Представлен протокол обработки молодых взрослых и возрастных улиток песчанок путем иммуномаркировки афферентных синаптических структур и волосковых клеток, гашения автофлуоресценции в стареющей ткани, рассечения и оценки длины улиток и количественной оценки синапсов в стеках изображений, полученных с помощью конфокальной визуализации.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Иммуномаркировка и подсчет синапсов ленты у молодых взрослых и возрастных песчанок Cochleae
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Предполагается, что потеря ленточных синапсов, соединяющих внутренние волосковые клетки и афферентные слуховые нервные волокна, является одной из причин возрастной потери слуха. Наиболее распространенным методом обнаружения потери ленточных синапсов является иммуномаркировка, поскольку она позволяет проводить количественный отбор проб из нескольких тонотопных мест в отдельной улитке. Тем не менее, структуры, представляющие интерес, похоронены глубоко внутри костистой улитки. Песчанки используются в качестве животной модели для возрастной потери слуха. Здесь описаны рутинные протоколы фиксации, иммуномаркировки кохлеарных целых креплений песчанки, конфокальной визуализации и количественной оценки количества и объемов синапсов ленты. Кроме того, подчеркиваются особые проблемы, связанные с получением хорошего материала от ценных стареющих людей.
Песчанки усыпляются и либо перфузируются сердечно-сосудисто, либо их барабанные буллы тщательно рассекаются из черепа. Улитки вскрываются на вершине и основании и непосредственно переносятся на фиксатор. Независимо от первоначального метода, улитки постфиксируются и впоследствии декальцифицируются. Затем ткань маркируется первичными антителами против пре- и постсинаптических структур и волосковых клеток. Затем улитки инкубируются со вторичными флуоресцентными антителами, которые специфичны по отношению к их соответствующим первичным. Улитки старых песчанок затем обрабатывают автофлуоресцентным гасителем, чтобы уменьшить типично существенную фоновую флуоресценцию тканей пожилых животных.
Наконец, улитки рассечены на 6-11 сегментов. Вся длина кохлеара реконструируется таким образом, что конкретные кохлеарные места могут быть надежно определены между особями. Конфокальные стеки изображений, полученные последовательно, помогают визуализировать волосковые клетки и синапсы в выбранных местах. Конфокальные стеки деконволюируются, и синапсы либо подсчитываются вручную с помощью ImageJ, либо более обширная количественная оценка синаптических структур осуществляется с помощью процедур анализа изображений, специально написанных в Matlab.
Введение
Возрастная потеря слуха является одним из наиболее распространенных заболеваний в мире, которое поражает более трети населения мира в возрасте 65 лет и старше1 года. Основные причины все еще обсуждаются и активно исследуются, но могут включать потерю специализированных синапсов, соединяющих внутренние волосковые клетки (IHC) с афферентными слуховыми нервными волокнами2. Эти ленточные синапсы содержат пресинаптическую структуру, которая имеет везикулы, заполненные привязанным к нему нейромедиатором глутаматом, а также постсинаптические α-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовой кислоты (AMPA) глутаматных рецепторов....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все протоколы и процедуры были утверждены соответствующими органами Нижней Саксонии, Германия, с номерами разрешений AZ 33.19-42502-04-15/1828 и 33.19-42502-04-15/1990. Этот протокол предназначен для монгольских песчанок (M. unguiculatus) обоих полов. Молодой взрослый относится к возрасту 3-12 месяцев, в то время как песчанки считаются в возрасте 36 месяцев и старше. Если не указано иное, буферы и растворы могут быть приготовлены и храниться в холодильнике до нескольких месяцев (4-8 °C). Перед использованием убедитесь, что буферы и растворы не выпали в осадок.
1. Фиксация и органный сбор
П....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Улитки либо собирали после сердечно-сосудистой перфузии с фиксацией всего животного, либо быстро рассекали после усыпления животного и фиксировали погружением. При последнем методе IHC оставались на месте во время рассечения, тогда как в случаях неудачной перфузии и, следовательно, недостаточно фиксированной ткани сенсорный эпителий часто разрушался. Отметим, что авторы сталкивались со случаями, когда фиксация улиток после транскардиальной перфузии была недостаточной, в то время как фиксация мозга была еще адекватной. Тк.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
С помощью метода, описанного в этом протоколе, можно иммуномаркировать IHC и синаптические структуры в улитках молодых взрослых и пожилых песчанок, идентифицировать предполагаемые функциональные синапсы путем совместной локализации пре- и постсинаптических элементов, распределить их по отдельным IHC и количественно оценить их количество, объем и местоположение. Антитела, используемые в этом подходе, также маркировали наружные волосковые клетки (OHCs; myoVIIa) и их пресинаптические ленты. Кроме того, жизнеспособной альтер.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов, о которых можно было бы заявить.
Благодарности
Авторы выражают признательность Личун Чжану за помощь в создании метода и Службы флуоресцентной микроскопии Университета Карла фон Осецкого в Ольденбурге за использование средств визуализации. Это исследование финансировалось Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Немецкий исследовательский фонд) в рамках Стратегии передового опыта Германии - EXC 2177/1.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Альбумин фракция V без биотина | Carl Roth | 0163.2 | |
| анти-CtBP2 (моноклональная мышь IgG1) | BD Biosciences, Eysins | 612044 | |
| анти-GluA2 (моноклональная мышь IgG2a) | Millipore | MAB39 | |
| антимышиный (IgG1)-AF 488 | Molecular Probes Inc. | A21121 | |
| анти-MyosinVIIa (IgG поликлональный кролик) | Proteus Biosciences | 25e6790 | |
| Держатель лезвия & Отбойник - плоские челюсти | Fine Science Tools | 10052-11 | |
| Боннские артерии Ножницы - шариковый наконечник | Fine Science Tools | 14086-09 | |
| Толщина покровного стекла 1,5H, 24 x 60 мм | Carl Roth | LH26.1 | |
| Одноразовое хирургическое лезвие | Henry Schein | 0473 | |
| ослик анти-кролик (IgG)-AF647 | Life Technologies-Молекулярные зонды | A-31573 | |
| Dumont #5 - Тонкие щипцы | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5SF Щипцы | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Этанол, абсолютный 99,8% | Fisher Scientific | 12468750 | |
| этилендиаминтетрауксусная кислота | Carl Roth | 8040.2 | |
| Excel | Microsoft Corporation | ||
| Feather Лезвие с двумя лезвиями | PLANO | 112-9 | |
| G19 Канюля | Henry Schein | 9003633 | |
| коз антимышь (IgG2a)-AF568 | Invitrogen | A-21134 | |
| Гепарин | ратиофарм | N68542.04 | |
| Huygens Essentials | Scientific Volume Imaging | ||
| ImageJ | Fiji | ||
| Immersol, Immersion oil 518F | Carl Zeiss | 10539438 | |
| Intrafix Primeline Classic, 150 см (mit Datamatrix Code auf der Sterilverpackung) | Braun | 4062957E | |
| ISM596D | Ismatec | перистальтический насос | |
| KL 1600 LED | Schott | 150.600 | источник света для стереомикроскопа |
| Leica Application suite X | Leica Microsystem CMS GmbH | ||
| Система Leica TCS SP8 | Leica Microsystem CMS GmbH | ||
| Matlab | The Mathworks Inc. | ||
| Ножницы Майонеза Карбид вольфра ToghCut | Fine Science Tools | 14512-17 | |
| Mini-100 Orbital-Genie | Scientific Industries | SI-M100 | для использования в холодных условиях |
| Narcoren (пентобарбитал) | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | ||
| Nikon Eclipse Ni-Ei | Nikon | ||
| NIS Elements | Nikon Europe Б.В. | ||
| Параформальдегид | Carl Roth | 0335.3 | |
| Чашка Петри без вентиляционных отверстий | Avantor VWR | 390-1375 | |
| Phosphate-buffered: | |||
| Disodium phosphate | AppliChem | A1046 | |
| Монокалийфосфат | Carl Roth | 3904.1 | |
| Хлорид калия | Carl Roth | 6781.1 | |
| Хлорид натрия | Sigma Aldrich | 31434-M | |
| Контейнеры с винтовой крышкой | Sarstedt | 75.562.300 | |
| Азид натрия | Carl Roth | K305.1 | |
| Студенческий щипцы Адсона | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| Студент Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools | 91308-12 | |
| Предметные стекла для адгезионного микроскопа Superfrost | Epredia | J1800AMNZ | |
| Triton X | Carl Roth | 3051.2 | |
| TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher | Biotium | 23007 | |
| Vannas Пружинные ножницы, 3 мм | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Vectashield Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Vibrax VXR basic | IKA | 0002819000 | |
| VX 7 Насадка для тарелки для Vibrax VXR basic | IKA | 953300 | |
| Wild TYP 355110 (Стереомикроскоп) | Wild Heerbrugg | больше не выпускается |
Ссылки
- Liberman, M. C. Noise-induced and age-related hearing loss: new perspectives and potential therapies [version 1; peer review. F1000Research. 6 (927), (2017).
- Heeringa, A. N., Koeppl, C. The aging coch....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
