Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Клинически значимая мышиная модель перитонеального фиброза с помощью диализата и катетеров

1.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/63901

⸱

10 июня 2022 г.

 , 
1Department of Integrated Diagnostics & Therapeutics, National Taiwan University Hospital, 2Renal Division, Department of Internal Medicine, National Taiwan University Hospital, 3Graduate Institute of Physiology, National Taiwan University College of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Пациенты с тяжелым перитонеальным фиброзом имеют высокую заболеваемость и смертность. Механизм перитонеального фиброза неясен. В этом исследовании мы описываем простую экспериментальную мышиную модель перитонеального фиброза, вызванного инъекцией перитонеального диализного раствора.

Аннотация

Перитонеальный фиброз может возникать у пациентов, проходящих перитонеальный диализ (ПД), а пациенты с тяжелым перитонеальным фиброзом имеют высокую заболеваемость и смертность. Перитонит, перитонеальная диализная жидкость с высоким содержанием глюкозы и длительный период БП ускоряют начало перитонеального фиброза. Исследование перитонеального фиброза на животных необходимо из-за ограничений исследований на людях и in vitro . Тем не менее, большинство животных моделей не имитируют клинические условия. Для изучения перитонеального фиброза мы разработали клинически значимую мышиную модель, имплантировав перитонеальный катетер и вводя 2,5% жидкости с высоким содержанием глюкозы и 20 мМ метилглиоксаль (MGO) в брюшную полость ежедневно в течение 21 дня. Имплантация перитонеального катетера позволяет избежать травмирования брюшины иглами и имитирует клинические пациенты с болезнью Паркинсона. Иммунофлуоресцентное окрашивание показало, что миофибробласты накапливаются в фиброзной брюшине. Опытная группа имела меньший объем ультрафильтрации и транспортную функцию перитонеальной мембраны (тест на перитонеальное равновесие). В этой статье мы приводим подробный протокол модели.

Введение

Перитонеальный диализ (ПД) является одним из видов заместительной почечной терапии, которую получают около 11% пациентов с терминальной стадией почечной недостаточности (ТХПН)1. Исследования показали, что перитонеальный фиброз развивается у пациентов, получающих ПД2. Инкапсулирующий перитонеальный склероз (ЭФС), тяжелая форма перитонеального фиброза, приводит к высокой заболеваемости и смертности3. К факторам риска перитонеального фиброза относятся перитонит, высокоглюкозный перитонеальный диализный раствор, длительный период БП и генетические факторы4. Механизм перитонеального фиброза включает в себя сложные изменения в микроокружении брюшины и перекрестные помехи между различными типами клеток. Эксперименты in vitro и клинические наблюдения ограничены предоставлением механистического понимания перитонеального фиброза, и необходимы животные модели. Экспериментальные животные, такие как собаки, кролики, свиньи, крысы и мыши, обычно используютсяв исследованиях болезней человека, из которых мыши используются чаще всего из-за преимуществ их небольшого размера, низкой стоимости и простоты экспериментов. Кроме того, специфические клетки могут быть изучены в моделях заболеваний мышей с использованием методов отслеживания родословной.

Создание подходящей животной модели было бы полезно для понимания патофизиологии перитонеального фиброза. В идеале эта модель должна быть недорогой, легко воспроизводимой и служить основой для клинического лечения перитонеального фиброза.

Имеющиеся в настоящее время животные модели перитонеального фиброза устанавливают с помощью внутрибрюшинного введения жидкости с высоким содержанием глюкозы ежедневно в течение 28 дней, хлоргексидина глюконата (КГ) три раза в неделю в течение 3 недель или однократной дозы гипохлорита натриягипохлорита 6,7,8. Однако у этих моделей есть ограничения. Инъекция жидкости с высоким содержанием глюкозы при БП, хотя и имеет большое значение для клинической практики, вызывает только легкий фиброз брюшины и не позволяет повторить клинические состояния тяжелого фиброза брюшины, такие как ЭПС. КГ или гипохлорит могут вызывать тяжелый перитонеальный фиброз, имитирующий ЭПС, через химическую травму9. Тем не менее, КГ и гипохлорит могут вызывать повреждение брюшины и фиброз через различные механизмы, связанные с жидкостью с высоким содержанием глюкозы при БП.

В данном исследовании описан протокол разработки мышиной модели перитонеального фиброза. В этой модели сначала вводится катетер ПД, а затем выполняются ежедневные инъекции жидкости ПД с высоким содержанием глюкозы в сочетании с метилглиокзалем (MGO) в течение 21 дня. MGO является токсичным продуктом деградации глюкозы в жидкости БП и способствует образованию конечных продуктов гликирования, которые вызывают воспаление и ангиогенез10,11. Добавление MGO к жидкости с высоким содержанием глюкозы индуцирует накопление миофибробластов и способствует перитонеальному фиброзу. Таким образом, эта модель имитирует клинические условия.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Эксперименты были одобрены и проведены в соответствии с требованиями Медицинского колледжа Национального университета Тайваня и Институционального комитета по уходу за животными и их использованию Колледжа общественного здравоохранения (IACUC). Все мыши содержались под стандартным уходом.

1. Эксперимент на животных

  1. Используйте самцов и самок мышей C57BL/6 дикого типа (WT) в возрасте более 11 недель.
  2. Подготовьте хирургические материалы, включая силиконовый порт для мыши, перчатки, простыни, катетеры, швы и иглы.
  3. Имплантируйте порт мыши следующим образом:
    1. Обезболивайте мышей кетамином/ксилазином (100/10 мг/кг массы тела) путем подкожной инъекции.
      1. Проверьте частоту дыхания и глубину анестезии мышей во время операции, чтобы убедиться в условиях анестезии.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Если частота дыхания мышей становится быстрой и короткой, добавьте 20% от предыдущей дозы.
    2. Поместите мышей в положение лежа во время анестезии. Побрейте и очистите участок размером 2 см х 3 см на левой спине для операции и продезинфицируйте кожу повидон-йодом.
    3. Сделайте надрез 1,5 см на коже слева от спины.
    4. Аккуратно рассеките между кожей и мышцами на левой стороне спины, чтобы создать пространство размером 1 см x 2 см для имплантации мышиного порта.
    5. Проделайте небольшое отверстие над левой задней мышцей.
    6. Введите общую 4-французскую дистальную часть мышиного порта в брюшную полость
    7. Шов (4-0 нейлон) от корня мышиного порта к задней мышце.
    8. Поместите головку мышиного порта между кожей и мышцей спины.
    9. Закройте кожу рефлекторными зажимами (7 мм).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рефлекторные зажимы лучше, чем швы, потому что мыши часто кусают рану.
    10. Начните эксперимент через 7 дней после имплантации мышиного порта. Случайным образом разделите мышей на экспериментальную и контрольную группы.
    11. Перед введением жидкости продезинфицируйте кожу в месте доступа повидон-йодом.
    12. В группу жидкости для ПД (PDF) вводите 2,5% жидкости ПД и 20 мМ MGO в общей сложности 2 мл внутрибрюшинно ежедневно в течение 21 дня. Введите в контрольную группу физиологический раствор (NS).

2. Тест функции брюшины (тест на перитонеальное равновесие)

  1. Приготовьте 2,5% жидкость для ПД (2 мл) и измерьте концентрацию глюкозы в жидкости ПД, определяемую как исходная концентрация глюкозы (D0).
  2. Введите жидкость PD в порт мыши.
  3. Через 30 минут принесите мышам в жертву передозировку изофлурана (100%).
  4. Соберите внутрибрюшную жидкость с помощью шприца, затем измерьте объем жидкости, определяемый как объем ультрафильтрации.
  5. Измерьте концентрацию глюкозы во внутрибрюшной жидкости, определяемую как конечная концентрация глюкозы (D).
  6. Вычислить перитонеальное равновесие или функцию брюшины12.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Тест на перитонеальное равновесие12 = Конечная концентрация глюкозы в жидкости при ПД (D)/ Начальная концентрация глюкозы в жидкости при ПД (D0). Концентрацию глюкозы определяют методом гексокиназы с помощью биохимического анализатора13.

3. Препарирование тканей и гистологический анализ

  1. Соберите ткани брюшины: правую верхнюю брюшную стенку (1 см х 1 см) и печень. Зафиксируйте ткань брюшины 4% параформальдегидом на 2 ч, затем на ночь в 18% растворе сахарозы7.
  2. Подготовьте замороженные срезы брюшинной ткани толщиной 4 мкм и проведите гистологический анализ, как было опубликовано ранее7.
  3. Проводят иммунофлюоресцентное окрашивание.
    1. Для иммуномечения используют первичные антитела против следующих белков: α-гладкомышечного актина (SMA; 2 ч, 1:200) для детекции миофибробластов, цитокератина (2 ч, 1:200) для детекции мезотелиальных клеток и 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) (5 мин, 1:1000) для детекции клеточных ядер.
  4. Выразите полученные данные в соответствующем формате.
    ±Статистический анализ проводился с использованием соответствующего программного обеспечения для статистического анализа (Таблица материалов), а статистическая значимость оценивалась с помощью одностороннего ANOVA или t-критерия.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Была исследована гистология брюшинной ткани, которая показала, что перитонеальный фиброз был успешно индуцирован в группе жидкости PD плюс MGO (PDF). Иммунофлуоресцентное окрашивание висцеральной брюшины поверхности печени показало большее накопление миофибробластов в поврежденной брюшине в группе PDF, чем в контрольной группе (рис. 1). Как показано на рисунке 2A, группа PDF имела меньший объем ультрафильтрации, чем контрольная группа. Как показано на

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Брюшина имеет висцеральную и париетальную брюшину, охватывающую органы брюшной полости и брюшные стенки. Он состоит из монослоя мезотелиальных клеток, субмезотелиального слоя, серозы, фибробластов, лимфоцитов и секретируемых белков14. Перитонеальный фиброз – это потеря и обнажение мезотелиальных клеток, субмезотелиальное утолщение и накопление многих воспалительных клеток, таких как миофибробласты и макрофаги 4,14

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальной университетской больницей Тайваня (NTUH) 111-UN0026.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
анти-антитела к цитокератину широкого спектра действияabcamab9377
Beckman CoulterBeckman CoulterAU5800Биохимический анализатор
DAPI, 4′,,6-диамидино-2-фенилиндол антителаSigma-Aldrich98718-90-3
Драпируетлюбую
козу FITC анти-кроликJackson ImmunoResearch Secondary Антитела111-095-144
Перчаткилюбые
GraphPad PrizmGraphPad Программноеобеспечение GraphPad 9.0
Kellysлюбой
метилглиоксаль (MGO)Sigma-Aldrich
Mini-UTE MousePort Access Technologies MMP-4S061108BМышь 4-французский силиконовый порт
Моноклональный антиактин, α-гладкие мышцы-антитело Cy3Sigma-AldrichC6198
Иглылюбые
Рефлекторные зажимы 7 ммлюбые
Шовные материалы 4-0 Нейлонлюбой

Ссылки

  1. Jain, A. K., Blake, P., Cordy, P., Garg, A. X. Global trends in rates of peritoneal dialysis. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (3), 533-544 (2012).
  2. Zhou, Q., Bajo, M. A., Del Peso, G., Yu, X., Selgas, R. Preventing peritoneal membrane fibrosis in peritoneal dialysis patients. Kidney International. 90 (3), 515-524 (2016).
  3. Brown, M. C., Simpson, K., Kerssens, J. J., Mactier, R. A. Scottish Renal Registry. Encapsulating peritoneal sclerosis in the new millennium: A national cohort study. ClinicalJournal of the American Society of Nephrology. 4 (7), 1222-1229 (2009).
  4. Aroeira, L. S., et al. Epithelial to mesenchymal transition and peritoneal membrane failure in peritoneal dialysis patients: Pathologic significance and potential therapeutic interventions. Journal of the American Society of Nephrology. 18 (7), 2004-2013 (2007).
  5. Yang, B., et al. Experimental models in peritoneal dialysis (Review). Experimental and Therapeutic Medicine. 21 (3), 240(2021).
  6. Pawlaczyk, K., et al. Animal models of peritoneal dialysis: Thirty Years of our own experience. BioMed Research International. 2015, 261813(2015).
  7. Chen, Y. T., et al. Lineage tracing reveals distinctive fates for mesothelial cells and submesothelial fibroblasts during peritoneal injury. Journal of the American Society of Nephrology. 25 (12), 2847-2858 (2014).
  8. Yokoi, H., et al. Pleiotrophin triggers inflammation and increased peritoneal permeability leading to peritoneal fibrosis. Kidney International. 81 (2), 160-169 (2012).
  9. Hoff, C. M. Experimental animal models of encapsulating peritoneal sclerosis. Peritoneal Dialysis International. 25, Suppl 4 57-66 (2005).
  10. Hirahara, I., Ishibashi, Y., Kaname, S., Kusano, E., Fujita, T. Methylglyoxal induces peritoneal thickening by mesenchymal-like mesothelial cells in rats. Nephrology Dialysis Transplantation. 24 (2), 437-447 (2009).
  11. Nagai, T., et al. Linagliptin ameliorates methylglyoxal-induced peritoneal fibrosis in mice. PLoS One. 11 (8), 0160993(2016).
  12. Kakuta, T., et al. Pyridoxamine improves functional, structural, and biochemical alterations of peritoneal membranes in uremic peritoneal dialysis rats. Kidney International. 68 (3), 1326-1336 (2005).
  13. Barthelmai, W., Czok, R. Enzymatic determinations of glucose in the blood, cerebrospinal fluid and urine. Klinische Wochenschrift. 40, 585-589 (1962).
  14. Williams, J. D., et al. Morphologic changes in the peritoneal membrane of patients with renal disease. Journal of the American Society of Nephrology. 13 (2), 470-479 (2002).
  15. Hurst, S. M., et al. Il-6 and its soluble receptor orchestrate a temporal switch in the pattern of leukocyte recruitment seen during acute inflammation. Immunity. 14 (6), 705-714 (2001).
  16. Pawlaczyk, K., et al. Vascular endothelial growth factor in dialysate in relation to intensity of peritoneal inflammation. The International Journal of Artificial Organs. 31 (6), 535-544 (2008).
  17. Loureiro, J., et al. Blocking TGF-beta1 protects the peritoneal membrane from dialysate-induced damage. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (9), 1682-1695 (2011).
  18. Margetts, P. J., et al. Transforming growth factor beta-induced peritoneal fibrosis is mouse strain dependent. Nephrology, Dialysis Transplantation. 28 (8), 2015-2027 (2013).
  19. Huang, J. W., et al. Tamoxifen downregulates connective tissue growth factor to ameliorate peritoneal fibrosis. Blood Purification. 31 (4), 252-258 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Видео скоро будет доступно
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.