 8-24 (2021).
  12. Chai, Y., Bringas, P., Mogharei, A., Shuler, C. F., Slavkin, H. C. PDGF-A and PDGFR-alpha regulate tooth formation via autocrine mechanism during mandibular morphogenesis in vitro. Developmental Dynamics. 213 (4), 500-511 (1998).
  13. Morrison-Graham, K., Schatteman, G. C., Bork, T., Bowen-Pope, D. F., Weston, J. A. A PDGF receptor mutation in the mouse (Patch) perturbs the development of a non-neuronal subset of neural crest-derived cells. Development. 115 (1), 133-142 (1992).
  14. Orr-Urtreger, A., Lonai, P. Platelet-derived growth factor-A and its receptor are expressed in separate, but adjacent cell layers of the mouse embryo. Development. 115 (4), 1045-1058 (1992).
  15. Ding, H., et al. The mouse Pdgfc gene: dynamic expression in embryonic tissues during organogenesis. Mechanisms of Development. 96 (2), 209-213 (2000).
  16. Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).
  17. He, F., Soriano, P. A critical role for PDGFRalpha signaling in medial nasal process development. PLoS Genetics. 9 (9), 1003851(2013).
  18. Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 103 (2), 211-225 (2000).
  19. Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
  20. Kim, W. J., Shin, H. L., Kim, B. S., Kim, H. J., Ryoo, H. M. RUNX2-modifying enzymes: therapeutic targets for bone diseases. Experimental & Molecular Medicine. 52 (8), 1178-1184 (2020).
  21. Firulli, B. A., Firulli, A. B. Partially penetrant cardiac neural crest defects in Hand1 Phosphomutant mice: Dimer choice that is not so critical. Pediatric Cardiology. 40 (7), 1339-1344 (2019).
  22. Choi, Y. H., Choi, H. J., Lee, K. Y., Oh, J. W. Akt1 regulates phosphorylation and osteogenic activity of Dlx3. Biochemical and Biophysical Research Communications. 425 (4), 800-805 (2012).
  23. Jeong, H. M., et al. Akt phosphorylates and regulates the function of Dlx5. Biochemical and Biophysical Research Communications. 409 (4), 681-686 (2011).
  24. Seo, J. H., et al. Calmodulin-dependent kinase II regulates Dlx5 during osteoblast differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 384 (1), 100-104 (2009).
  25. Gou, Y., Zhang, T., Xu, J. Transcription factors in craniofacial development: From receptor signaling to transcriptional and epigenetic regulation. Current Topics in Developmental Biology. 115, 377-410 (2015).
  26. Schock, E. N., LaBonne, C. Sorting sox: Diverse roles for sox transcription factors during neural crest and craniofacial development. Frontiers in Physiology. 11, 606889(2020).
  27. Dennison, B. J. C., Larson, E. D., Fu, R., Mo, J., Fantauzzo, K. A. Srsf3 mediates alternative RNA splicing downstream of PDGFRalpha signaling in the facial mesenchyme. Development. 148 (14), (2021).
  28. Stamm, S. Regulation of alternative splicing by reversible protein phosphorylation. Journal of Biological Chemistry. 283 (3), 1223-1227 (2008).
  29. Szabo, A., Mayor, R. Mechanisms of neural crest migration. Annual Review of Genetics. 52, 43-63 (2018).
  30. Kindberg, A. A., Bush, J. O. Cellular organization and boundary formation in craniofacial development. Genesis. 57 (1), 23271(2019).
  31. Faundes, V., et al. Raine syndrome: an overview. European Journal of Medical Genetics. 57 (9), 536-542 (2014).
  32. Bush, J. O., Soriano, P. Ephrin-B1 forward signaling regulates craniofacial morphogenesis by controlling cell proliferation across Eph-ephrin boundaries. Genes & Development. 24 (18), 2068-2080 (2010).
  33. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Generation of an immortalized mouse embryonic palatal mesenchyme cell line. PLoS One. 12 (6), 0179078(2017).
  34. Goering, J. P., Isai, D. G., Czirok, A., Saadi, I. Isolation and time-lapse imaging of primary mouse embryonic palatal mesenchyme cells to analyze collective movement attributes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e62151(2021).
  35. JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. Science Education Database. , Cambridge, MA. (2022).
  36. Miller, L. Analyzing gels and western blots with ImageJ. , Available from: https://lukemiller.og/index.php/2010/11/analyzing-gels-and-western-blots-with-images-j/ (2010).
  37. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PI3K-mediated PDGFRalpha signaling regulates survival and proliferation in skeletal development through p53-dependent intracellular pathways. Genes & Development. 28 (9), 1005-1017 (2014).
  38. Wang, Y., et al. Rapid alteration of protein phosphorylation during postmortem: implication in the study of protein phosphorylation. Scientific Reports. 5, 15709(2015).
  39. Sharma, S. K., Carew, T. J. Inclusion of phosphatase inhibitors during Western blotting enhances signal detection with phospho-specific antibodies. Analytical Biochemistry. 307 (1), 187-189 (2002).
  40. Bass, J. J., et al. An overview of technical considerations for Western blotting applications to physiological research. Scandinavian Journal of Medicine & Science in Sports. 27 (1), 4-25 (2017).
  41. Hooper, J. E., et al. Systems biology of facial development: contributions of ectoderm and mesenchyme. Developmental Biology. 426 (1), 97-114 (2017).
  42. Childs, C. B., Proper, J. A., Tucker, R. F., Moses, H. L. Serum contains a platelet-derived transforming growth factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (17), 5312-5316 (1982).
  43. Swaisgood, H. E. Review and update of casein chemistry. Journal of Dairy Science. 76 (10), 3054-3061 (1993).
  44. Silva, J. M., McMahon, M. The fastest Western in town: a contemporary twist on the classic Western blot analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (84), e51149(2014).
  45. Salinovich, O., Montelaro, R. C. Reversible staining and peptide mapping of proteins transferred to nitrocellulose after separation by sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. Analytical Biochemistry. 156 (2), 341-347 (1986).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Выделение лизатов цельноклеточного белка из процессов лица мыши и культивируемых клеток небной мезенхимы для анализа фосфопротеинов
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.