Method Article

Усовершенствование визуализации вирусных сборок с высоким разрешением в жидкости и льду

DOI:

10.3791/63856

⸱

July 20th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Pennsylvania State University, 2Department of Materials Science and Engineering, McMaster University, 3Bioinformatics and Genomics Graduate Program, Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 4Molecular, Cellular, and Integrative Biosciences Graduate Program, Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 5Materials Research Institute, Pennsylvania State University, 6Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 7Applications team, Direct Electron, 8Application Scientist, Protochips, Inc., 9Department of Biology, Wake Forest University

* These authors contributed equally

In This Article

Retraction Notice

This article, Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice, has been retracted at the request of the Editors-in-Chief due to concerns about the integrity of the data presented. These concerns included: (a) Figure 3 was found to contain noise without structural features expected for a protein capsid; (b) critical half-map data necessary to verify resolution claims were not deposited; (c) there was a lack of system logs or controls to rule out stage drift regarding observed movements in Figure 3; and (d) the absence of protocols to address Brownian motion and beam-induced drift significantly weakened the reliability of the findings.<br/><br/>The corresponding author's indication she principally relied on RMEASURE program did not sufficiently address the publisher's concerns. After consulting external experts, the Editors-in-Chief concluded that the issues remain unresolved, and the data do not meet JoVE's standards for scientific reliability and reproducibility, requiring retraction. The corresponding author disagrees with the grounds for retraction. Co-authors DiCecco, Grandfield and Bator agree with the retraction. Other co-authors were unavailable for comment.

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь описаны протоколы для подготовки вирусных сборок, пригодных для жидкостно-ЭМ и крио-ЭМ анализа на наноуровне с использованием просвечивающей электронной микроскопии.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Интерес к жидкостно-электронной микроскопии (liquid-EM) резко возрос в последние годы, поскольку ученые теперь могут наблюдать процессы в режиме реального времени на наноуровне. Крайне желательно сочетать крио-ЭМ-информацию высокого разрешения с динамическими наблюдениями, так как многие события происходят в быстрых временных масштабах - в миллисекундном диапазоне или быстрее. Улучшенные знания о гибких структурах также могут помочь в разработке новых реагентов для борьбы с новыми патогенами, такими как SARS-CoV-2. Что еще более важно, просмотр биологических материалов в жидкой среде дает уникальное представление об их производительности в организме человека. Здесь представлены недавно разработанные методы исследования наноразмерных свойств вирусных сборок в жидком и стекловидном льду. Для достижения этой цели в качестве модельных систем использовались четко определенные образцы. Представлены параллельные сравнения методов пробоподготовки и репрезентативной структурной информации. Субнанометровые особенности показаны для структур, разрешенных в диапазоне ~3,5-Å-10 Å. Другие недавние результаты, которые поддерживают эту дополнительную структуру, включают динамическое понимание кандидатов на вакцину и терапии на основе антител, изображенной в жидкости. В целом, эти коррелятивные приложения повышают нашу способность визуализировать молекулярную динамику, обеспечивая уникальный контекст для их использования в здоровье человека и болезнях.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Биомедицинские исследования улучшают наше понимание здоровья человека и болезней путем разработки новых технологий. Визуализация с высоким разрешением трансформирует наш взгляд на наномир, позволяя нам изучать клетки и молекулы в мельчайших деталях 1,2,3,4,5. Статическая информация о динамических компонентах, таких как мягкие полимеры, белковые сборки или человеческие вирусы, показывает лишь ограниченный снимок их сложного повествования. Чтобы лучше понять, как работают молекулярные объекты, их структура и функция должны быть совместно исследованы.

Последние достижения в производстве таких материалов, как атомарно тонкий графен или микрочипы на основе кремния, предоставляют новые возможности для анализа структуры и функции в режиме реального времени с использованием просвечивающих электронных микроскопов (TEM). Эти материалы могут создавать герметично закрытые камеры для живой ЭМ-визуализации 6,7,8,9,10,11. Новое поле жидкости-ЭМ, комнатная температура коррелирует с крио-ЭМ, обеспечивает беспрецедентные представления твердых или мягких материалов в растворе, позволяя ученым одновременно изучать структуру и динамику их образца. Приложения Liquid-EM включают записи в реальном времени терапевтических наночастиц, взаимодействующих с раковыми стволовыми клетками, а также изменения в молекулярных тонкостях вирусных патогенов 12,13,14.

Так же, как методологические достижения стимулировали революцию разрешения в области крио-ЭМ, необходимы новые методы и методы для расширения использования жидкой ЭМ в качестве высокопроизводительного инструмента для научного сообщества. Общая цель методов, представленных здесь, заключается в оптимизации протоколов подготовки образцов жидкостной ЭМ. Обоснование разработанных методов заключается в использовании новых конструкций микрочипов и устройств автозагрузки, подходящих как для сбора жидкостных, так и крио-ЭМ данных (рисунок 1)7,14,15,16,17. Сборки механически герметизированы с использованием стандартных сетчатых зажимов для автоматизированных приборов, таких как Krios, которые могут вмещать несколько образцов за сеанс или F200C TEM (рисунок 2). Эта методология расширяет использование изображений с высоким разрешением за пределы стандартных крио-ЭМ-приложений, демонстрируя более широкие цели для анализа материалов в режиме реального времени.

В текущей видеостатье представлены протоколы подготовки вирусных сборок в жидкости с коммерчески доступными держателями образцов и без них. Использование специализированного держателя образцов для жидких ЭМ, тонких жидких образцов может предоставить структурную информацию, сопоставимую с крио-ЭМ-образцами, а также динамическое понимание образцов. Также продемонстрированы методы подготовки жидких образцов с использованием инструментов автозагрузчика для высокопроизводительных процедур. Основным преимуществом по сравнению с другими методами является то, что автоматизированное производство образцов позволяет пользователю быстро оценивать свои образцы для оптимальной толщины и дозировки электронов до сбора данных. Этот метод скрининга быстро определяет идеальные области для записи в реальном времени в жидкости или льду 12,14,18,19. Для целей 3D-определения структуры жидкость-ЭМ может дополнять давно устоявшиеся крио-ЭМ методы, реализованные в крио-ЭМ. Читатели, использующие обычные технологии ТЕА или крио-ЭМ, могут рассмотреть возможность использования рабочих процессов жидкостной ЭМ для обеспечения новых, динамических наблюдений за своими образцами таким образом, чтобы дополнить их текущие стратегии.

Образцы вирусов, используемые в этом протоколе, включают очищенный аденоассоциированный вирус подтипа 3 (AAV), полученный в качестве подарка и культивируемый в стандартных условиях12. Также использовались неинфекционные СУБВИРУСНЫЕ сборки SARS CoV-2, полученные из сыворотки 12 пациентов сCOVID-19 и полученные из коммерческого источника. Наконец, очищенные обезьяньи ротавирус (штамм SA11) двухслойные частицы (DLP) были получены из лаборатории доктора Сары М. Макдональд Эссен в Университете Уэйк Форест и культивированы с использованием стандартных условий 6,17. Пакеты программного обеспечения, описанные здесь, находятся в свободном доступе, а ссылки были предоставлены в разделе «Таблица материалов».

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Загрузка держателя образца для жидкости-EM

  1. Очистите микрочипы нитрида кремния (SiN), инкубируя каждый чип в 150 мл ацетона в течение 2 мин с последующей инкубацией в 150 мл метанола в течение 2 мин. Дайте стружке высохнуть в ламинарном воздушном потоке.
  2. Плазменная очистка высушенных стружек с помощью тлеющего разрядного прибора, работающего в стандартных условиях 30 Вт, 15 мА в течение 45 с использованием газа аргона.
  3. Загрузите микрочип сухим основанием в наконечник держателя образца. Добавьте ~0,2 мкл образца (0,2-1 мг/мл вирусных сборок в 50 мМ HEPES, рН 7,5; 150 мМ NaCl; 10 мМ MgCl2; 10 мМ CaCl2) к базовому чипу. После 1-2-минутного этапа инкубации поместите верхний чип на влажную основу чипа, содержащего образец.
  4. Зажмите узел вместе, чтобы сформировать герметично закрытый корпус, механически удерживаемый на месте тремя латунными винтами. После уплотнения узла прокачайте наконечник до 10-6 Torr с помощью сухой насосной станции с турбонаддувом. Теперь держатель готов к установке в ТЕА.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выбранный держатель не имеет возможностей охлаждения и не используется для крио-ЭМ.

2. Производство сэндвич-узлов для микрочипов

ПРИМЕЧАНИЕ: Различные микрочипы SiN или диоксида кремния (SiO) могут использоваться непосредственно из поставляемых гелевых упаковок. Золотые сетки с углеродным покрытием также могут использоваться непосредственно в поставляемых поставках.

  1. Плазменная очистка микрочипов и углеродных решеток с помощью прибора тлеющего разряда, работающего в стандартных условиях 30 Вт, 15 мА в течение 45 с с использованием газа аргона.
  2. Добавить ~2 мкл образца, содержащегося в 50 мМ HEPES, рН 7,5; 150 мМ NaCl; 10 мМ MgCl2; 10 мМ CaCl2 к микрочипу со светящимся разрядом, помещенному на гелевую упаковку. Удалите лишний раствор (~50%) с помощью фильтровальной бумаги или пипетки. После 1-2-минутной стадии инкубации добавьте тлеющую разряженную углеродную сетку к мокрому микрочипу, содержащему образец.
  3. Зажмите узел вместе с помощью держателя образца с одним наклоном или зажимов сетки автозагрузчика при комнатной температуре, чтобы сформировать герметично закрытый корпус. Для зажимов автопогрузчика поместите сэндвич-узел на нижний C-зажим, поместите верхний зажим поверх узла и используйте стандартный зажимной инструмент для уплотнения сборки вместе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура зажима, выполняемая здесь, использует те же шаги, что и для зажима крио-ЭМ сетки, но при комнатной температуре. Зажатые образцы могут храниться в течение 2 месяцев или дольше до получения изображения при сохранении жидкости в корпусе. Проверка герметичности не используется с держателем образца комнатной температуры или автозагрузчиком.
  4. В настоящее время образец готов к включению в ТЕА. Исследуйте образцы, помещенные в автозагрузчики, в криотехнических условиях или при комнатной температуре.

3. Визуализация образцов с помощью просвечивающего электронного микроскопа

  1. Жидкостно-ЭМ визуализация
    1. Загрузите держатель образца в ТЕА, оснащенную полевой эмиссионной пушкой (ФЭГ) и работающую на 200 кВ.
    2. Включите пистолет и отрегулируйте эйцентрическую высоту ступени микроскопа по отношению к образцу с помощью функции воблера, наклонив образец от -15° до +15° в колонне. Эта процедура регулирует ступень в Z-направлении, чтобы приспособиться к толщине образца. И помогает обеспечить точное увеличение во время записи изображения.
    3. Записывайте изображения в виде длиннокадровых фильмов с помощью пакета in situ , интегрированного с прямым детектором с интервалом пикселей 6 мкм (Video 1 и Video 2). Отдельные изображения также могут быть записаны с использованием пакета20 программного обеспечения для сбора последовательных данных, реализующего автоматизированные процедуры обработки изображений. Получайте изображения в условиях низких доз с увеличением от 28 000x до 92 000x и 40 кадров в секунду.
    4. Отрегулируйте время экспозиции (0,25-1 с), чтобы свести к минимуму повреждение луча образца. Используйте диапазон расфокусировки -1-4 мкм при указанном увеличении. При обнаружении толстого раствора используйте более высокие значения расфокусировки или выберите другую интересующую область.
    5. Убедитесь, что раствор присутствует в образцах на протяжении всего сеанса визуализации, фокусируя электронный пучок на жертвенной области, не используемой для сбора данных, до образования пузырьков (дополнительный рисунок 1).
  2. Крио-ЭМ визуализация
    1. Загрузите обрезанные электромагнитные сетки или сэндвичи с микрочипами в ТЭМ, оснащенный FEG и работающий на 300 кВ. Включите пистолет и отрегулируйте эйцентрическую высоту ступени микроскопа, используя аналогичную процедуру, описанную для жидкости-ТЭМ выше (шаг 3.1.2).
    2. Записывайте отдельные изображения с помощью системы анализа отдельных частиц, интегрированной в систему микроскопа, при реализации автоматизированных процедур визуализации. Записывайте изображения в условиях низкой дозы с помощью прямого электронного детектора анализа одиночных частиц, имеющего расстояние между пикселями 14 мкм при увеличении 59 000x и 40 кадров в секунду.
    3. Используйте диапазон расфокусировки 1-4 мкм при указанном увеличении. При обнаружении толстых слоев стекловидного льда используйте более высокие значения расфокусировки или выберите другой регион для сбора данных.

4. Анализ данных и сравнение 3D-структур

  1. Анализ аденоассоциированного вируса (ААВ) в жидком и стекловидном льду
    1. Обрабатывайте пленки для частиц AAV в жидкости и льду с помощью программы RELION-3.0821 или другого программного обеспечения для обработки изображений22. Выполните коррекцию движения с помощью MotionCor2 v1.2.3.
    2. После исправления извлекайте частицы с помощью инструмента автоподбора в программном пакете. Типичные размеры коробки составляют 330 пикселей для жидких образцов и 350 пикселей для образцов льда.
    3. Вычисление начальных реконструкций с использованием симметрии C1 с использованием процедуры начальной 3D-модели программы и/или параметров модели ab-initio в программном пакете для обработки данных. В программе используйте параметр регуляризации T = 4 и размер пикселя 1,01 Å для жидких образцов и 1,13 Å для образцов льда.
    4. Используйте значение маски 300 Å во время процедур уточнения. Выполняйте протоколы уточнения в программном обеспечении для обработки данных, используя симметрию I1 для получения нескольких электромагнитных карт. Ожидаемое структурное разрешение может находиться в диапазоне 4 Å или выше. Используйте эквивалентность частиц, реализуя икосаэдрическую симметрию при 16 800 для жидкости и 15 240 для льда12,14.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оценки разрешения основаны на критериях корреляции оболочки Фурье (FSC) золотого стандарта.
    5. Mask EM отображает температуру ~250 Å и исследует результаты с помощью программного пакета для анализа молекулярной структуры23,24. На рисунке 3 срезы показаны с шагом ~5 нм.
    6. Извлеките субъединицы капсидного белка (VP1) из ЭМ-карт для сравнения. Количественно оцените динамические изменения между ЭМ-структурами на основе измерений диаметра частиц (дополнительный рисунок 2), а затем визуализируйте с помощью функции Morph map в программном обеспечении.
  2. Анализ субвирусных сборок SARS-CoV-2 в жидкости
    1. Обрабатывайте фильмы с помощью программы RELION-3.08. Коррекция дрейфа изображения и движения, вызванного лучом, с помощью MotionCor2 v1.2.3. Корректно для контрастной передаточной функции (CTF) микроскопа.
    2. Используйте инструмент автоподбора в программе для выбора вирусных сборок с размером поля 800 пикселей. Для вычислительной эффективности извлеченные частицы могут быть масштабированы до 256 пикселей. Получение исходной модели с использованием симметрии C1 в программе с параметром регуляризации T = 2 и размером пикселя 1,66 Å.
    3. Выполните 3D-уточнение в программе для получения ЭМ-карты, пример показан при ~8,25 Å по стандартным критериям FSC (рисунок 4). Визуализируйте ЭМ-карты с помощью программного обеспечения для анализа молекулярной структуры с срезами, увеличенными на 25 нм, как показано на рисунке 4.
  3. Анализ ротавирусных двухслойных частиц (DLP) в стекловидном льду
    1. Обрабатывайте фильмы для ротавирусных DLP с помощью другого программного обеспечения для обработки изображений. Используйте MotionCor2 v1.2.3 для коррекции дрейфа в изображениях. Используйте оценку Patch CTF для коррекции эффектов линз на изображениях.
    2. Извлекайте частицы с помощью инструмента автоподбора в программном обеспечении с размером коробки 950 пикселей. Уменьшите размер коробки по мере необходимости для вычислительных целей.
    3. Вычисление исходных моделей с использованием параметров ab-initio и симметрии C1. Используйте параметры уточнения, включая размер пикселя 1,47 Å и значение маски 800 Å.
    4. Выполняйте дополнительные процедуры уточнения, навязывая симметрию I1. Примеры результатов включают карту 10,15 Å EM в соответствии с критериями FSC золотого стандарта. Общее количество использованных частиц составило 2050, что соответствует 123 000 протомерных единиц из-за оператора икосаэдрической симметрии (рисунок 5).
    5. Маскируйте окончательные карты при ~750 Å и визуализируйте результаты в программном пакете для анализа молекулярной структуры. Примеры срезов через карту EM показаны на рисунке 5 с шагом ~10 нм.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Жидкость-ТЭМ, работающая на 200 кВ, использовалась для всех экспериментов по визуализации жидких ЭМ, а крио-ТЭМ, работающий на 300 кВ, использовался для сбора всех крио-ЭМ данных. Репрезентативные изображения и структуры нескольких вирусов представлены, чтобы продемонстрировать полезность методов для различных испытуемых. К ним относятся рекомбинантный аденоассоциированный вирус подтипа 3 (AAV), субвирусные сборки SARS-CoV-2, полученные из сыворотки пациента, и двухслойные частицы ротавируса обезьян (DLP), штамм SA11. Во...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Открываются новые возможности для оптимизации текущих рабочих процессов жидкостной ЭМ за счет использования новых автоматизированных инструментов и технологий, адаптированных из области крио-ЭМ. Приложения, связанные с новой технологией сэндвичей с микрочипами, важны по сравнению с другими методами, поскольку они позволяют проводить анализ изображений с высоким разрешением в жидком или стекловидном льду. Одним из наиболее важных шагов в протоколе является производство образцов с идеальной толщиной жидкости для визуализац...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов. Автор, Мадлен Дрессел-Дьюкс, является сотрудником Protochips, Inc., а Майкл Спилман является сотрудником DirectElectron.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы выражают признательность доктору Луку Х. Ванденберге (Гарвардская медицинская школа, отделение офтальмологии) за предоставление очищенного AAV-3. Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения и Национальным институтом рака (R01CA193578, R01CA227261, R01CA219700 до D.F.K.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
АцетонФишера Научный  A11-1Инструмент
обрезки автозагрузчикаThermoFisher ScientificN/AТакже поставщик SubAngstrom
Сетка автозагрузчикаВерхние и нижние зажимыThermoFisher ScientificN/A
Углеродное покрытие золотоEM сетки Electron Microcopy SciencesCF400-AU-50400 меш, толщина 5 нм
Сыворотка пациента с COVID-19RayBiotechCoV-Pos-S-500500 микролитров ПЦР+ сыворотки
метанолаFisher Scientific  A412-11 литр
микрочипы Microwell-integradProtochips, Inc.EPB-42A1-1010x10-мм оконные матрицы
TEMWindows микросхемыSimpore Inc.SN100-A10Q33B9 больших окон, 10-нн толщина
микросхемы TEMWindowsSimpore, Inc. SN100-A05Q33A9 маленьких окон, толщина 5 нм
Верхние микросхемыProtochips, Inc.EPT-50W500 мм x 100 мм окно
Ватман #1 фильтровальная бумагаВатман1001 090100 штук, 90 мм
<прочная>Оборудование  Детектор прямых электронов
DirectViewDirect ElectronРасстояние между пикселями 6 микрон
Falcon 3 EC Детектор прямых электроновThermoFisher ScientificРасстояние между пикселями 14 микрон
Gatan 655 Сухая насосная станцияGatan, Inc.  Наконечник держателя насоса к 10-6 range
Mark IV VitrobotThermoFisher ScientificСовременная установка для подготовки образцов 
PELCO easiGlow, тлеющий разрядникTed Pella, Inc.  Режим отрицательной полярности
Poseidon Select держатель образцаProtochips, Inc.  Совместимость с FEI; держатель образца
Talos F200C TEMThermoFisher Scientific200 кВ; Жидкостные ТЭМ
Titan Krios G3ThermoFisher Scientific300 кВ; Cryo-TEM
Свободно доступное программное обеспечениеСсылка на сайтКомментарии (опционально)
cryoSPARChttps://cryosparc.com/другое программное обеспечение для обработки изображений
CTFFIND4https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4программа для поиска CTF
MotionCorr2
RELIONhttps://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page
SerialEMhttps://bio3d.colorado.edu/SerialEM/
UCSF Chimerahttps://www.cgl.ucsf.edu/chimera/пакет программного обеспечения для анализа молекулярной структуры
для объемом 1 литр Верхние и нижние зажимыhttps://emcore.ucsf.edu/ucsf-software

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Deng, W., et al. Assembly, structure, function and regulation of type III secretion systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (6), 323-337 (2017).
  2. Oikonomou, C. M., Chang, Y. -W., Jensen, G. J. A new view into prokaryotic cell biology from electron cryotomography. Nature Reviews Microbiology. 14 (4), 205-220 (2016).
  3. Murata, K., Wolf, M. Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules. Biochimica et Biophysica Acta. General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).
  4. DiMaio, F., et al. Atomic accuracy models from 4.5 Å cryo-electron microscopy data with density-guided iterative local refinement. Nature Methods. 12 (4), 361-365 (2015).
  5. Frank, J., et al. A model of protein synthesis based on cryo-electron microscopy of the E. coli ribosome. Nature. 376 (6539), 441-444 (1995).
  6. Dukes, M. J., Gilmore, B. L., Tanner, J. R., McDonald, S. M., Kelly, D. F. In situ TEM of biological assemblies in liquid. Journal of Visualized Experiments. (82), e50936(2013).
  7. Dearnaley, W. J., et al. Liquid-cell electron tomography of biological systems. Nano Letters. 19 (10), 6734-6741 (2019).
  8. Park, J., et al. Direct observation of wet biological samples by graphene liquid cell transmission electron microscopy. Nano Letters. 15 (7), 4737-4744 (2015).
  9. Chen, Q., et al. 3D Motion of DNA-Au nanoconjugates in graphene liquid cell electron microscopy. Nano Letters. 13 (9), 4556-4561 (2013).
  10. Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336 (6077), 61-64 (2012).
  11. Wang, X., Yang, J., Andrei, C. M., Soleymani, L., Grandfield, K. Biomineralization of calcium phosphate revealed by in situ liquid-phase electron microscopy. Communications Chemistry. 1, 80(2018).
  12. Jonaid, G., et al. High-resolution imaging of human viruses in liquid droplets. Advanced Materials. 33 (37), 2103221(2021).
  13. Pohlmann, E. S., et al. Real-time visualization of nanoparticles interacting with glioblastoma stem cells. Nano Letters. 15 (4), 2329-2335 (2015).
  14. Jonaid, G. M., et al. Automated tools to advance high-resolution imaging in liquid. Microscopy and Microanalysis. , 1-10 (2022).
  15. Varano, A. C., et al. Customizable cryo-EM chips improve 3D analysis of macromolecules. Microscopy and Microanalysis. 25, 1310-1311 (2019).
  16. Alden, N. A., et al. Cryo-EM-on-a-chip: Custom-designed substrates for the 3D analysis of macromolecules. Small. 15 (21), 1900918(2019).
  17. Tanner, J. R., et al. Cryo-SiN – An alternative substrate to visualize active viral assemblies. Journal of Analytical and Molecular Techniques. , (2016).
  18. Solares, M. J., et al. Microchip-based structure determination of disease-relevant p53. Analytical Chemistry. 92 (23), 15558-15564 (2020).
  19. Casasanta, M. A., et al. Microchip-based structure determination of low-molecular weight proteins using cryo-electron microscopy. Nanoscale. 13 (15), 7285-7293 (2021).
  20. Mastronarde, D. N. Advanced data acquisition from electron microscopes with SerialEM. Microscopy and Microanalysis. 24, 864-865 (2018).
  21. Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  22. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  23. Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera—A visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).
  24. Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. Visualizing density maps with UCSF Chimera. Journal of Structural Biology. 157 (1), 281-287 (2007).
  25. Lerch, T. F., Xie, Q., Chapman, M. S. The structure of adeno-associated virus serotype 3B (AAV-3B): Insights into receptor binding and immune evasion. Virology. 403 (1), 26-36 (2010).
  26. Sharma, G., et al. Affinity grid-based cryo-EM of PKC binding to RACK1 on the ribosome. Journal of Structural Biology. 181 (2), 190-194 (2013).
  27. Kiss, G., et al. Capturing enveloped viruses on affinity grids for downstream cryo-electron microscopy applications. Microscopy and Microanalysis. 20 (1), 164-174 (2014).
  28. Degen, K., Dukes, M., Tanner, J. R., Kelly, D. F. The development of affinity capture devices—a nanoscale purification platform for biological in situ transmission electron microscopy. Rsc Advances. 2 (6), 2408-2412 (2012).
  29. Hui, S. W., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet biological membranes. Science. 184 (4132), 77-78 (1974).
  30. Hui, S. W., Parsons, D. F., Cowden, M. Electron diffraction of wet phospholipid bilayers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (12), 5068-5072 (1974).
  31. Parsons, D. F., Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Turner, J. N. Electron microscopy and diffraction of wet unstained and unfixed biological object. Advances in Biological and Medical Physics. 15, 161-270 (1974).
  32. Parsons, D. F. Structure of wet specimens in electron microscopy. Improved environmental chambers make it possible to examine wet specimens easily. Science. 186 (4162), 407-414 (1974).
  33. Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet proteins: Catalase. Science. 177 (4045), 268-270 (1972).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Liquid Electron MicroscopyCryo Electron MicroscopyVirus AssembliesHigh Resolution ImagingMolecular DynamicsMicrochip Sandwich MethodSARS CoV 2 ImagingSample PreparationStructural AnalysisDynamic Processes