Method Article

Усовершенствование визуализации вирусных сборок с высоким разрешением в жидкости и льду

DOI:

10.3791/63856

⸱

July 20th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Pennsylvania State University, 2Department of Materials Science and Engineering, McMaster University, 3Bioinformatics and Genomics Graduate Program, Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 4Molecular, Cellular, and Integrative Biosciences Graduate Program, Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 5Materials Research Institute, Pennsylvania State University, 6Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 7Applications team, Direct Electron, 8Application Scientist, Protochips, Inc., 9Department of Biology, Wake Forest University

In This Article

Retraction Notice

This article, Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice, has been retracted at the request of the Editors-in-Chief due to concerns about the integrity of the data presented. These concerns included: (a) Figure 3 was found to contain noise without structural features expected for a protein capsid; (b) critical half-map data necessary to verify resolution claims were not deposited; (c) there was a lack of system logs or controls to rule out stage drift regarding observed movements in Figure 3; and (d) the absence of protocols to address Brownian motion and beam-induced drift significantly weakened the reliability of the findings.<br/><br/>The corresponding author's indication she principally relied on RMEASURE program did not sufficiently address the publisher's concerns. After consulting external experts, the Editors-in-Chief concluded that the issues remain unresolved, and the data do not meet JoVE's standards for scientific reliability and reproducibility, requiring retraction. The corresponding author disagrees with the grounds for retraction. Co-authors DiCecco, Grandfield and Bator agree with the retraction. Other co-authors were unavailable for comment.

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь описаны протоколы для подготовки вирусных сборок, пригодных для жидкостно-ЭМ и крио-ЭМ анализа на наноуровне с использованием просвечивающей электронной микроскопии.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Интерес к жидкостно-электронной микроскопии (liquid-EM) резко возрос в последние годы, поскольку ученые теперь могут наблюдать процессы в режиме реального времени на наноуровне. Крайне желательно сочетать крио-ЭМ-информацию высокого разрешения с динамическими наблюдениями, так как многие события происходят в быстрых временных масштабах - в миллисекундном диапазоне или быстрее. Улучшенные знания о гибких структурах также могут помочь в разработке новых реагентов для борьбы с новыми патогенами, такими как SARS-CoV-2. Что еще более важно, просмотр биологических материалов в жидкой среде дает уникальное представление об их производительности в организме человека. Здесь представлены недавно разработанные методы исследования наноразмерных свойств вирусных сборок в жидком и стекловидном льду. Для достижения этой цели в качестве модельных систем использовались четко определенные образцы. Представлены параллельные сравнения методов пробоподготовки и репрезентативной структурной информации. Субнанометровые особенности показаны для структур, разрешенных в диапазоне ~3,5-Å-10 Å. Другие недавние результаты, которые поддерживают эту дополнительную структуру, включают динамическое понимание кандидатов на вакцину и терапии на основе антител, изображенной в жидкости. В целом, эти коррелятивные приложения повышают нашу способность визуализировать молекулярную динамику, обеспечивая уникальный контекст для их использования в здоровье человека и болезнях.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Биомедицинские исследования улучшают наше понимание здоровья человека и болезней путем разработки новых технологий. Визуализация с высоким разрешением трансформирует наш взгляд на наномир, позволяя нам изучать клетки и молекулы в мельчайших деталях 1,2,3,4,5. Статическая информация о динамических компонентах, таких как мягкие полимеры, белковые сборки или человеческие вирусы, показывает лишь ограниченный снимок их сложного повествования. Чтобы лучше понять, как работают молекулярные объекты, их структура и ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Загрузка держателя образца для жидкости-EM

  1. Очистите микрочипы нитрида кремния (SiN), инкубируя каждый чип в 150 мл ацетона в течение 2 мин с последующей инкубацией в 150 мл метанола в течение 2 мин. Дайте стружке высохнуть в ламинарном воздушном потоке.
  2. Плазменная очистка высушенных стружек с помощью тлеющего разрядного прибора, работающего в стандартных условиях 30 Вт, 15 мА в течение 45 с использованием газа аргона.
  3. Загрузите микрочип сухим основанием в наконечник держателя образца. Добавьте ~0,2 мкл образца (0,2-1 мг/мл вирусных сборок в 50 мМ HEPES, рН 7,5; 150 мМ NaCl; 10 мМ MgCl2; 10 мМ CaCl2

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Жидкость-ТЭМ, работающая на 200 кВ, использовалась для всех экспериментов по визуализации жидких ЭМ, а крио-ТЭМ, работающий на 300 кВ, использовался для сбора всех крио-ЭМ данных. Репрезентативные изображения и структуры нескольких вирусов представлены, чтобы продемонстрировать полезность методов для различных испытуемых. К ним относятся рекомбинантный аденоассоциированный вирус подтипа 3 (AAV), субвирусные сборки SARS-CoV-2, полученные из сыворотки пациента, и двухслойные частицы ротавируса обезьян (DLP), штамм SA11. Во.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Открываются новые возможности для оптимизации текущих рабочих процессов жидкостной ЭМ за счет использования новых автоматизированных инструментов и технологий, адаптированных из области крио-ЭМ. Приложения, связанные с новой технологией сэндвичей с микрочипами, важны по сравнению с другими методами, поскольку они позволяют проводить анализ изображений с высоким разрешением в жидком или стекловидном льду. Одним из наиболее важных шагов в протоколе является производство образцов с идеальной толщиной жидкости для визуализац.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов. Автор, Мадлен Дрессел-Дьюкс, является сотрудником Protochips, Inc., а Майкл Спилман является сотрудником DirectElectron.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы выражают признательность доктору Луку Х. Ванденберге (Гарвардская медицинская школа, отделение офтальмологии) за предоставление очищенного AAV-3. Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения и Национальным институтом рака (R01CA193578, R01CA227261, R01CA219700 до D.F.K.).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
АцетонФишера Научный  A11-1Инструмент
обрезки автозагрузчикаThermoFisher ScientificN/AТакже поставщик SubAngstrom
Сетка автозагрузчикаВерхние и нижние зажимыThermoFisher ScientificN/A
Углеродное покрытие золотоEM сетки Electron Microcopy SciencesCF400-AU-50400 меш, толщина 5 нм
Сыворотка пациента с COVID-19RayBiotechCoV-Pos-S-500500 микролитров ПЦР+ сыворотки
метанолаFisher Scientific  A412-11 литр
микрочипы Microwell-integradProtochips, Inc.EPB-42A1-1010x10-мм оконные матрицы
TEMWindows микросхемыSimpore Inc.SN100-A10Q33B9 больших окон, 10-нн толщина
микросхемы TEMWindowsSimpore, Inc. SN100-A05Q33A9 маленьких окон, толщина 5 нм
Верхние микросхемыProtochips, Inc.EPT-50W500 мм x 100 мм окно
Ватман #1 фильтровальная бумагаВатман1001 090100 штук, 90 мм
<прочная>Оборудование  Детектор прямых электронов
DirectViewDirect ElectronРасстояние между пикселями 6 микрон
Falcon 3 EC Детектор прямых электроновThermoFisher ScientificРасстояние между пикселями 14 микрон
Gatan 655 Сухая насосная станцияGatan, Inc.  Наконечник держателя насоса к 10-6 range
Mark IV VitrobotThermoFisher ScientificСовременная установка для подготовки образцов 
PELCO easiGlow, тлеющий разрядникTed Pella, Inc.  Режим отрицательной полярности
Poseidon Select держатель образцаProtochips, Inc.  Совместимость с FEI; держатель образца
Talos F200C TEMThermoFisher Scientific200 кВ; Жидкостные ТЭМ
Titan Krios G3ThermoFisher Scientific300 кВ; Cryo-TEM
Свободно доступное программное обеспечениеСсылка на сайтКомментарии (опционально)
cryoSPARChttps://cryosparc.com/другое программное обеспечение для обработки изображений
CTFFIND4https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4программа для поиска CTF
MotionCorr2
RELIONhttps://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page
SerialEMhttps://bio3d.colorado.edu/SerialEM/
UCSF Chimerahttps://www.cgl.ucsf.edu/chimera/пакет программного обеспечения для анализа молекулярной структуры
для объемом 1 литр Верхние и нижние зажимыhttps://emcore.ucsf.edu/ucsf-software

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Deng, W., et al. Assembly, structure, function and regulation of type III secretion systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (6), 323-337 (2017).
  2. Oikonomou, C. M., Chang, Y. -W., Jensen, G. J. A new view into prokaryotic cell biolo....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Liquid Electron MicroscopyCryo Electron MicroscopyVirus AssembliesHigh Resolution ImagingMolecular DynamicsMicrochip Sandwich MethodSARS CoV 2 ImagingSample PreparationStructural AnalysisDynamic Processes