Молекулярные и иммунологические методы в генетически модифицированной мышиной модели стромальной опухоли желудочно-кишечного тракта

Summary

Целью данной рукописи является описание мышиной модели Kit^V558Δ/+ и методов успешного вскрытия и обработки образцов мышей.

Abstract

Стромальная опухоль желудочно-кишечного тракта (GIST) является наиболее распространенной саркомой человека и, как правило, обусловлена одной мутацией в рецепторе KIT. Для различных типов опухолей были разработаны многочисленные мышиные модели, чтобы исследовать следующее поколение методов лечения рака. Однако в GIST в большинстве исследований in vivo используются мышиные модели ксенотрансплантата, которые имеют присущие им ограничения. Здесь мы описываем иммунокомпетентную, генетически модифицированную мышиную модель стромальной опухоли желудочно-кишечного тракта, содержащую мутацию Kit^V558Δ/+ . В этой модели мутантный KIT, онкоген, ответственный за большинство ГИСТ, управляется его эндогенным промотором, приводящим к GIST, который имитирует гистологический вид и иммунный инфильтрат, наблюдаемый в ГИСТ человека. Кроме того, эта модель была успешно использована для исследования как целевой молекулярной, так и иммунной терапии. Здесь мы описываем разведение и содержание колонии мышей Kit^V558Δ/+ . Кроме того, в этой статье подробно описывается лечение и закупка GIST, дренирование брыжеечного лимфатического узла и прилегающей слепой кишки у мышей Kit^V558Δ/+ , а также подготовка образцов для молекулярного и иммунологического анализа.

Introduction

GIST является наиболее распространенной саркомой у людей с заболеваемостью около 6000 случаев в Соединенных Штатах Америки¹. GIST, по-видимому, происходит из клеток желудочно-кишечного кардиостимулятора, называемых интерстициальными клетками Cajal, и обычно обусловлен одной мутацией в тирозинкиназе KIT или PDGFRA². Хирургия является основой лечения GIST и может быть лечебной, но пациенты с прогрессирующим заболеванием могут лечиться ингибитором тирозинкиназы (TKI), иматинибом. С момента своего появления более 20 лет назад иматиниб трансформировал парадигму лечения в GIST, улучшив выживаемость при запущенном заболевании с 1 до более чем 5 лет ^3,4,5. К сожалению, иматиниб редко излечивается из-за приобретенных мутаций KIT, поэтому для этой опухоли необходимы новые методы лечения.

Мышиные модели являются важным исследовательским инструментом в исследовании новых методов лечения рака. Несколько моделей подкожных ксенотрансплантатов и ксенотрансплантатов, полученных от пациента, были разработаны и исследованы в GIST ^6,7. Тем не менее, иммунодефицитные мыши не в полной мере представляют GIST человека, поскольку GIST имеют дифференциальные иммунные профили в зависимости от их онкогенной мутации, а изменение микроокружения опухоли желудочно-кишечного тракта улучшает эффекты терапии TKI ^8,9. Мышь Kit^V558Δ/+ имеет гетерозиготную делецию зародышевой линии в Kit exon 11, которая кодирует домен juxtamembrane, наиболее часто мутировавший сайт в человеческом GIST¹⁰. У мышей Kit^V558Δ/+ развивается один слепой GIST со 100% пенетранцией, а опухоли имеют аналогичную гистологию, молекулярную сигнализацию, иммунную инфильтрацию и ответ на терапию, как и человеческий GIST 8,11,12,13. Здесь мы описываем разведение, обработку, выделение и обработку образцов на мышах Kit^V558Δ/+ для использования в молекулярных и иммунологических исследованиях в GIST.

Protocol

Все мыши были размещены в условиях, свободных от патогенов, в Университете Пенсильвании в соответствии с руководящими принципами NIH и с одобрения Университета Пенсильвании IACUC. Эвтаназия проводилась в соответствии со стандартными операционными процедурами Университета Пенсильвании по лабораторным животным.

1. Комплект^V558Δ/+ разведение мышей

1. Перекрещивайте мыши Kit^V558Δ/+ более 10 раз на фоне C57BL/6J с помощью мышей C57BL/6J. Для этого разводят самцов мышей Kit^V558Δ/+ с самками мышей C57BL/6J в соотношении 1:2.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Гомозиготный генотип комплекта^{V558Δ/V558Δ} смертелен внутриутробно. Можно разводить самок мышей Kit^V558Δ/+ с самцами мышей C57BL/6J, но размер помета примерно вдвое меньше, чем у самок мышей дикого типа C57BL/6J. Кроме того, самки мышей Kit^V558Δ/+ производят ограниченные пометы после 4-месячного возраста.
2. Генотип детенышей в возрасте 7-14 дней путем обрезания пальцев ног для подтверждения наличия генотипа Kit^V558Δ/+ . Используйте прямую грунтовку: TCTCCTCCAGAAACCCATGTATGAA; докладчик 1: CCTCGACAACCTTCCA; реверсивная грунтовка: TTGCGTCGGGTCTATGTAAACAT; и докладчик 2: TCTCCTCGACCTTCCA для генотипирования.

2. Комплект^V558Δ/+ для обработки мыши

1. Возраст и пол соответствуют мышам Kit^V558Δ/+до начала лечения. Используйте мышей, соответствующих возрасту и полу, в когортах, поскольку опухоли у самок мышей Kit^V558Δ/+ больше, чем у самцов мышей. Лечите мышей в возрасте 8-12 недель, когда опухоли устанавливаются (рисунок 1).
2. Вводят ингибиторы тирозинкиназы перорально или путем внутрибрюшинной (в..) инъекции; Опухоли Kit^V558Δ/+ чувствительны к ингибиторам тирозинкиназы. Вводят иматиниб в дозе 600 мг/л в питьевую воду или в/в инъекции по 45 мг/кг два раза в день. Измерьте снижение массы опухоли с помощью цифровых весов после рассечения опухоли, как показано на этапе 3, что составляет примерно 50% через 1 неделю и 80% через 4 недели после лечения иматинибом (рисунок 2).

3. Комплект^V558Δ/+ мышиное извлечение органов

1. Усыпляют мышей наркозом_CO2 со скоростью потока 60% объема камеры в минуту. Оставьте мышей в камере не менее чем на 2 мин после прекращения дыхания, затем выполните вывих шейки матки для подтверждения смерти.
2. Стерилизуйте все инструменты, носите перчатки на протяжении всей процедуры и поддерживайте стерильное поле. Подготовьте кожу 70% этанолом. Сделайте вертикальный разрез средней линии 2 см с помощью ножниц и войдите в брюшную полость. Резко лизируют любые внутрибрюшные спайки.
3. Чтобы удалить дренажный брыжеечный лимфатический узел, выполните действия, описанные ниже.
   1. Определите слепую кишку и поднимите ее брыжейку выше. Примерно на полпути к основанию брыжейки толстой кишки определите брыжеечный лимфатический узел и резко рассекните его. Лимфатический узел белый и размером около 0,5 см х 0,5 см.
   2. Разделите ткань лимфатических узлов на трети для выделения белка, гистологии и одноклеточной суспензии, по мере необходимости. Для одноклеточных суспензий поместите ткань лимфатических узлов в 20 мл свободной среды сыворотки (RPMI) и держите на льду.
4. Для выделения GIST и слепой кишки выполните действия, описанные ниже.
   1. Слепая кишка в мышах Kit^V558Δ/+ в основном заменяется GIST. Осторожно отделите илеоколическое соединение от основания опухоли. Чтобы собрать слепую кишку, снова разделите толстую кишку, на 2 см проксимально к основанию опухоли.
   2. У 50%-60% мышей Kit^V558Δ/+ головка опухоли содержит колпачок ткани слепой кишки, который обычно содержит серозную жидкость, но редко может содержать гной (рисунок 3). Резко рассекните ткань колпачка от опухолевой ткани.
   3. Разделите опухолевую ткань и / или слепую кишку на трети для выделения белка, гистологии и одноклеточной суспензии, по мере необходимости. Для одноклеточных суспензий поместите опухолевую ткань или слепую кишку в HBSS с 2% FCS, достаточно, чтобы покрыть образец и держать на льду.

4. Вестерн-блоттинг ткани GIST

1. Готовят буфер лизиса тканей, содержащий 50 мМ TrisHCl (рН 7,5), 150 мМ NaCl, 5 мМ ЭДТА, 1% неденатурирующее детергент, 2 мМ Na₃VO₄, 1 мМ PMSF, 10 мМ NaF и 20 мкл/мл смеси ингибиторов протеиназы.
2. Приготовьте 1x Tris-буферный физиологический раствор с 1% Tween 20 (TBST), объединив 1800 мл деионизированной воды, 2 мл Tween 20 и 200 мл 10x Tris-буферного физиологического раствора (TBS).
3. Повторное суспендирование ткани со стадии 3.4.3 в пробирке FACS в 5 мл/г буфера лизиса ткани и гомогенизация дважды с помощью механического гомогенизатора при 15 000 об/мин в течение 15 с на льду. Инкубировать лизат в течение 30 мин на льду.
4. Перенесите лизат в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл. Центрифуга на максимальной скорости в течение 20 мин при 4 °C. Перенесите супернатант в новую микроцентрифужную трубку.
5. Запустите лизаты на градиентном геле от 4% до 15%, затем переведите на нитроцеллюлозную мембрану, как описано в¹⁴.
6. Промыть мембрану один раз в 1x TBS в течение 5 мин, а затем блокировать мембрану в 5% молоке в течение 1 ч. Снова промыть мембрану один раз в 1x TBS в течение 10 мин.
7. Инкубировать мембрану в первичном антителе разбавляют 1:1000 в 5% BSA при 4 °C в течение ночи. Промыть мембрану 3x в 1x TBST в течение 10 мин каждая. Инкубировать блот вторичным антителом разводят 1:2500 в 2,5% молоке в течение 1 ч при комнатной температуре.
8. Промывайте мембрану один раз в 1x TBS в течение 5 мин. Добавьте достаточное количество подложки HRP для покрытия мембраны, обычно 200-500 мкл, и используйте цифровой тепловизор для обнаружения и количественной оценки хемилюминесценции.

5. Иммуногистохимия ткани GIST

1. Зафиксируйте ткань со стадии 3.3.2 или 3.4.3 в 4% параформальдегиде при 4 °C в течение ночи. Храните ткань в 70% EtOH до готовности к обработке. Встраивание и секционирование блоков толщиной 5 мкм на стеклянные слайды, как описано^15,16.
2. Полное иммуногистохимическое обнаружение с использованием базового иммунодетекционного набора, как описано ранее¹⁷.

6. Одноклеточная суспензия брыжеечного лимфатического узла

1. Налейте rpmI-среду образцом лимфатических узлов с этапа 3.3.2 на фильтр 100 мкм. Переместите фильтр на новый конический и мешанный лимфатический узел объемом 50 мл с мягким концом пластикового шприца объемом 3 мл. Промывочный фильтр с 20 мл среды RPMI.
2. Центрифугировать фильтрат при 450 х г при 4 °C в течение 5 мин. Аспирировать супернатанта.
3. Повторно суспендировать гранулы в 20 мл 1% FBS в PBS (шариковый буфер) и вылить на фильтр 40 мкм. Соберите фильтрат клеток. Подсчитывайте клетки с помощью гемоцитометра.
4. Центрифугировать фильтрат при 450 х г при 4 °C в течение 5 мин. Аспирировать супернатанта. Повторное суспендирование в буфере бусин при 6 x 10⁷ клетках/мл для проточной цитометрии.

7. Одноклеточная суспензия GIST

1. Приготовьте буфер коллагеназы, добавив 250 мг коллагеназы IV, одну таблетку ингибитора протеазы без ЭДТА и 100 мкл ДНКазы I до 50 мл HBSS. Вращать в течение 10 мин при комнатной температуре до растворения.
2. Поместите GIST в стерильную посуду и добавьте 2,5 мл коллагеназного буфера. Измельчите опухоль с помощью стерильного скальпеля и ножниц до тех пор, пока опухоль не окажется в мелких фрагментах. Используйте большую пипетку, чтобы аспирировать опухоль и коллагеназу в трубку объемом 50 мл.
3. Инкубировать в встряхивающемся инкубаторе при 100 об/мин при 37 °С в течение 30 мин. Реакция закалки с 2 мл FBS.
4. Налейте коллагеназу с образцом GIST на фильтр 100 мкм и разомните опухоль мягким концом пластикового шприца объемом 3 мл и соберите в пробирку объемом 50 мл. Промывочный фильтр с 20 мл HBSS. Центрифугировать фильтрат при 450 х г, 4 °C в течение 5 мин. Аспирировать супернатанта.
5. Повторно суспендируйте гранулу в 20 мл шарикового буфера и перелейте фильтр 40 мкм. Соберите фильтрат и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Центрифугировать фильтрат при 450 х г, 4 °C в течение 5 мин. Аспирировать супернатанта. Повторное суспендирование в буфере бусин при 6 x 10⁷ клетках/мл для проточной цитометрии.

8. Одноклеточная суспензия слепой кишки

1. Подготовьте буфер коллагеназы, как показано в шаге 7.1. С помощью ножниц расщелите слепую кишку продольно, чтобы обнажить внутреннюю слизистую оболочку. Разрезать на участки по 0,5 см и поместить в трубку объемом 50 мл с 5 мл HBSS с 2% FBS. Энергично встряхните в течение 30 с, центрифугу при 450 х г в течение 20 с, затем аспирируйте супернатант.
2. Добавьте 5 мл HBSS с 2 мМ ЭДТА. Инкубировать в встряхивающемся инкубаторе при 37 °C при 100 об/мин в течение 15 мин. Центрифуга при 450 х г в течение 20 с. Аспирировать супернатанта.
3. Добавить 5 мл HBSS. Энергично встряхните в течение 30 с, центрифугу при 450 х г в течение 20 с, затем аспирируйте супернатант. Повторите еще раз.
4. Добавьте 5 мл коллагеназного буфера. Инкубировать в встряхивающемся инкубаторе при 37 °C в течение 30 мин при 100 об/мин. Энергично встряхивать каждые 10 мин. Реакция закалки с 2 мл FBS.
5. Налейте коллагеназу с образцом слепой кишки на фильтр 100 мкм и разомните мягким концом пластикового шприца объемом 3 мл. Промывочный фильтр с 20 мл HBSS. Соберите фильтрат.
6. Центрифугировать фильтрат при 450 х г в течение 5 мин при 4 °C. Аспирировать супернатанта. Повторно суспендировать гранулы в 20 мл шарикового буфера и вылить на фильтр 40 мкм. Соберите фильтрат и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.
7. Центрифугировать фильтрат при 450 х г в течение 5 мин при 4 °C. Аспирировать супернатанта. Повторное суспендирование в буфере бусин при 6 x 10⁷ клетках/мл для проточной цитометрии.

Results

Модель мыши Kit^V558Δ/+ позволяет исследовать терапевтические средства в иммунокомпетентной мышиной модели. Мыши Kit^V558Δ/+ имеют среднюю продолжительность жизни 8 месяцев из-за прогрессирующей непроходимости кишечника (рисунок 4).. Опухоли у мышей Kit^V558Δ/+ экспрессируют канонические маркеры GIST, включая тирозинкиназу KIT и трансмембранный канал DOG1 (Рисунок ...

Discussion

Мышиная модель Kit^V558Δ/+ является мощным исследовательским инструментом в молекулярном и иммунологическом анализе GIST. Хотя стратегия разведения требует одного скрещивания, использование когорт мышей Kit^V558Δ/+ в экспериментах, анализирующих реакцию опухоли, требует обширного разведения. Мыши должны соответствовать возрасту и полу, чтобы обеспечить одинаковый вес опухоли, и 10% мышей умирают в возрасте до 8 недель, когда опухоли установлены. Менее обширные стратегии разведения во...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Фильтр 100 мкм	EMSCO	1194-2360
1x RBC лизис буфер	Life Technologies	00-4333-57
3мл шприц	Thermo Fisher Scientific/BD Biosciences	14823435
4– 15% Mini-PROTEAN TGX Преджионовые гели, 10-луночные, 30 и микро; l	Bio-Rad	4561083
4% раствор параформальдегида	Thermo Fisher Scientific	AAJ19943K2
40 микрон фильтр	EMSCO	1194-2340
5M NaCl	Sigma Aldrich	S6546
70 микрон фильтр	EMSCO	1194-2350
AKT антитело (C67E7)	Cell Signaling	4691
C57BL/6J мыши	The Jackson Laboratory
Collagenase IV	Sigma Aldrich	C5138
Complete mini edta Ингибитор свободной протеазы	Thomas Scientific	C852A34
Countess II Автоматизированный счетчик клеток	Thermo Fisher Scientific
Одноразовые скальпели	Thermo Fisher Scientific/Exel International	14-840-00
Dnase I	Thomas Scientific	C756V81
Dog1 антитело	abcam	ab64085
EDTA	Sigma Aldrich	E9884
ERK антитело (p44/42)	Cell Signaling	9102
FBS	Thomas Scientific	C788U23
программное обеспечение	FIJI		https://imagej.net/software/fiji
Гомогенизатор Fisherbrand 850	Thermo Fisher Scientific	15-340-169
HBSS	Университет Пенсильвании Клеточный центр
Иматиниб мезилат	Selleck Chemicals	S1026
KIT антитело (D13A2)	Клеточная сигнализация	3074
KitV558&дельта;/+ Генотипирование	Transnetyx
Микроцентрифужные пробирки (1,5 мл)	Thermo Fisher Scientific	05-408-129
Набор для иммунодетектирования мыши на мыши, Basic	Vector Laboratories	BMK-2202
, предварительно нарезанная, 0,45 &; m	Rio-Rad	1620145
обезжиренное сухое молоко	Thermo Fisher Scientific	NC9121673
заменитель Nonidet p 40 Sigma	Aldrich	74385
антитело p-AKT (S473)	Cell Signaling	4060
антитело p-ERK (p44/42)	Cell Signaling	9101
антитело p-KIT (Y719)	Cell Signaling	3391
Ингибитор протеазы PMSF	Thermo Fisher Scientific	36978
Проэйназа K	Thermo Fisher Scientific	BP170050
Тестовые пробирки из полистирола с круглым дном (FACS)	Falcon/Thermo Fisher Scientific	14-959-2A
RPMI	Университет Пенсильвании Клеточный центр
Фторид натрия (NaF)	Sigma Aldrich
Ортванадат натрия (Na3VO4)	Sigma Aldrich	S6508
SuperSignal West Dura Субстрат увеличенного срока действия	Thermo Fisher Scientific	34076
TBS буфер (10x)	Пенсильванского клеточного центра
(100 мм2)	Thermo Fisher Scientific/Falcon	08-772E
TrisHCL	Thermo Fisher Scientific	BP1757500
Tween 20	Rio-Rad	1706531
Платформа vivaCT 80	Scanco medical