Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Молекулярные и иммунологические методы в генетически модифицированной мышиной модели стромальной опухоли желудочно-кишечного тракта

2.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/63853

⸱

2 мая 2022 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Hospital of the University of Pennsylvania

В этой статье

Краткое содержание

Целью данной рукописи является описание мышиной модели KitV558Δ/+ и методов успешного вскрытия и обработки образцов мышей.

Аннотация

Стромальная опухоль желудочно-кишечного тракта (GIST) является наиболее распространенной саркомой человека и, как правило, обусловлена одной мутацией в рецепторе KIT. Для различных типов опухолей были разработаны многочисленные мышиные модели, чтобы исследовать следующее поколение методов лечения рака. Однако в GIST в большинстве исследований in vivo используются мышиные модели ксенотрансплантата, которые имеют присущие им ограничения. Здесь мы описываем иммунокомпетентную, генетически модифицированную мышиную модель стромальной опухоли желудочно-кишечного тракта, содержащую мутацию KitV558Δ/+ . В этой модели мутантный KIT, онкоген, ответственный за большинство ГИСТ, управляется его эндогенным промотором, приводящим к GIST, который имитирует гистологический вид и иммунный инфильтрат, наблюдаемый в ГИСТ человека. Кроме того, эта модель была успешно использована для исследования как целевой молекулярной, так и иммунной терапии. Здесь мы описываем разведение и содержание колонии мышей KitV558Δ/+ . Кроме того, в этой статье подробно описывается лечение и закупка GIST, дренирование брыжеечного лимфатического узла и прилегающей слепой кишки у мышей KitV558Δ/+ , а также подготовка образцов для молекулярного и иммунологического анализа.

Введение

GIST является наиболее распространенной саркомой у людей с заболеваемостью около 6000 случаев в Соединенных Штатах Америки1. GIST, по-видимому, происходит из клеток желудочно-кишечного кардиостимулятора, называемых интерстициальными клетками Cajal, и обычно обусловлен одной мутацией в тирозинкиназе KIT или PDGFRA2. Хирургия является основой лечения GIST и может быть лечебной, но пациенты с прогрессирующим заболеванием могут лечиться ингибитором тирозинкиназы (TKI), иматинибом. С момента своего появления более 20 лет назад иматиниб трансформировал парадигму лечения в GIST, улучшив выживаемость при запущенном заболевании с 1 до более чем 5 лет 3,4,5. К сожалению, иматиниб редко излечивается из-за приобретенных мутаций KIT, поэтому для этой опухоли необходимы новые методы лечения.

Мышиные модели являются важным исследовательским инструментом в исследовании новых методов лечения рака. Несколько моделей подкожных ксенотрансплантатов и ксенотрансплантатов, полученных от пациента, были разработаны и исследованы в GIST 6,7. Тем не менее, иммунодефицитные мыши не в полной мере представляют GIST человека, поскольку GIST имеют дифференциальные иммунные профили в зависимости от их онкогенной мутации, а изменение микроокружения опухоли желудочно-кишечного тракта улучшает эффекты терапии TKI 8,9. Мышь KitV558Δ/+ имеет гетерозиготную делецию зародышевой линии в Kit exon 11, которая кодирует домен juxtamembrane, наиболее часто мутировавший сайт в человеческом GIST10. У мышей KitV558Δ/+ развивается один слепой GIST со 100% пенетранцией, а опухоли имеют аналогичную гистологию, молекулярную сигнализацию, иммунную инфильтрацию и ответ на терапию, как и человеческий GIST 8,11,12,13. Здесь мы описываем разведение, обработку, выделение и обработку образцов на мышах KitV558Δ/+ для использования в молекулярных и иммунологических исследованиях в GIST.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все мыши были размещены в условиях, свободных от патогенов, в Университете Пенсильвании в соответствии с руководящими принципами NIH и с одобрения Университета Пенсильвании IACUC. Эвтаназия проводилась в соответствии со стандартными операционными процедурами Университета Пенсильвании по лабораторным животным.

1. КомплектV558Δ/+ разведение мышей

  1. Перекрещивайте мыши KitV558Δ/+ более 10 раз на фоне C57BL/6J с помощью мышей C57BL/6J. Для этого разводят самцов мышей KitV558Δ/+ с самками мышей C57BL/6J в соотношении 1:2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гомозиготный генотип комплектаV558Δ/V558Δ смертелен внутриутробно. Можно разводить самок мышей KitV558Δ/+ с самцами мышей C57BL/6J, но размер помета примерно вдвое меньше, чем у самок мышей дикого типа C57BL/6J. Кроме того, самки мышей KitV558Δ/+ производят ограниченные пометы после 4-месячного возраста.
  2. Генотип детенышей в возрасте 7-14 дней путем обрезания пальцев ног для подтверждения наличия генотипа KitV558Δ/+ . Используйте прямую грунтовку: TCTCCTCCAGAAACCCATGTATGAA; докладчик 1: CCTCGACAACCTTCCA; реверсивная грунтовка: TTGCGTCGGGTCTATGTAAACAT; и докладчик 2: TCTCCTCGACCTTCCA для генотипирования.

2. КомплектV558Δ/+ для обработки мыши

  1. Возраст и пол соответствуют мышам KitV558Δ/+до начала лечения. Используйте мышей, соответствующих возрасту и полу, в когортах, поскольку опухоли у самок мышей KitV558Δ/+ больше, чем у самцов мышей. Лечите мышей в возрасте 8-12 недель, когда опухоли устанавливаются (рисунок 1).
  2. Вводят ингибиторы тирозинкиназы перорально или путем внутрибрюшинной (в..) инъекции; Опухоли KitV558Δ/+ чувствительны к ингибиторам тирозинкиназы. Вводят иматиниб в дозе 600 мг/л в питьевую воду или в/в инъекции по 45 мг/кг два раза в день. Измерьте снижение массы опухоли с помощью цифровых весов после рассечения опухоли, как показано на этапе 3, что составляет примерно 50% через 1 неделю и 80% через 4 недели после лечения иматинибом (рисунок 2).

3. КомплектV558Δ/+ мышиное извлечение органов

  1. Усыпляют мышей наркозомCO2 со скоростью потока 60% объема камеры в минуту. Оставьте мышей в камере не менее чем на 2 мин после прекращения дыхания, затем выполните вывих шейки матки для подтверждения смерти.
  2. Стерилизуйте все инструменты, носите перчатки на протяжении всей процедуры и поддерживайте стерильное поле. Подготовьте кожу 70% этанолом. Сделайте вертикальный разрез средней линии 2 см с помощью ножниц и войдите в брюшную полость. Резко лизируют любые внутрибрюшные спайки.
  3. Чтобы удалить дренажный брыжеечный лимфатический узел, выполните действия, описанные ниже.
    1. Определите слепую кишку и поднимите ее брыжейку выше. Примерно на полпути к основанию брыжейки толстой кишки определите брыжеечный лимфатический узел и резко рассекните его. Лимфатический узел белый и размером около 0,5 см х 0,5 см.
    2. Разделите ткань лимфатических узлов на трети для выделения белка, гистологии и одноклеточной суспензии, по мере необходимости. Для одноклеточных суспензий поместите ткань лимфатических узлов в 20 мл свободной среды сыворотки (RPMI) и держите на льду.
  4. Для выделения GIST и слепой кишки выполните действия, описанные ниже.
    1. Слепая кишка в мышах KitV558Δ/+ в основном заменяется GIST. Осторожно отделите илеоколическое соединение от основания опухоли. Чтобы собрать слепую кишку, снова разделите толстую кишку, на 2 см проксимально к основанию опухоли.
    2. У 50%-60% мышей KitV558Δ/+ головка опухоли содержит колпачок ткани слепой кишки, который обычно содержит серозную жидкость, но редко может содержать гной (рисунок 3). Резко рассекните ткань колпачка от опухолевой ткани.
    3. Разделите опухолевую ткань и / или слепую кишку на трети для выделения белка, гистологии и одноклеточной суспензии, по мере необходимости. Для одноклеточных суспензий поместите опухолевую ткань или слепую кишку в HBSS с 2% FCS, достаточно, чтобы покрыть образец и держать на льду.

4. Вестерн-блоттинг ткани GIST

  1. Готовят буфер лизиса тканей, содержащий 50 мМ TrisHCl (рН 7,5), 150 мМ NaCl, 5 мМ ЭДТА, 1% неденатурирующее детергент, 2 мМ Na3VO4, 1 мМ PMSF, 10 мМ NaF и 20 мкл/мл смеси ингибиторов протеиназы.
  2. Приготовьте 1x Tris-буферный физиологический раствор с 1% Tween 20 (TBST), объединив 1800 мл деионизированной воды, 2 мл Tween 20 и 200 мл 10x Tris-буферного физиологического раствора (TBS).
  3. Повторное суспендирование ткани со стадии 3.4.3 в пробирке FACS в 5 мл/г буфера лизиса ткани и гомогенизация дважды с помощью механического гомогенизатора при 15 000 об/мин в течение 15 с на льду. Инкубировать лизат в течение 30 мин на льду.
  4. Перенесите лизат в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл. Центрифуга на максимальной скорости в течение 20 мин при 4 °C. Перенесите супернатант в новую микроцентрифужную трубку.
  5. Запустите лизаты на градиентном геле от 4% до 15%, затем переведите на нитроцеллюлозную мембрану, как описано в14.
  6. Промыть мембрану один раз в 1x TBS в течение 5 мин, а затем блокировать мембрану в 5% молоке в течение 1 ч. Снова промыть мембрану один раз в 1x TBS в течение 10 мин.
  7. Инкубировать мембрану в первичном антителе разбавляют 1:1000 в 5% BSA при 4 °C в течение ночи. Промыть мембрану 3x в 1x TBST в течение 10 мин каждая. Инкубировать блот вторичным антителом разводят 1:2500 в 2,5% молоке в течение 1 ч при комнатной температуре.
  8. Промывайте мембрану один раз в 1x TBS в течение 5 мин. Добавьте достаточное количество подложки HRP для покрытия мембраны, обычно 200-500 мкл, и используйте цифровой тепловизор для обнаружения и количественной оценки хемилюминесценции.

5. Иммуногистохимия ткани GIST

  1. Зафиксируйте ткань со стадии 3.3.2 или 3.4.3 в 4% параформальдегиде при 4 °C в течение ночи. Храните ткань в 70% EtOH до готовности к обработке. Встраивание и секционирование блоков толщиной 5 мкм на стеклянные слайды, как описано15,16.
  2. Полное иммуногистохимическое обнаружение с использованием базового иммунодетекционного набора, как описано ранее17.

6. Одноклеточная суспензия брыжеечного лимфатического узла

  1. Налейте rpmI-среду образцом лимфатических узлов с этапа 3.3.2 на фильтр 100 мкм. Переместите фильтр на новый конический и мешанный лимфатический узел объемом 50 мл с мягким концом пластикового шприца объемом 3 мл. Промывочный фильтр с 20 мл среды RPMI.
  2. Центрифугировать фильтрат при 450 х г при 4 °C в течение 5 мин. Аспирировать супернатанта.
  3. Повторно суспендировать гранулы в 20 мл 1% FBS в PBS (шариковый буфер) и вылить на фильтр 40 мкм. Соберите фильтрат клеток. Подсчитывайте клетки с помощью гемоцитометра.
  4. Центрифугировать фильтрат при 450 х г при 4 °C в течение 5 мин. Аспирировать супернатанта. Повторное суспендирование в буфере бусин при 6 x 107 клетках/мл для проточной цитометрии.

7. Одноклеточная суспензия GIST

  1. Приготовьте буфер коллагеназы, добавив 250 мг коллагеназы IV, одну таблетку ингибитора протеазы без ЭДТА и 100 мкл ДНКазы I до 50 мл HBSS. Вращать в течение 10 мин при комнатной температуре до растворения.
  2. Поместите GIST в стерильную посуду и добавьте 2,5 мл коллагеназного буфера. Измельчите опухоль с помощью стерильного скальпеля и ножниц до тех пор, пока опухоль не окажется в мелких фрагментах. Используйте большую пипетку, чтобы аспирировать опухоль и коллагеназу в трубку объемом 50 мл.
  3. Инкубировать в встряхивающемся инкубаторе при 100 об/мин при 37 °С в течение 30 мин. Реакция закалки с 2 мл FBS.
  4. Налейте коллагеназу с образцом GIST на фильтр 100 мкм и разомните опухоль мягким концом пластикового шприца объемом 3 мл и соберите в пробирку объемом 50 мл. Промывочный фильтр с 20 мл HBSS. Центрифугировать фильтрат при 450 х г, 4 °C в течение 5 мин. Аспирировать супернатанта.
  5. Повторно суспендируйте гранулу в 20 мл шарикового буфера и перелейте фильтр 40 мкм. Соберите фильтрат и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Центрифугировать фильтрат при 450 х г, 4 °C в течение 5 мин. Аспирировать супернатанта. Повторное суспендирование в буфере бусин при 6 x 107 клетках/мл для проточной цитометрии.

8. Одноклеточная суспензия слепой кишки

  1. Подготовьте буфер коллагеназы, как показано в шаге 7.1. С помощью ножниц расщелите слепую кишку продольно, чтобы обнажить внутреннюю слизистую оболочку. Разрезать на участки по 0,5 см и поместить в трубку объемом 50 мл с 5 мл HBSS с 2% FBS. Энергично встряхните в течение 30 с, центрифугу при 450 х г в течение 20 с, затем аспирируйте супернатант.
  2. Добавьте 5 мл HBSS с 2 мМ ЭДТА. Инкубировать в встряхивающемся инкубаторе при 37 °C при 100 об/мин в течение 15 мин. Центрифуга при 450 х г в течение 20 с. Аспирировать супернатанта.
  3. Добавить 5 мл HBSS. Энергично встряхните в течение 30 с, центрифугу при 450 х г в течение 20 с, затем аспирируйте супернатант. Повторите еще раз.
  4. Добавьте 5 мл коллагеназного буфера. Инкубировать в встряхивающемся инкубаторе при 37 °C в течение 30 мин при 100 об/мин. Энергично встряхивать каждые 10 мин. Реакция закалки с 2 мл FBS.
  5. Налейте коллагеназу с образцом слепой кишки на фильтр 100 мкм и разомните мягким концом пластикового шприца объемом 3 мл. Промывочный фильтр с 20 мл HBSS. Соберите фильтрат.
  6. Центрифугировать фильтрат при 450 х г в течение 5 мин при 4 °C. Аспирировать супернатанта. Повторно суспендировать гранулы в 20 мл шарикового буфера и вылить на фильтр 40 мкм. Соберите фильтрат и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.
  7. Центрифугировать фильтрат при 450 х г в течение 5 мин при 4 °C. Аспирировать супернатанта. Повторное суспендирование в буфере бусин при 6 x 107 клетках/мл для проточной цитометрии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Модель мыши KitV558Δ/+ позволяет исследовать терапевтические средства в иммунокомпетентной мышиной модели. Мыши KitV558Δ/+ имеют среднюю продолжительность жизни 8 месяцев из-за прогрессирующей непроходимости кишечника (рисунок 4).. Опухоли у мышей KitV558Δ/+ экспрессируют канонические маркеры GIST, включая тирозинкиназу KIT и трансмембранный канал DOG1 (Рисунок ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Мышиная модель KitV558Δ/+ является мощным исследовательским инструментом в молекулярном и иммунологическом анализе GIST. Хотя стратегия разведения требует одного скрещивания, использование когорт мышей KitV558Δ/+ в экспериментах, анализирующих реакцию опухоли, требует обширного разведения. Мыши должны соответствовать возрасту и полу, чтобы обеспечить одинаковый вес опухоли, и 10% мышей умирают в возрасте до 8 недель, когда опухоли установлены. Менее обширные стратегии разведения во...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Благодарности

Мыши KitV558Δ/+ были генетически модифицированы и совместно использовались доктором Питером Бесмером10. Эта работа была поддержана грантами NIH R01 CA102613 и T32 CA251063.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Фильтр 100 мкмEMSCO1194-2360
1x RBC лизис буферLife Technologies00-4333-57
3мл шприцThermo Fisher Scientific/BD Biosciences14823435
4– 15% Mini-PROTEAN TGX Преджионовые гели, 10-луночные, 30 и микро; lBio-Rad4561083
4% раствор параформальдегидаThermo Fisher ScientificAAJ19943K2
40 микрон фильтрEMSCO1194-2340
5M NaClSigma AldrichS6546
70 микрон фильтрEMSCO1194-2350
AKT антитело (C67E7)Cell Signaling4691
C57BL/6J мышиThe Jackson Laboratory
Collagenase IVSigma AldrichC5138
Complete mini edta Ингибитор свободной протеазыThomas ScientificC852A34
Countess II Автоматизированный счетчик клетокThermo Fisher Scientific
Одноразовые скальпелиThermo Fisher Scientific/Exel International14-840-00
Dnase IThomas ScientificC756V81
Dog1 антителоabcamab64085
EDTASigma AldrichE9884
ERK антитело (p44/42)Cell Signaling9102
FBSThomas ScientificC788U23
программное обеспечениеFIJIhttps://imagej.net/software/fiji
Гомогенизатор Fisherbrand 850Thermo Fisher Scientific15-340-169
HBSSУниверситет Пенсильвании Клеточный центр
Иматиниб мезилатSelleck ChemicalsS1026
KIT антитело (D13A2)Клеточная сигнализация3074
KitV558&дельта;/+ ГенотипированиеTransnetyx
Микроцентрифужные пробирки (1,5 мл)Thermo Fisher Scientific05-408-129
Набор для иммунодетектирования мыши на мыши, BasicVector LaboratoriesBMK-2202
, предварительно нарезанная, 0,45 &; mRio-Rad1620145
обезжиренное сухое молокоThermo Fisher ScientificNC9121673
заменитель Nonidet p 40 SigmaAldrich74385
антитело p-AKT (S473)Cell Signaling4060
антитело p-ERK (p44/42)Cell Signaling9101
антитело p-KIT (Y719)Cell Signaling3391
Ингибитор протеазы PMSFThermo Fisher Scientific36978
Проэйназа KThermo Fisher ScientificBP170050
Тестовые пробирки из полистирола с круглым дном (FACS)Falcon/Thermo Fisher Scientific14-959-2A
RPMIУниверситет Пенсильвании Клеточный центр
Фторид натрия (NaF)Sigma Aldrich
Ортванадат натрия (Na3VO4)Sigma AldrichS6508
SuperSignal West Dura Субстрат увеличенного срока действияThermo Fisher Scientific34076
TBS буфер (10x)Пенсильванского клеточного центра
(100 мм2)Thermo Fisher Scientific/Falcon08-772E
TrisHCLThermo Fisher ScientificBP1757500
Tween 20Rio-Rad1706531
  Платформа vivaCT 80Scanco medical
Нитроцеллюлозная мембрана 201154Чашка для культуры тканей

Ссылки

  1. Mastrangelo, G., et al. Incidence of soft tissue sarcoma and beyond: a population-based prospective study in 3 European regions. Cancer. 118 (21), 5339-5348 (2012).
  2. Joensuu, H., DeMatteo, R. P. The management of gastrointestinal stromal tumors: a model for targeted and multidisciplinary therapy of malignancy. Annual Review of Medicine. 63, 247-258 (2012).
  3. Blanke, C. D., et al. Long-term results from a randomized phase II trial of standard- versus higher-dose imatinib mesylate for patients with unresectable or metastatic gastrointestinal stromal tumors expressing KIT. Journal of Clinical Oncology. 26 (4), 620-625 (2008).
  4. Demetri, G. D., et al. Efficacy and safety of regorafenib for advanced gastrointestinal stromal tumours after failure of imatinib and sunitinib (GRID): an international, multicentre, randomised, placebo-controlled, phase 3 trial. Lancet. 381 (9863), 295-302 (2013).
  5. Gold, J. S. Outcome of metastatic GIST in the era before tyrosine kinase inhibitors. Annals of Surgical Oncology. 14 (1), 134-142 (2007).
  6. Huynh, H., et al. Sorafenib induces growth suppression in mouse models of gastrointestinal stromal tumor. Molecular Cancer Therapeutics. 8 (1), 152-159 (2009).
  7. Na, Y. S., et al. Establishment of patient-derived xenografts from patients with gastrointestinal stromal tumors: analysis of clinicopathological characteristics related to engraftment success. Scientific Reports. 10 (1), 7996(2020).
  8. Balachandran, V. P., et al. Imatinib potentiates antitumor T cell responses in gastrointestinal stromal tumor through the inhibition of Ido. Nature Medicine. 17 (9), 1094-1100 (2011).
  9. Vitiello, G. A., et al. Differential immune profiles distinguish the mutational subtypes of gastrointestinal stromal tumor. Journal of Clinical Investigation. 129 (5), 1863-1877 (2019).
  10. Sommer, G., et al. Gastrointestinal stromal tumors in a mouse model by targeted mutation of the Kit receptor tyrosine kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6706-6711 (2003).
  11. Cavnar, M. J., et al. KIT oncogene inhibition drives intratumoral macrophage M2 polarization. Journal of Experimental Medicine. 210 (13), 2873-2886 (2013).
  12. Medina, B. D., et al. Oncogenic kinase inhibition limits Batf3-dependent dendritic cell development and antitumor immunity. Journal of Experimental Medicine. 216 (6), 1359-1376 (2019).
  13. Zhang, J. Q., et al. Macrophages and CD8(+) T cells mediate the antitumor efficacy of combined CD40 ligation and imatinib therapy in gastrointestinal stromal tumors. Cancer Immunology Research. 6 (4), 434-447 (2018).
  14. General Protocol for Western Blotting. , Available from: https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Buttetin_6376.pdf (2022).
  15. Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks. Biobanking: Methods and Protocols. , Springer. New York. 253-268 (2019).
  16. Sy, J., Ang, L. -C. Microtomy: Cutting formalin-fixed, paraffin-embedded sections. Biobanking: Methods and Protocols. , Springer. New York. 269-278 (2019).
  17. Seifert, A. M., et al. PD-1/PD-L1 blockade enhances T-cell activity and antitumor efficacy of imatinib in gastrointestinal stromal tumors. Clinical Cancer Research. 23 (2), 454-465 (2017).
  18. Liu, M., et al. Oncogenic KIT modulates Type I IFN-mediated antitumor immunity in GIST. Cancer Immunology Research. 9 (5), 542-553 (2021).
  19. Rossi, F., et al. Oncogenic Kit signaling and therapeutic intervention in a mouse model of gastrointestinal stromal tumor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (34), 12843-12848 (2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Генетически модифицированные мышииммунокомпетентная модель мышикит-мутациямикроокружение опухолипроточная цитометриясуспензия одиночных клетоквыделение белковингибиторы тирозинкиназыдиссекция опухоли
Молекулярные и иммунологические методы в генетически модифицированной мышиной модели стромальной опухоли желудочно-кишечного тракта
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.