Здесь представлен протокол с высокой пропускной способностью для измерения данных о росте, включая кривые роста, темпы роста и максимальные темпы роста. Протокол был проверен и валидирован с использованием двух бактерий, продуцирующих биопленку. Результаты и подход, примененные в этом исследовании, могут быть распространены на другие протоколы с высокой пропускной способностью с использованием считывателей микропланшетов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Повышенная воспроизводимость и точность высокопроизводительной количественной оценки данных о росте бактерий с помощью считывателя микропланшетов
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Это исследование было направлено на разработку воспроизводимого, надежного, высокопроизводительного протокола для мониторинга роста бактерий в 96-луночных планшетах и анализа максимальной скорости роста. Определены кривые роста и максимальные темпы роста двух видов бактерий. Были исследованы такие проблемы, как (i) конденсация крышки, (ii) коррекция длины пути, (iii) размер инокуляции, (iv) временной интервал отбора проб и (v) пространственное смещение. Повторяемость протокола оценивалась с помощью трех независимых технических повторений со стандартным отклонением 0,03 между прогонами. Максимальные темпы роста Bacillus mycoides и Paenibacillus tundrae составили (среднее значение ± SD) 0,99 ч−1 ± 0,03 ч−1 и 0,85 ч−1 ± 0,025 ч−1 соответственно. Эти бактерии сложнее контролировать оптически из-за их склонности к слипанию. Это исследование демонстрирует критическую важность размера инокуляции, коррекции длины пути, нагрева крышки, временных интервалов отбора проб и пространственного смещения скважинной пластины для получения надежных, точных и воспроизводимых данных на микропланшетах. Разработанный протокол и этапы его верификации могут быть расширены на другие методы с использованием микропланшетных ридеров и протоколов с высокой пропускной способностью, что снижает врожденные ошибки исследователей и материальные затраты.
Введение
Растущий интерес к мультиомиксным манипуляциям, включая исследования механизмов и метаболизма бактерий, подчеркивает важность высокопроизводительных и автоматизированных методов, таких как запись данных о росте 1,2. Данные о росте, включающие кинетические параметры, такие как максимальные темпы роста, могут помочь охарактеризовать реакцию бактерий на различные физические, химические и антибактериальные условия. Данные о темпах роста являются стандартной переменной отклика, используемой для выявления потенциальных связей генотип и фенотипы1 или указания на....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги в этом протоколе должны выполняться в стерильных условиях (т.е. между двумя огнями или в шкафу биобезопасности). Все материалы и инструменты подвергаются автоклавированию в течение 20 минут. Подробные сведения обо всех материалах, оборудовании и программном обеспечении, используемых в этом протоколе, см. в Таблице материалов . Руки в перчатках дезинфицируют, хранят влажными дезинфицирующим средством для рук или 70% спиртовым раствором не менее 1 минуты, после чего не вынимают из защитного шкафа. В противном случае процедуру дезинфекции необходимо повторить перед тем, как вернуть руки обратно в защитный шкаф. ВНИМАНИЕ: Перед исполь....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Валидация показаний OD и поправочный коэффициент длины пути
Разделенные образцы культуры B. mycoides были взяты в разные моменты времени и измерены с помощью считывателя микропланшетов и спектрофотометра (рис. 1A). Этот шаг был предпринят для проверки результатов на различных устройствах. Данные по наружному диаметру600 коррелировали, но не совпадали (рисунок 1B). Корреляция была линейной с наклоном 0,55 (95% доверительный.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Считыватели микропланшетов позволяют получать стабильные и повторяемые темпы роста. Эта технология сводит к минимуму человеческие ошибки и обеспечивает высокопроизводительный отбор проб. Небольшое количество культуры, необходимое для каждого образца, делает этот подход привлекательной и недорогой альтернативой подсчету клеток с помощью колб или пробирок. Считыватели микропланшетов позволяют использовать образцы большого размера, увеличивая статистическую мощность и, следовательно, облегч.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.
Благодарности
Эта работа была профинансирована Советом по естественным наукам и инженерным исследованиям (NSERC) / Кафедрой промышленных исследований в области водных ресурсов Галифакса в области качества и очистки воды (грант No. IRCPJ 349838-16). Коллектив авторов также выражает признательность Аните Тейлор за помощь в рецензировании этой статьи.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Центрифуга | Eppendorf | 5810 R | |
| Центрифужные пробирки - 15 мл | ThermoFisher- Научный | 339650 | Пробирки стерильные |
| - 50 мл | ThermoFisher- Научный | 339652 | Стерильная |
| одноразовая петля для инокуляции, 10 & микро; Л Коул-Пармер | UZ-06231-08 | Колбы | |
| Эрленмейера стерильные - 250 мл | Коул-Пармер | УЗ-34502-59 | Стекло |
| Изопропанол | ThermoFisher- Научный | 396982500 | ≥ 99.0 |
| Фосфатный буфер солевой раствор | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Наконечники Pipett 1,000 &микро; L | ThermoFisher- Научный | UZ-25001-76 | |
| Наконечники Пипетта 10 мл | ThermoFisher- Научный | UZ-25001-83 | |
| Наконечники Pipett 200 & микро; L | ThermoFisher- Научный | UZ-25001-85 | |
| Наконечники Пипетта 5 мл | ThermoFisher- Научный | UZ-25001-80 | |
| Пипетка 1,000 & микро; Л Коул-Пармер | UZ-07909-11 | ||
| Пипетка 10 мл | Cole-Parmer | UZ-07909-15 | |
| Пипетка 200 и микро; Л Коул-Пармер | UZ-07909-09 | ||
| Пипетка 5 мл | Коул-Пармер | UZ-07859-30 | |
| Триптический соевый бульон | Millipore | 22091 | подходит для микробиологии |
Ссылки
- Reuß, D. R., et al. Large-scale reduction of the Bacillus subtilis genome: Consequences for the transcriptional network, resource allocation, and metabolism. Genome Research. 27 (2), 289-299 (2017).
- Sparkes, A., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
