Используя недорогой катионный полимер полиэтиленимин (PEI), мы произвели лентивирусные частицы для стабильной экспрессии шРНК в эмбриональных стволовых клетках человека H9 (hESCs) и транзиторно трансдуцированных нейронных клетках-предшественниках H9 (NPC) с высокой эффективностью.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Лентивирусная опосредованная доставка шРНК в гЭСК и NPC с использованием недорогого катионного полимера полиэтиленимина (PEI)
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Текущий протокол описывает использование лентивирусных частиц для доставки коротких шпильковых РНК (шРНК) как к эмбриональным стволовым клеткам человека (hESCs), так и к нейронным клеткам-предшественникам (NPC), полученным из hESCs с высокой эффективностью. Лентивирусные частицы генерировали путем котрансфекции клеток HEK293T с использованием входных векторов (несущих шРНК) вместе с упаковочными плазмидами (pAX и pMD2.G) с использованием недорогого катионного полимера полиэтиленимина (PEI). Вирусные частицы концентрировали с помощью ультрацентрифугирования, что приводило к средним титрам выше 5 х 107. Как hESCs, так и NPC могут быть инфицированы с высокой эффективностью с использованием этих лентивирусных частиц, как показано отбором пуромицина и стабильной экспрессией в hESCs, а также транзиторной экспрессией GFP в NPC. Кроме того, анализ вестерн-блот показал значительное снижение экспрессии генов, нацеленных на шРНК. Кроме того, клетки сохраняли свою плюрипотентность, а также дифференцировочный потенциал, о чем свидетельствует их последующая дифференцировка в различные линии ЦНС. Действующий протокол касается доставки шРНК; однако тот же подход может быть использован для эктопической экспрессии кДНК для исследований гиперэкспрессии.
Введение
Эмбриональные стволовые клетки человека (hESCs), полученные из внутренней клеточной массы бластоцисты, являются плюрипотентными и могут быть дифференцированы в различные типы клеток в зависимости от внешних факторов в условиях in vitro 1,2. Чтобы в полной мере использовать потенциал hESCs, необходимо иметь быстрые и надежные методы доставки генов для этих клеток. Условно используемые методы можно в широком смысле классифицировать на два типа: невирусные и вирусные системы доставки генов 3,4. Наиболее часто используемыми невирусными системами д....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Трансфекция клеток HEK293T с использованием реагента PEI или Lipofectamine 3000
- Культивирование клеток HEK293T в DMEM + 10% FBS + 1x пенициллин/стрептомицин при 37 °C в увлажненном инкубаторе с атмосферой 5% CO2 и 21% O2 до тех пор, пока они не станут 90% сливающимися перед посевом для трансфекции. Используйте относительно низкое количество прохождения клеток для производства вируса с высоким титром (в идеале менее P30).
- Семена 4 х 106 клеток в 10 мл полной питательной среды в 100 мм тканевой культуральной пластине и растут в течение ночи в инкубаторе культуры увлажненной ткани с атмосферой 5% CO....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
После переноса генов неизбежно требуется высокая жизнеспособность гЭСК. Несмотря на усилия и оптимизацию протоколов по снижению гибели клеток после электропорации гЭСК, более 50% гибели клеток все еще наблюдается после электропорации этих клеток, наряду с низкой эффективностью трансфекции20. Лентивирусный опосредованный перенос генов не только приводит к высокой эффективности переноса генов, но и демонстрирует высокий уровень жизнеспособности клеток после трансдукции. В приведенных ниже результата.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Способность генетически модифицировать стволовые клетки для изучения или клинических целей ограничена как технологией, так и базовым пониманием биологии hESCs. Методы, которые показали значительный потенциал в мышиных ЭСК, такие как липофекция и электропорация, не очень эффективны для hESCs, которые, как известно, трудны для доставки генов обычными методами20. Это понятие привело не только к оптимизации существующих методов, но и к разработке новых методов повышения эффективности трансфекции в hES.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что конфликта интересов нет.
Благодарности
Эта работа была поддержана исследовательскими грантами Университета Объединенных Арабских Эмиратов (ОАЭУ), грантом No 31R170 (Центр медицинских наук Зайеда) и No 12R010 (грант ОАЭУ-АУА). Мы благодарим профессора Рэндалла Морса (Центр Уодсворта, Олбани, Нью-Йорк) за помощь в редактировании рукописи для стиля и грамматики.
Все данные предоставляются по запросу.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 2-меркаптоэтанол | Invitrogen | 31350010 | |
| 38,5 мл, стерильный + сертифицированный бесплатный открытый тонкостенный ультрапрозрачный пробирки | Beckman Coulter | C14292 | |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| bFGF Рекомбинантный человеческий | инвитроген | PHG0261 | |
| бычий сывороточный альбумин FRAC V | Invitrogen | 15260037 | |
| Матрица базальной мембраны Corning Matrigel, не содержащий LDEV | Corning | 354234 | |
| технологии циклопаминовых | стволовых клеток | 72074 | |
| DMEM media | Invitrogen | 11995073 | |
| DMEM Питательная смесь F12 | Invitrogen | 11320033 | |
| DPBS без: Ca и Mg | PAN Biotech | P04-36500 | |
| Сыворотка плода | Invitrogen | 10270106 | |
| GAPDH (14C10) Антитело к mAb кролика | CST | 2118S | |
| Реагент для мягкой диссоциации клеток | Технологии стволовых клеток | 7174 | |
| HyClone Заменимые аминокислоты (NEAA) 100X Раствор | GE healthcare | SH30238,01 | |
| л глютамина, 100X | Invitrogen | 2924190090 | |
| L2HGDH Поликлональное антитело | Proteintech | 15707-1-AP | |
| L2HGDH shRNA | Macrogen | Seq: CGCATTCTTCATGTGAGAAAT | |
| Lipofectamine 3000 kit Thermo | Fisher | L3000001 | |
| mTesR1 полная среда | Технологии стволовых клеток | 85850 | |
| Нейробазальная среда 1X CTS | Добавка Invitrogen | A1371201 | |
| Neuropan 2 100x | PAN Biotech | P07-11050 | |
| Neuropan 27 Добавка 50x | PAN Biotech | P07-07200 | |
| Пенициллин стрептомицин SOL | Invitrogen | 15140122 | |
| pLKO.1 TRC вектор | Addgene | 10878 | |
| pLL3.7 вектор | Addgene | 11795 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| Полибреновый реагент для инфекции | Sigma | TR1003- G | |
| Полиэтиленимин, разветвленный | Sigma | 408727 | |
| psPAX2.0 | Addgene | 12260 | |
| Purmorphamine | Tocris | 4551/10 | |
| Puromycin | Invitrogen | ||
| Ингибитор ROCK Y-27632 дигидрохлорид | Tocris | 1254 | |
| SB 431542 | Tocris | 1614/10 | |
| трипсин .05% ЭДТА | Invitrogen | 25300062 | |
| XAV 939 | Tocris | 3748/10 |
Ссылки
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: Somatic differentiation in....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
