Здесь описан способ определения сродства связывания (KD) радиомеченных антител к обездвиженным антигенам. KD - константа равновесной диссоциации, которая может быть определена из эксперимента по связыванию насыщения путем измерения общего, специфического и неспецифического связывания радиомеченого антитела в различных концентрациях с его антигеном.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Определение сродства связывания (KD) радиомеченных антител к обездвиженным антигенам
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Определение сродства связывания (KD) является важным аспектом характеристики радиомеченных антител (rAb). Как правило, сродство связывания представлено константой диссоциации равновесия, KD, и может быть рассчитано как концентрация антитела, при которой половина сайтов связывания антител занята в равновесии. Этот метод может быть обобщен на любое радиомаркированное антитело или другие белковые и пептидные каркасы. В отличие от клеточных методов, выбор иммобилизованных антигенов особенно полезен для подтверждения сродства связывания после длительного хранения антител, различения связывающего сродства фрагмента антигенсвязывающей области (Fab) в биспецифических конструкциях антител и определения того, есть ли изменчивость экспрессии антигена между различными клеточными линиями. Этот метод включает иммобилизацию фиксированного количества антигена в определенные скважины на бьющейся 96-луночной пластине. Затем неспецифическое связывание было заблокировано во всех скважинах бычьим сывороточным альбумином (BSA). Впоследствии rAb добавляли в градиент концентрации ко всем скважинам. Был выбран диапазон концентраций, позволяющих rAb достичь насыщения, т.е. концентрации антитела, при которой все антигены непрерывно связаны rAb. В назначенных лунках без иммобилизованного антигена может быть определено неспецифическое связывание rAb. Путем вычитания неспецифического связывания из общего связывания в лунках с иммобилизованным антигеном можно определить специфическое связывание rAb с антигеном. KD rAb был рассчитан на основе полученной кривой связывания насыщения. В качестве примера, сродство связывания определяли с использованием радиомаркированного амивантамаба, биспецифического антитела к рецептору эпидермального фактора роста (EGFR) и белкам цитоплазматического мезенхимально-эпителиального перехода (cMET).
Введение
Радиомеченные антитела (rAb) имеют множество применений в медицине. В то время как большинство из них используются в онкологии в качестве визуальных и терапевтических агентов, существуют приложения визуализации для воспаления, связанного с ревматологией, кардиологии и неврологии1. Визуализация rAbs обладает высокой чувствительностью к обнаружению поражений и может помочь в выборе пациента для лечения 2,3,4,5. Они также используются для терапии из-за их специфичности для соответствующих антигенов. В стратегии, известно....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
ПРИМЕЧАНИЕ: Графическое представление протокола приведено на рисунке 2 .
Рисунок 2: Схема протокола. Метки рядов и столбцов указаны в качестве руководства для установки бьющейся плиты из 96 скважин. Ожидаемое связывание показано в примере хорошо для антиген....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Этот метод рассчитывает сродство связывания (KD) для rAb на основе анализа связывания насыщения, где различные концентрации rAb были добавлены к фиксированному количеству иммобилизованного антигена. Кривая связывания должна следовать за логарифмическим ростом, где он изначально крутой, а затем плато по мере насыщения антигена. Для обеспечения точности определяемого KD концентрации rAb должны быть достаточно высокими для достижения насыщения. Для этого анализа радиомеченые антитела были конъюгированы.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В рамках разработки rAbs важно обеспечить, чтобы rAb связывался конкретно со своей целью с высоким сродством связывания. Определение сродства связывания может информировать о том, влияет ли иммунореактивность rAb на радиоконъюгацию через анализ насыщения радиолигандами с использованием иммобилизованного антигена. Определение связывания rAb с BSA может быть использовано для количественной оценки неспецифического связывания для более точного измерения специфического связывания с иммобилизованным антигеном. Этот метод тести.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов.
Благодарности
Авторы благодарят 3D Imaging за производство [89Zr]Zr-оксалата и доктора Шери Мурс из Janssen Pharmaceuticals за предоставление антител.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Бычий сывороточный альбумин (БСА) | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Gamma Counter | Hidex | Автоматический гамма-счетчик | |
| GraphPad Prism Software | GraphPad | version 9.2; используется для статистического анализа в данном исследовании | |
| Immuno Breakable MaxiSorp 96-луночные планшеты | Thermo Scientific | 473768 | |
| Microplate Sealing Tape | Corning | 4612 | |
| Microsoft Excel | |||
| Фосфатный буферный раствор (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Бикарбонат натрия | JT Baker | 3506-01 | |
| Карбонат натрия | Sigma-Aldrich | S7795 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949 |
Ссылки
- Krecisz, P., Czarnecka, K., Krolicki, L., Mikiciuk-Olasik, E., Szymanski, P. Radiolabeled Peptides and Antibodies in Medicine. Bioconjugate Chemistry. 32 (1), 25-42 (2021).
- Dun, Y., Huang, G., Liu, J., Wei, W. ImmunoPET imaging of hematological malignancie....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
