Компьютерное числовое управление Микромелирование микрофлюидного акрилового устройства с поэтапным ограничением для иммуноанализа на основе магнитных наночастиц

Summary

Микрофлюидика является мощным инструментом для разработки диагностических тестов. Тем не менее, часто требуется дорогостоящее оборудование и материалы, а также трудоемкие методы изготовления и обработки. Здесь мы подробно описываем протокол изготовления акрилового микрофлюидного устройства для магнитных иммуноанализов на основе микро- и наночастиц в недорогих и простых в использовании условиях.

Abstract

Микрофлюидные системы значительно улучшили методы иммунологического анализа. Тем не менее, многие методы микропроизводства требуют специализированного, дорогостоящего или сложного оборудования, что делает изготовление дорогостоящим и несовместимым с массовым производством, что является одним из наиболее важных предварительных условий для проведения тестов в местах оказания медицинской помощи (POCT) в условиях ограниченных ресурсов. В данной работе описан процесс изготовления акрилового (полиметилметакрилата, ПММА) устройства для тестирования ферментативного иммунологического анализа с наночастицами с использованием метода микромоделирования с числовым программным управлением (ЧПУ). Функционирование микрофлюидного устройства показано путем выполнения иммуноанализа для обнаружения коммерческого антитела с использованием лизоцима в качестве модельного антигена, конъюгированного с магнитными наночастицами 100 нм. Это устройство интегрирует физическое ступенчатое ограничение высотой всего 5 мкм, используемое для захвата магнитных микрочастиц, которые составляют магнитную ловушку, путем размещения внешнего магнита. Таким образом, магнитной силы на иммуноподдержку конъюгированных наночастиц достаточно, чтобы захватить их и противостоять лобовому сопротивлению потока. Это микрофлюидное устройство особенно подходит для недорогого массового производства без потери точности для эффективности иммуноанализа.

Introduction

В последние годы микрофлюидика играет важную роль в методах иммунологического анализа¹. Технология миниатюризации имеет много выдающихся преимуществ по сравнению с традиционными иммуноанализами, таких как снижение расхода образцов и реагентов, более короткое время инкубации, эффективный обмен решениями, а также более высокая интеграция и автоматизация².

Кроме того, микрофлюидные системы в иммуноанализах в сочетании с магнитными наночастицами в качестве иммуноподдержки значительно сокращают время инкубации, достигая высокой чувствительности обнаружения за счет увеличения отношения поверхности к объему³. Броуновское движение частиц улучшает кинетику реакции при образовании комплекса антиген-антитело ^4,5. Кроме того, магнитные свойства наночастиц обеспечивают универсальность для интеграции в различные конфигурации микрофлюидных устройств, что делает их идеальным кандидатом для передачи сигналов и захвата молекул в миниатюрных системах биозондирования на кристалле⁵. Однако магнитные силы значительно слабее, чем силы сопротивления в нанометровом масштабе из-за высокого отношения поверхности к объему⁶. Поэтому захват наночастиц для важнейших этапов иммуноанализа, таких как промывка и обнаружение, может быть сложной задачей, а обычного магнита недостаточно⁴.

Эффективным способом манипулирования наночастицами является использование микрофлюидной магнитной ловушки, образованной микрочастицами железа, которые упакованы в микрофлюидную структуру³. Поэтому, когда внешний магнит приближается, в намагниченной пористой среде создается сложное взаимодействие между магнитной и потоковой силами. Магнитная сила, действующая на наночастицы, достаточно сильна, чтобы захватить их и противостоять лобовому сопротивлению потока ^3,4,7. Этот подход требует методов микрофабрикации, которые достигают разрешения порядка нескольких микрометров для создания микрометрических структур, которые удерживают микрочастицы.

Современные методы микропроизводства позволяют изготавливать структуры с высоким разрешением от нескольких микрон до сотен нанометров⁸. Однако многие из этих методов требуют специализированного, дорогого или сложного оборудования. Одной из основных трудностей является потребность в чистом помещении для изготовления пресс-форм, которая остается дорогостоящей и трудоемкой ^8,9. В последнее время микрофлюидные инженеры преодолели этот недостаток, разработав множество альтернативных методов изготовления с различными преимуществами, такими как снижение затрат, более быстрое время выполнения работ, более дешевые материалы и инструменты и повышенная функциональность⁸. Таким образом, разработка новых методов микропроизводства принесла недорогие, нечистые методы, которые достигают разрешения до 10 мкм⁸. Рисунок может быть использован непосредственно на подложке без создания дорогостоящего шаблона формования, что позволяет избежать трудоемкого процесса. Методы прямого изготовления включают фрезерование с ЧПУ, лазерную абляцию и прямую литографию⁸. Все эти методы пригодны для получения каналов с высоким соотношением сторон в широком спектре материалов, независимо от их твердости⁹, что позволяет создавать новые и выгодные геометрии, физическое поведение и качества в микрофлюидных устройствах⁸.

Микромелирование с ЧПУ создает микромасштабные структуры с использованием режущих инструментов, которые удаляют сыпучий материал с подложки и является эффективным методом изготовления для микрофлюидных устройств^10,11. Метод микромелирования может быть полезен в микрофлюидных приложениях для создания микроканалов и функций непосредственно на рабочей поверхности, предлагая ключевое преимущество: заготовка может быть изготовлена за короткое время (менее 30 минут), что значительно сокращает время обработки от проектирования до прототипа¹². Кроме того, широкая доступность режущей фурнитуры из различных материалов, размеров и форм делает фрезерные станки с ЧПУ подходящим инструментом, который позволил изготавливать различные функции во многих типах недорогих одноразовых материалов¹³.

Среди всех материалов, обычно используемых в микромелировании, термопласты остаются ведущим выбором из-за их многочисленных благоприятных свойств и совместимости с биологическими приложениями^10,14. Термопласты являются привлекательной подложкой для микрофлюидных систем благодаря своим значительным преимуществам для разработки недорогих одноразовых аналитических систем⁹. Кроме того, эти материалы очень поддаются крупномасштабным производственным процессам, что делает их пригодными для коммерциализации и массового производства. По этим причинам термопласты, такие как ПММА, считались надежными и прочными материалами с первых лет микрофлюидики¹⁰. Были описаны различные протоколы для изготовления закрытых каналов в термопластах, таких как связь растворителя¹⁵, тепловая связь¹⁶ и связь поверхности¹⁷ ультрафиолетовой (УФ)/озоновой обработки.

Во многих случаях разрешение позиционирования, достигаемое с помощью обычных микромельничных машин, недостаточно для некоторых микрофлюидных применений, требующих структур размером менее 10 мкм. Высококачественное микромелье имеет достаточное разрешение. К сожалению, из-за высоких цен его использование ограничено горсткой пользователей¹². Ранее наша исследовательская группа сообщала о изготовлении и манипулировании недорогим инструментом, который позволяет обрабатывать конструкции менее 10 мкм, преодолевая разрешение обычных фрезерных станков¹². Светильник представляет собой платформу, изготовленную методом 3D-печати с простой электроникой, содержащую три пьезоэлектрических привода. Поверхность содержит шарнирные соединения, которые позволяют поднимать ее, когда пьезоэлектрические элементы действуют одновременно. Смещение по оси Z можно контролировать с разрешением 500 нм и точностью ±1,5 мкм¹².

В этой статье представлены этапы производственного процесса акрилового устройства (ПММА) с помощью метода микромоделирования. Конструкция чипа состоит из основного канала шириной 200 мкм и высотой 200 мкм и бокового канала с теми же размерами для продувки потока реагентов. В центральной области канал прерывается физическим ограничением высотой всего 5 мкм, изготовленным с помощью 3D-печатной пьезоэлектрической платформы, изготовленной этой группой¹², для захвата магнитных микрочастиц, которые составляют магнитную ловушку для наночастиц, путем размещения внешнего магнита. Показана работа микрофлюидного устройства путем проведения иммуноанализа для обнаружения коммерческого антитела с использованием лизоцима в качестве модельного антигена, конъюгированного с магнитными наночастицами 100 нм. Это устройство сочетает в себе различные особенности, которые делают его уникальным⁴: использование магнитных наночастиц в качестве иммунной поддержки сокращает общее время теста с часов до минут; использование фторогенного фермента для обнаружения позволяет установить пределы обнаружения, сопоставимые со стандартными иммуноферментными анализами (ИФА); и использование термопластика в качестве материала для изготовления делает его совместимым с массовым производством, чего не было в случае магнитных ловушек³ предыдущих микрофлюидных наночастиц, и делает его отличным кандидатом для разработки POCT.

Protocol

1. Микромельчивание

1. Поверхностное шлифование
   1. Включите микромельничную машину и пьезоэлектрический контроллер. Запустите соответствующее программное обеспечение управления¹².
   2. Выберите необходимые концевые фрезы (диаметры 200 мкм и 800 мкм). Поместите их в соответствующий отсек фрезерного станка (рисунок 1).
   3. Вырежьте прямоугольники из ПММА толщиной 9 мм x 25 мм с помощью торцевого фрезерного долота толщиной 800 мкм. Аккуратно прикрепите один из этих прямоугольников двусторонней клейкой лентой к пьезоэлектрической платформе (рисунок 2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что акриловый прямоугольник всегда находится в одном и том же положении, чтобы один из углов совпадал с координатами начала координат на осях x и y для обработки.
   4. Подключите и поместите z-сенсор на поверхность прямоугольника PMMA. Выберите контакт обнаружения и переместите его по поверхности датчика. Опустите контакт вручную, не соприкасаясь с датчиком. Активируйте режим зондирования Z0 (рисунок 3).
   5. Выберите концевой милл-бит длиной 200 мкм и переместите его в начало координат x, y. Извлеките z-сенсор. Осторожно опустите биту, не соприкасаясь с акриловой поверхностью.
   6. Вращайте концевую мельницу 200 мкм со скоростью 14 500 об/мин. Медленно опустите его до начальной координаты по оси z (z = 0). Сбросьте ось Z на 30 мкм ниже начала координат. Задайте эту координату в качестве нового z-начала.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Никогда не опускайте бит, если он не вращается. В противном случае он рискует сломаться.
   7. Нажмите кнопку «Вырезать» в программном обеспечении микромельничной машины, чтобы активировать панель «Разрезать ». Нажмите на кнопку Добавить и выберите файл .txt (Supplemental Coding File 1) с ранее созданным кодом для шлифовки акриловой поверхности. Нажмите кнопку «Вывод», чтобы начать процесс.
   8. Приведите концевую мельницу к координатам, где будет обрабатываться ограничение. Предотвратите отрыв концевой мельницы от поверхности земли после достижения этой координаты, нажав кнопку Пауза . В противном случае вручную переместите конечный бит мельницы в эту координату (рисунок 4A).
2. Фрезерование с ограничением 5 мкм
   1. Установите скорость вращения торцевого фрезы на 11 000 об/мин. Поднимите платформу на 6,5 мкм с интерфейсом пьезоэлектрической платформы (Дополнительный рисунок S1). Переместите торцевой бит мельницы вдоль оси Y на 500 мкм. Верните пьезоэлектрическую платформу к ее начальному значению по оси z с интерфейсом управления.
3. Фрезерование микроканалов
   1. Откройте ранее созданный файл проекта из программного обеспечения для проектирования (Дополнительный файл проектирования 1). Нажмите на кнопку Печать . Откройте меню «Свойства» и щелкните цветовое окно, соответствующее слою, содержащему обрабатываемый дизайн. Задайте параметры изготовления на панели инструментов , как указано на дополнительном рисунке S2.
   2. Деактивируйте нежелательные слои, выбрав параметр «Нет » в раскрывающемся меню «Инструменты ».
4. Фрезерование отверстий
   1. Переключитесь на концевую биту мельницы 800 мкм. Активируйте конструктивный слой отверстий диаметром 1,2 мм, нажав на соответствующее цветовое окно.
   2. Повторите шаг 1.3.2., но в этом случае установите соответствующие параметры изготовления, как описано на дополнительном рисунке S3A для отверстий.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Глубина обрабатываемых отверстий составляет половину толщины акрила.
   3. Обрабатывайте два дополнительных отверстия на контралатеральных углах прямоугольника для выравнивания акрила перевернутым способом на новой платформе (рисунок 4В). Снимите акриловый прямоугольник с пьезоэлектрической платформы. Переверните акрил и заклейте его двусторонней клейкой лентой поверх адаптера с обработанными стойками (рисунок 4C,D).
   4. Откройте файл с дизайном отверстий для противоположной стороны от программного обеспечения проектирования (Supplemental Design File 2). Задайте соответствующие параметры изготовления, как описано на дополнительном рисунке S3B. Отшлифуйте оставшуюся половину входных и выходных отверстий реагента диаметром 1,5 мм и глубиной 0,7 мм (дополнительный рисунок S3C).

Рисунок 1: Размещение торцевых долот. (A) Торцевые фрезы 200 мкм и 800 мкм помещаются и фиксируются с помощью винта на стальной опоре. (B) Каждый концевой фрез помещается в специальный отсек микромельничной машины для автоматического отбора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Пьезоэлектрическая платформа. Платформа изготовлена методом 3D-печати и состоит из двух шестиугольных оснований, соединенных шарнирами, которые обеспечивают тонкое смещение по оси Z, управляемое тремя пьезоэлектрическими приводами. Также наблюдается акриловый адаптер, к которому прикреплен прямоугольник ПММА, и который позволяет установить угол выравнивания координат. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Калибровка по оси Z. Этапы калибровки по оси Z детализированы. (A) Z-сенсор включает в себя кабель, который подключается к микромельничной машине. (B) Датчик помещается непосредственно на обрабатываемую поверхность. (C) Контакт обнаружения состоит из металлического стержня, помещенного в специальный отсек рядом с торцевыми фрезами. (D) Когда оба аксессуара вступают в контакт, микромельничная машина автоматически вычисляет начальную координату по оси Z. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Ректифицированная акриловая поверхность. (A) Торцевой фрезы диаметром 200 мкм протирает всю поверхность акрилового прямоугольника, удаляя слой высотой около 30 мкм. (B) На изображении показаны различные структуры, фрезерованные на лицевой стороне ранее выпрямленного акрила. Наблюдаются каналы и отверстия для входа и выхода реагента. Ограничение в 5 мкм нельзя увидеть невооруженным глазом. (C) Микромоленная поверхность с отверстиями для выравнивания и адаптер с выравниванием стоек на противоположных углах. (D) Акрил выровнен вверх ногами на адаптере со стойками, в которые помещаются отверстия для выравнивания. Шкала = 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

2. Уплотнение канала

1. Акриловая чистка
   1. Снимите акриловый прямоугольник с платформы адаптера столба. Возьмите еще один необработанный акриловый прямоугольник. Оба акриловых листа промыть изопропиловым спиртом (IPA) и промыть дистиллированной водой. Носите перчатки и избегайте контакта с IPA.
   2. Погрузите акрил в ультразвуковую ванну на 10 мин (рисунок 5А,В).
2. Воздействие газообразного хлороформа
   1. Отлично высушите оба акриловых листа. Прикрепите их к внутренней стороне стеклянной крышки чашки Петри с помощью двусторонней ленты. Обязательно поместите сторону обработанного канала открытой (рисунок 5C). Надевайте перчатки и избегайте непосредственного прикосновения к акриловой поверхности.
   2. Поместите основание стеклянной чашки Петри внутрь большей стеклянной чашки Петри (рисунок 5D). Влейте 1 мл хлороформа в основание чашки Петри. Быстро поместите крышку с акриловыми листами, прикрепленными к внутренней стороне.
   3. Немедленно добавьте дистиллированную воду к основанию большей чашки Петри до уровня крышки чашки Петри. Допускается воздействие на акрил газообразного хлороформа в течение 1 мин (рисунок 5Е).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Учтите, что более длительное время воздействия хлороформа будет атаковать акриловую поверхность, и ограничение в 5 мкм расплавится, изменив ее высоту, или исчезнет полностью.
   4. Наклоните чашку Петри, чтобы сломать созданное водяное уплотнение. Немедленно удалите акрил из хлороформа, открыв чашку Петри. Будьте осторожны, чтобы не пролить воду.
      ВНИМАНИЕ: Делайте этот процесс в вытяжном капюшоне и используйте перчатки, так как хлороформ очень токсичен.
3. Склеивание прессованием и нагревом
   1. Снимите обе акриловые пластины с двусторонней ленты.
   2. Выровняйте оба акрила с боками, которые подвергались воздействию газообразного хлороформа лицом к лицу, образуя бутерброд. Поместите акрил в пресс при температуре 18 кгс/^см2 и температуре 90 °C (рисунок 5F,G).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется размещать акрил продольно выровненным и менять его выравнивание через 2 мин для лучшего уплотнения. Если по истечении этого времени уплотнения недостаточно, поместите его обратно в пресс с интервалом не более 1 мин. С помощью стереоскопа проверьте состояние каналов и ограничения. Учтите, что в случае превышения времени прессования есть риск устранения ограничения.
4. Крепление шланга
   1. Отрежьте шланг длиной 2-3 см. Сделайте полностью прямой разрез. Прикрепите каждый шланг к отверстиям устройства с помощью мгновенно высыхающего жидкого клея (рисунок 6А). Предотвратите попадание клея внутрь чипа.

Рисунок 5: Процесс герметизации устройства. (A) Каждый из акриловых листов помещается в запечатываемый пакет с дистиллированной водой и погружается в ультразвуковую ванну. (B) На изображении слева показаны каналы сразу после изготовления, а на изображении справа показано то же устройство после стирки iPA и ультразвуковой ванной, который удаляет все примеси и акриловые остатки из микроканала. Наблюдаются края ограничения, прерывающего центральный канал 200 мкм, что подтверждает успешный процесс фрезерования. Шкала брусков = 500 мкм. (C) Оба акрила сушат и приклеивают к стеклянной платформе на крышке. (D) Основание чашки Петри помещается внутрь другой чашки большего диаметра. (E) При закрытии чашки Петри водяное уплотнение предотвращает утечку газообразного хлороформа. F) Описание элементов рычага весом 5 кг. (G) Изображение открытого рычага, показывающее красным цветом область, где размещен акрил. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

3. Подготовка устройства

1. Наполните каналы дистиллированной водой с помощью шприца. Убедитесь, что нет утечек или сопротивления потоку. Погрузите устройство в ультразвуковую ванну на 10 минут, чтобы удалить оставшийся акрил, клей или нежелательный материал внутри каналов.
2. Опорожните воду внутри каналов устройства. Используйте шприц для введения блокирующего раствора, приготовленного из 5% (мас./об.) бычьего сывороточного альбумина (BSA), разведенного в 1x Tris-буферном физиологическом растворе (TBS) и предварительно отфильтрованного через шприцевой фильтр 0,2 мкм полиэфирсульфона (PES).
3. Готовят суспензию микрочастиц железа диаметром 7,5 мкм в 5% BSA.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Микрочастицы предварительно функционализированы слоем кремнезема-полиэтиленгликоля (ПЭГ), который придает устойчивость к поглощению белка⁴.
4. Инкубируют чип и суспензию микрочастиц блокирующим раствором в течение не менее 1 ч при комнатной температуре. Если возможно, разрешите блокировку на ночь при 4 °C.

4. Образование ловушки микрочастиц

1. Вставьте микрочастицы в чип шприцевой иглой через выходной шланг бокового канала. Расположите чип вертикально и позвольте микрочастицам течь под действием силы тяжести через боковой канал. Поверните чип на 180° в два шага на 90° и позвольте микрочастицам нацеливаться и сжиматься при ограничении 5 мкм.
2. Удалите лишние микрочастицы под действием силы тяжести, вращаясь на 45° по направлению к боковому каналу.
3. Держите устройство в вертикальном положении, чтобы избежать отмены ловушки микрочастиц. См. рисунок 6B для краткого описания процесса образования ловушки микрочастиц.

5. Иммуноанализ

1. Подготовка наночастиц
   1. Взять 2 мкл суспензии 100 нм наночастиц, предварительно конъюгированных с лизоцимом (модель антигена). Добавьте его в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл со 100 мкл блокирующего раствора. Инкубировать в течение ночи при 4 °C.
   2. Добавьте 150 мкл промывочного буфера (1x TBS, 0,05% Tween 20).
   3. Поместите микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл в магнитный сепаратор. Хранить в течение 15 мин, чтобы обеспечить разделение наночастиц (дополнительный рисунок S4).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Минимальный объем магнитного сепаратора составляет 200 мкл. Избегайте использования меньшего объема.
   4. Извлеките жидкость из трубки с помощью микропипетки. Избегайте контакта со стенкой трубки, где образовалась гранула наночастиц.
   5. Добавьте 250 мкл свежего промывочного буфера. Держите трубку под перемешиванием в течение 15 мин.
   6. Повторите шаги 5.1.3.-5.1.5. В 2 раза больше, встряхивая только в течение 5 мин.
   7. Добавьте желаемую концентрацию первичного антилизоцимного антитела (см. Таблицу материалов). Приспособить к конечному объему 100 мкл в разбавителе антител (1x TBS, 1% BSA, 0,05% Tween 20).
   8. Инкубировать в течение 15 мин при 37 °C. Держите встряхивание в течение дополнительных 15 минут при комнатной температуре.
   9. Повторите шаги стирки 5.1.2.-5.1.6.
   10. Добавьте 100 мкл разбавителя антител. Добавьте вторичное антитело, связанное с пероксидазой хрена (HRP-AbII) (см. Таблицу материалов) в разведении 1:500.
   11. Повторите шаги стирки 5.1.2.-5.1.6.
   12. Держите наночастицы в конечном объеме 50 мкл разбавителя антител.

6. Экспериментальный монтаж

1. Наполните два стеклянных шприца объемом 100 мкл водой, подключите шланг длиной 6,5 см к каждому шприцу, вставьте металлический штифт в конец шланга и поместите оба шприца на управляемый компьютером шприцевой насос.
2. Запечатайте все шланги акрилового устройства теплом.
3. Отрежьте входной шланг и держите всего несколько миллиметров. Наполните дозирующую иглу буфером для промывки и вставьте ее в разрезанный шланг. Дайте раствору капать перед подключением иглы к устройству, чтобы предотвратить доступ воздуха к устройству.
4. Отрежьте выходной шланг от бокового канала. Подключите к шприцевому насосу. Затем проделайте ту же процедуру для выходного шланга основного канала.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно выполнить шаги 6.3.-6.4. в этом порядке, чтобы избежать распаковки ловушки микрочастиц. Если возможно, проверьте состояние ловушки на этих этапах с помощью увеличительного стекла.
5. Поместите стеклянный слайд на ступень микроскопа. Прикрепите магнит к слайду с помощью двусторонней ленты и поместите небольшой кусочек ленты с каждой стороны, чтобы закрепить края чипа на стекле.
6. Установите скорость потока 50 мкл/ч через вкладки «Расход» и «Агрегаты» в контроллере шприцевого насоса. Выберите режим вывода и нажмите кнопку Пуск , чтобы активировать поток буфера стирки.
7. Осторожно подойдите к устройству к слайду с магнитом в горизонтальном порядке, чтобы область чипа, содержащая ловушку, контактировала с магнитом.
8. Приклейте края устройства к стеклу с помощью двусторонней ленты, чтобы предотвратить движение. Избегайте затруднения оптического пути для микроскопии (рисунок 6C).

Рисунок 6: Окончательная конфигурация устройства. (A) Акриловое устройство со шлангами, прикрепленными к соответствующим входам и выходам. Шкала показывает размеры устройства в сантиметрах. (B) Протокол формирования ловушки микрочастиц. Микрочастицы протекают по каналу под действием силы тяжести, когда устройство помещается в вертикальное положение. Микрочастицы концентрируются при ограничении 5 мкм. Лишние микрочастицы легко удаляются путем вращения чипа по боковому каналу. Чип держится вертикально, чтобы сохранить ловушку перед иммуноанализом. (C) Микрофлюидное устройство, установленное на стеклянном предметном стекле, содержащем магнит, на ступени перевернутого флуоресцентного микроскопа. Наблюдается дозирующая игла, через которую добавляются реагенты, а также выпускные шланги, которые соединяются со шприцевым насосом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

7. Иммунодетекция

1. Держите буфер промывки в течение 10 мин со скоростью 50 мкл/ч, чтобы удалить избыток BSA.
2. Извлеките оставшийся буфер для стирки из дозирующей иглы с помощью микропипетки. Добавьте 50 мкл суспензии наночастиц.
3. Проточите суспензию наночастиц в течение 7 мин со скоростью потока 100 мкл/ч. Впоследствии изменяют расход до 50 мкл/ч и расходят еще 15 мин.
4. Замените дозирующую иглу. Проточите промывочный буфер в течение 10 мин со скоростью 50 мкл/ч. Подготовьте фторогенный субстрат в соответствии со спецификациями производителя на этапе промывки.
5. Извлеките оставшийся буфер для стирки из дозирующей иглы с помощью микропипетки. Добавьте 100 мкл фторогенного субстрата (см. Таблицу материалов). Проточите фторгенный субстрат в течение 6 мин при 50 мкл/ч.
6. Установите параметры измерения расхода (1 мкл/ч, 3 мкл/ч, 5 мкл/ч и 10 мкл/ч) и времени (6 мин) в соответствующих вкладках «Скорость потока» и «Установить таймер» интерфейса, управляющего шприцевым насосом. Обязательно выберите Режим вывода для каждого из выполняемых измерений.
7. Установите дополнительную вкладку «Скорость потока» на уровне 50 мкл/ч и установите таймер на 3 минуты для этапа промывки.
8. Включите флуоресценцию микроскопа за 15 с до того, как подложка на скорости 50 мкл/ч остановится. Начните захват изображения с помощью программного обеспечения камеры микроскопа за 10 секунд до остановки подложки со временем экспозиции 1000 миллисекунд. Выполняйте визуализацию в течение 6 минут со скоростью 1 кадр/с (FPS).
9. Нажмите на кнопку Пуск нужного параметра расхода сразу после остановки расхода промывки подложки при остановке 50 мкл/ч. Нажмите кнопку Пуск потока промывки (50 мкл/ч) сразу после остановки выбранного измерительного потока.
10. Остановите захват изображения и выключите флуоресценцию микроскопа, чтобы избежать фотоотбеливания подложки.
11. Повторите шаги 7.8.-7.10. для каждого используемого расхода измерения.

Results

Удалось создать высоковоспроизводимый протокол изготовления, который улучшает разрешение обычной техники микромосячения. Используя этот протокол, достигается изготовление канала высотой до 5 мкм, который работает как поэтапное ограничение в канале высотой 200 мкм. Простая конструкция ступенчатого ограничения захватывает микрочастицы железа диаметром 7,5 мкм, которые при уплотнении в микроканале позволяют создавать магнитную ловушку при приближении внешнего магнита к устройству. Это устройство позволяет проводить иммуноан...

Discussion

Акриловое микрофлюидное устройство для иммуноанализа с использованием наночастиц в качестве иммуноподдержки было изготовлено с использованием метода микромельчивания. Метод прямого изготовления на подложке имеет то преимущество, что позволяет избежать использования мастер-формы, а также времени и затрат, которые это подразумевает. Тем не менее, он ограничен быстрым прототипированием и крупномасштабным производством устройств.

Здесь мы использовали ранее сообщенную дополнительную пьезоэлектриче...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.008 Концевая фреза	KYOCERA SGS	2204	2FL 0.008x1/8x0.12x1-1/12
0.032 Концевая фреза	KYOCERA SGS	2228	2FL 0,032x1/8x0,48x1-1/12
Микрочастицы карбонильного железа	Sigma-Aldrich	44890	7 μ М
Хлороформ	Fermont	6201	Опасность для здоровья: Умеренная Воспламеняемость: Нет Реакционная способность: Нет Опасность контакта: Умеренная
CMOS-камера Moment	Teledyne Фотометрический		сенсор Технология: CMOS Квантовая эффективность: 73% Размер пикселя: 4,5 &; м х 4,5 и микро; m Поддерживаемые интерфейсы: USB 3.2 Gen 2
Программное обеспечение Dr Engrave	Roland DGA Corporation		Программное обеспечение для гравировки для проектирования и создания траектории гравировки на поверхности
Экстракционный колпак	Неизвестный	Неизвестный
Гибкая пластиковая трубка	Tygon	AAD04103	ID = 0,020, OD = 0,060
Флуоресцентный микросопе	ZEISS	Axio Vert.A1
Высокоточная игла для дозирования	Loctite	98612
Самодельный пьезоэлектрический контроллер приложение	LabView		Более подробную информацию см. в ссылке 12.
Loctite 495 мгновенный клей	Henkel	49503	Наносить с помощью наконечника микропипетки или дозирующей иглы
MagJET Разделительный стеллаж	термонаучный		12 x 1,5 мл
Механический пресс	Самодельный
фрезерный станок	Roland	MDX-50
Пьезоэлектрическая платформа	Самодельный		Смотрите артикул 12
Полиметилметакрилат - Лист - ПММА, Акрил	Гудфеллоу	ME303018/1	Толщина: 1,3 мм, Прозрачность: Прозрачный/Прозрачный
PVCamTest программное обеспечение	Teledyne Photometrics	Version 3.10.107	Программное обеспечение для получения изображений
Стерео микроскоп	Nikon	SMZ 7457
SuperMag Карбоксиловые шарики	Ocean NanoTech	KSC0100	100 нм
Шприцевой насос	kd Scientific	KDS200	Может вместить до двух шприцев
Ванночка Utrasonic	Branson	2800
VPanel программное обеспечение	ОС Windows	версии 1.0.3.0	Программное обеспечение для управления микрофрезерным станком