Септины являются цитоскелетными белками. Они взаимодействуют с липидными мембранами и могут ощущать, но также генерировать кривизну мембраны в микронном масштабе. В этом протоколе мы описываем методологии снизу вверх in vitro для анализа деформаций мембран, чувствительного к кривизне связывания септина и ультраструктуры септиновой нити.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Методы «снизу вверх in vitro » для анализа ультраструктурной организации, изменения формы мембраны и чувствительности к кривизне септинов
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Ремоделирование мембраны происходит постоянно на плазматической мембране и внутри клеточных органелл. Чтобы полностью проанализировать роль окружающей среды (ионные условия, белковые и липидные композиции, кривизна мембраны) и различных партнеров, связанных со специфическими процессами изменения формы мембраны, мы предпринимаем подходы in vitro снизу вверх. В последние годы наблюдается большой интерес к выявлению роли белков септина, связанных с основными заболеваниями. Септины являются незаменимыми и вездесущими цитоскелетными белками, которые взаимодействуют с плазматической мембраной. Они участвуют в делении клеток, подвижности клеток, нейроморфогенезе и спермиогенезе, среди других функций. Поэтому важно понять, как септины взаимодействуют и организуются на мембранах, чтобы впоследствии индуцировать деформации мембран и как они могут быть чувствительны к определенным кривизнам мембраны. Целью данной статьи является расшифровка взаимодействия между ультраструктурой септинов на молекулярном уровне и ремоделированием мембран, происходящим в микронном масштабе. С этой целью почковые дрожжи и комплексы септина млекопитающих были рекомбинантно экспрессированы и очищены. Комбинация анализов in vitro затем использовалась для анализа самосборки септинов на мембране. Поддерживаемые липидные бислои (SLB), гигантские одноламеллярные везикулы (GUV), большие одноцветные везикулы (LUV) и волнистые субстраты использовались для изучения взаимодействия между самосборкой септина, изменением формы мембраны и кривизной мембраны.
Введение
Септины представляют собой цитоскелетные нитеобразующие белки, которые взаимодействуют с липидными мембранами. Септины повсеместно распространены у эукариот и необходимы для многочисленных клеточных функций. Они были идентифицированы как основные регуляторы деления клеток у почковых дрожжей и млекопитающих 1,2. Они участвуют в событиях изменения формы мембраны, цилиогенезе3 и спермиогенезе4. В клетках млекопитающих септины могут также взаимодействовать с актинами и микротрубочками 5,6,7
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Определение изменения формы мембраны с использованием гигантских одноламеллярных везикул (ГУВ)
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе ГУВ генерируются для имитации деформаций мембраны, возможно, индуцированных септинами в клеточном контексте. Действительно, в клетках септины часто встречаются на участках с микрометрическими кривизнами. ГУВ имеют размеры от нескольких до десятков микрометров и могут деформироваться. Таким образом, они подходят для анализа любых деформаций, вызванных септином в микрометровом масштабе. Флуоресцентные липиды, а также флуоресцентно меченые септины (с использованием зеленого флуоресцентного белка [GFP]) исп....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Деформации ГУВ
Типичные конфокальные флуоресцентные изображения ГУВ, измененные после инкубации с септинами, показаны на рисунке 3 в условиях полимеризации септинов. Голые ГУВ (рисунок 3А) были идеально сферическими. При инкубации с более чем 50 нМ бутонизирующих дрожжевых септинных нитей везикулы выглядели деформированными. До концентрации 100 нМ почковых октамеров дрожжевого септина везикулы казались гранеными, а деформации оставались стати.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Как указано выше, была использована липидная смесь, которая усиливает включение PI(4,5)P2 в липидный бислой и, таким образом, облегчает септин-мембранные взаимодействия. Действительно, мы показали в другом месте25 , что почковые дрожжевые септины взаимодействуют с везикулами в PI(4,5)P2-специфическим образом. Эта липидная композиция была скорректирована эмпирически путем скрининга нескольких композиций и в настоящее время широко используется авторами. С липидами PI(4,5)P.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов.
Благодарности
Мы благодарим Патрисию Бассеро и Даниэля Леви за их полезные советы и обсуждения. Эта работа была поддержана ANR (Agence Nationale de la Recherche) для финансирования проекта "SEPTIME", ANR-13-JSV8-0002-01, ANR SEPTIMORF ANR-17-CE13-0014 и проекта "SEPTSCORT", ANR-20-CE11-0014-01. B. Chauvin финансируется Ecole Doctorale "ED564: Physique en Ile de France" и Fondation pour lea Recherche Médicale. К. Накадзава был поддержан Университетом Сорбонны (AAP Emergence). Г.Х. Кёндеринк был поддержан Нидерландской организацией вур Ветеншаппелийк Ондерзоек (NWO/OCW) через «BaSyC-Building a Synthetic Cell». Гравитационный грант (024.003.019). Мы благодарим Labex Cell(n)Scale (ANR-....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1,2-диолеол-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин | Avanti Полярные липиды | 850725 | |
| 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфо-L-серин | Avanti Полярные липиды | 840035 | |
| Ванна сопромат | Elma Elmasonic | S10H | |
| Bodipy-TR-Ceramide | invitrogen, Thermo Fischer scientific | 11504726 | |
| Химические вещества: NaCl, Tris-HCl, сахароза, KCl, MgCl2, B-казеин, хлороформ, какодилат натрия, дубильная кислота, этанол | Sigma Aldrich | ||
| Конфокальный микроскоп | nikon | вращающийся диск или конфокальный | |
| фен для критических точек | Leica microsystems | CPD300 | |
| Генератор деионизированной воды | MilliQ | F1CA38083B | MilliQ integral 3 |
| Egg L-α- фосфатидилхолин | Avanti Polar Lipids | 840051 | |
| Field Emission Gun SEM (FESEM) | Carl Zeiss | Gemini SEM500 | |
| Глутаральдегид 25 %, водный раствор | Thermo Fischer scientific | 50-262-19 | |
| Высоковакуумная смазка, Dow corning | VWR | ||
| IMOD программное обеспечение | https://bio3d.colorado.edu/imod/ | программный комплекс для выравнивания изображений наклонных серий и 3D-реконструкции | |
| Лейси Формвар/углеродные электронные микроскопические сетки | Eloise | 01883-F | |
| Липиды | Avanti Polar Lipids | ||
| L-α-фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфат | Avanti Polar Lipids | 840046 | |
| Металлический испаритель | Leica микросистемы | EM ACE600 | |
| NOA (Norland Optical Adhesives), NOA 71 и NOA 81 | Norland Products | NOA71, NOA81 | |
| Тетраоксидид осмия 4% | дельта микроскопия | 19170 | |
| Осмометр | Lö ser | 15 M | |
| Плазменный очиститель | Alcatel | pascal 2005 SD | |
| Генератор | плазмы Электронная микроскопия Наука | ||
| Оборудование для плунжной заморозки | leica microsystems | EMGP | |
| Просвечивающий электронный микроскоп | Термофишер | Tecnai G2 200 кВ, LaB6 | |
| Уранилацетат | Электронная микроскопия Наука | 22451 | этот товар больше не доступен для покупки |
| Восковые пластины, Vitrex | VWR |
Ссылки
- Finger, F. P. Reining in cytokinesis with a septin corral. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 27 (1), 5-8 (2005).
- Barral, Y., Kinoshita, M. Structural insights shed light onto se....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
