Method Article

Использование микрофлюидики и флуоресцентной микроскопии для изучения динамики сборки одноактиновых нитей и пучков

DOI:

10.3791/63891

⸱

May 5th, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Université Paris Cité, CNRS, Institut Jacques Monod

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы представляем протоколы для простых микрофлюидных анализов актиновой нити в сочетании с флуоресцентной микроскопией, которые позволяют точно контролировать отдельные актиновые нити в режиме реального времени, последовательно подвергая их воздействию различных белковых растворов.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чтобы расшифровать сложные молекулярные механизмы, которые регулируют сборку и разборку актиновых нитей, является большим преимуществом для мониторинга отдельных реакций, живущих в хорошо контролируемых условиях. Для этого за последние 20 лет появились живые эксперименты с одной нитью, в основном с использованием микроскопии полной флуоресценции внутреннего отражения (TIRF), и дали множество ключевых результатов. В 2011 году, чтобы еще больше расширить возможности этих экспериментов и избежать повторяющихся проблемных артефактов, мы ввели в эти анализы простую микрофлюидику. В этом исследовании подробно описывается наш основной протокол, где отдельные актиновые нити закреплены одним концом на пассивированной поверхности покрова, выравниваются с потоком и могут последовательно подвергаться воздействию различных белковых растворов. Мы также представляем протоколы для конкретных применений и объясняем, как можно применять контролируемые механические силы благодаря вязкому сопротивлению текучего раствора. Мы выделяем технические предостережения этих экспериментов и кратко представляем возможные разработки, основанные на этой технике. Эти протоколы и объяснения, наряду с сегодняшним наличием простого в использовании оборудования для микрофлюидики, должны позволить неспециалистам реализовать этот анализ в своих лабораториях.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сборка и разборка актиновых нитей и сетей актиновых нитей контролируется несколькими биохимическими реакциями и зависит от механического контекста. Чтобы получить представление об этих сложных механизмах, бесценно иметь возможность наблюдать индивидуальные реакции на отдельных нитях (в достаточно большом количестве). За последние десятилетия наблюдение динамических актиновых нитей в режиме реального времени, главным образом с использованием флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения (TIRF), стало ключевым методом и обеспечило впечатляющий список результатов, которые не могли быть получены с помощью биохимических анализов объемного раствора

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка микрофлюидной камеры

  1. Выберите мастер-форму СУ-8 с несколькими камерными узорами. Типичные камеры имеют крестообразную форму с тремя входами и одним выходом, высотой 20 мкм и шириной 800 мкм (рисунок 1). Такие мастер-формы могут быть приобретены у внешних компаний или изготовлены в академических лабораториях (например, Gicquel, Y. et al.5).
  2. Поместите ленту по краю формы.
    1. Нанесите на скамейку ~ 50 см длиной, шириной 19 мм, стандартную прозрачную офисную ленту (см. Таблицу материалов), липкой стороной вверх. Поместите форму вертикально на одно....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для всех экспериментов, описанных выше, флуоресцентно меченые актиновые нити должны быть хорошо видны, с хорошим контрастом, указывающим на низкую фоновую флуоресценцию с поверхности (рисунок 4, см. Дополнительный файл 1 для устранения общих проблем). Актиновые нити также не должны прилипать к поверхности: когда доминирующая скорость потока низкая, боковые флуктуации актиновых нитей должны быть ощутимы при наблюдении за ними живыми и позволять четко определить, что они закре.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

По сравнению со стандартными методами с одной нитью, где актиновые нити закреплены на поверхности несколькими точками по их длине или поддерживаются близко к ней с помощью агента скученности, такого как метилцеллюлоза, микрофлюидика предлагает ряд преимуществ. Поскольку взаимодействия с поверхностью минимальны, искусственные паузы, которые эти взаимодействия могут вызвать как во время удлинения, так и во время деполимеризации, избегаются. Нити выравниваются потоком, параллельны друг другу, что облегчает их мониторинг и и.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарны Б. Ладу и Р.-М. Лаборатория Mège для использования своего УФ-очистительного оборудования, а также J. Heuvingh и 0. du Roure за первоначальное обучение, которое мы получили по подготовке пресс-форм на кремниевых пластинах и предоставлению советов по микрофлюидике. Мы признаем финансирование из гранта Европейского исследовательского совета StG-679116 (для A.J.) и Agence Nationale de la Recherche Grants Muscactin and Conformin (для G.R.-L.).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
β-КазеинMerckC6905Используется при дозе 8 мг/мл
Биопсия (с поршнем)Ted Pella15115-2ID 0,75 мм, наружный диаметр 1,07 мм
Biotin-BSAMerckA8549Используется при дозе 1 мг/мл
BSAMerckA8022Используется при дозе 50 мг/мл
Coverslip Mini-Rack
Тефлоновый держатель		InvitrogenC14784для 8 покровные стекла
Покровные стекла 22x40мм<бр/> Толщина #1.5Menzel Glä ser631-1370
DABCOMerckD27802компонент в f-буфере
DTTEuromedexEU0006-Dкомпонент в f-буфере
Ester NHS Alexa Fluor 488InvitrogenA20000Fluorophore для мечения актина на Lys328.
EZ-Link Sulfo-NHS-BiotinThermo Scientific21338К биотинилатному актину на Lys328
Hellmanex IIIHellma9-307-011-4-507Моющее средство для мытья стекол
ImageJNIHN/Aпрограммное обеспечение с открытым исходным кодом
LaboportKNF811kn.18вакуумный насос (предельный вакуум: 240 мбар)
Волшебная невидимая лентаСкотч7100024666стандартная прозрачная офисная лента
MicrewtubeSimportT341-6T2 мл микрофлюидные резервуарные трубки Микрофлюидное
устройство Часть 1: Расходомер SFluigentFLU-S-D-PCKB
Микрофлюидное устройство Часть 2: Fluiwell-4C-2 mLFluigent14002001PCKДержатель резервуара
Микрофлюидное устройство Часть 3: MFCS-EZFluigentEZ-11000001
EZ-00345001		Регулятор давления
Модель 42 - UVO-CleanerJelight Inc.42-220Ультрафиолетовый очиститель
N6-(6-аминогексил)-АТФ-АТТО-488Jena BioscienceNU-805-488АТФ-АТТО используется для маркировки актина
нейтравидинаThermo Scientific31000
PLL-PEGSuSoSPLL(20)-g[3.5]-PEG(2)Использовать в концентрации 1 мг/мл в PBS.
Полидиметилсилоксан (PDMS) Sylgard 184 Силиконовый эластомерDow Corning1673921Содержит основу PDMS и отвердитель
Полиэфирэфиркетон (PEEK) трубкиMerckZ226661" Синий» : внутренний диаметр = 0,25 мм
Предохранительный пистолетСпиральный шланг Пневматика700-SФильтрованный воздух
Силиконовая трубкаVWR228-0701PПодключение PEEK к муфте
Катетерная муфта из нержавеющей сталиPrime BioscienceSC22/15Вставляется в входы и выходы PDMS для подключения к трубке PEEK
Термопластичная пленкаSigma AldrichPM996Стандартная "парапленка"
Ультрачистый этанолVWR64-17-5
Ванна ультразвуковой очисткиVWRUSC200THДля размещения стаканов объемом 1 л
Вакуумный десикаторSP Bel-ArtF42022-0000для дегазации PDMS или растворов

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wioland, H., Jégou, A., Romet-Lemonne, G. Celebrating 20 years of live single-actin-filament studies with five golden rules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (3), 2109506119(2022).
  2. Kuhn, J. R., Pollard, T. D.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Actin Filament AssemblyMicrofluidics AssayFluorescence MicroscopyTIRF MicroscopyActin BundlesFilament PolymerizationFilament DepolymerizationSurface PassivationActin Binding ProteinsMechanical Forces

Related Articles