Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Лентивирусная опосредованная доставка шРНК в гЭСК и NPC с использованием недорогого катионного полимера полиэтиленимина (PEI)

2.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/63953

⸱

24 мая 2022 г.

 , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine and Health Sciences, United Arab Emirates University, 2Zayed Center for Health Sciences, United Arab Emirates University

В этой статье

Краткое содержание

Используя недорогой катионный полимер полиэтиленимин (PEI), мы произвели лентивирусные частицы для стабильной экспрессии шРНК в эмбриональных стволовых клетках человека H9 (hESCs) и транзиторно трансдуцированных нейронных клетках-предшественниках H9 (NPC) с высокой эффективностью.

Аннотация

Текущий протокол описывает использование лентивирусных частиц для доставки коротких шпильковых РНК (шРНК) как к эмбриональным стволовым клеткам человека (hESCs), так и к нейронным клеткам-предшественникам (NPC), полученным из hESCs с высокой эффективностью. Лентивирусные частицы генерировали путем котрансфекции клеток HEK293T с использованием входных векторов (несущих шРНК) вместе с упаковочными плазмидами (pAX и pMD2.G) с использованием недорогого катионного полимера полиэтиленимина (PEI). Вирусные частицы концентрировали с помощью ультрацентрифугирования, что приводило к средним титрам выше 5 х 107. Как hESCs, так и NPC могут быть инфицированы с высокой эффективностью с использованием этих лентивирусных частиц, как показано отбором пуромицина и стабильной экспрессией в hESCs, а также транзиторной экспрессией GFP в NPC. Кроме того, анализ вестерн-блот показал значительное снижение экспрессии генов, нацеленных на шРНК. Кроме того, клетки сохраняли свою плюрипотентность, а также дифференцировочный потенциал, о чем свидетельствует их последующая дифференцировка в различные линии ЦНС. Действующий протокол касается доставки шРНК; однако тот же подход может быть использован для эктопической экспрессии кДНК для исследований гиперэкспрессии.

Введение

Эмбриональные стволовые клетки человека (hESCs), полученные из внутренней клеточной массы бластоцисты, являются плюрипотентными и могут быть дифференцированы в различные типы клеток в зависимости от внешних факторов в условиях in vitro 1,2. Чтобы в полной мере использовать потенциал hESCs, необходимо иметь быстрые и надежные методы доставки генов для этих клеток. Условно используемые методы можно в широком смысле классифицировать на два типа: невирусные и вирусные системы доставки генов 3,4. Наиболее часто используемыми невирусными системами доставки генов являются липофекция, электропорация и нуклеофекция. Невирусные системы доставки являются выгодными из-за меньшего количества мутаций вставки и общего снижения иммуногенности 5,6. Однако эти методы приводят к низкой эффективности трансфекции и короткой продолжительности экспрессии транзиторных генов, что является основным ограничением для долгосрочных исследований дифференцировки7. Электропорация приводит к лучшей эффективности трансфекции по сравнению с липофекцией; однако это приводит к гибели более 50% клеток 8,9,10. Используя нуклеофекцию, выживаемость клеток и эффективность трансфекции могут быть улучшены путем сочетания липофекции и электропорации, но подход требует клеточных буферов и специализированного оборудования и, таким образом, становится довольно дорогостоящим для масштабируемых приложений11,12.

Напротив, вирусные векторы показали улучшенную эффективность трансфекции, а также общую низкую цитотоксичность после трансдукции. Кроме того, доставленные гены стабильно экспрессируются и, следовательно, делают этот метод идеальным для долгосрочных исследований13. Среди наиболее часто используемых вирусных векторов для доставки генов в hESCs - лентивирусные векторы (LVS), которые могут дать более 80% эффективности трансдукции с использованием высоких титров вирусных частиц14,15. Липофекция и осаждение CaPO4 являются одними из наиболее часто используемых методов временной трансфекции клеток HEK293T или их производных с помощью векторов переноса генов вместе с упаковкой плазмид для получения лентивирусных частиц16. Хотя липофекция приводит к хорошей эффективности трансфекции и низкой цитотоксичности, методу препятствует его стоимость, и масштабирование для получения высоких титров лентивирусных частиц было бы очень дорогостоящим. Осаждение CaPO4 приводит к относительно сходной эффективности трансфекции с теми, которые получены с помощью липофекции. Несмотря на рентабельность, осаждение CaPO4 приводит к значительной гибели клеток после трансфекции, что затрудняет стандартизацию и позволяет избежать вариаций от партии к партии17. В этом сценарии разработка метода, который дает высокую эффективность трансфекции, низкую цитотоксичность и экономическую эффективность, имеет решающее значение для производства высокотитерных лентивирусных частиц, которые будут использоваться в гЭСК.

Полиэтиленимин (PEI) представляет собой катионный полимер, который может трансфектировать клетки HEK293T с высокой эффективностью без особой цитотоксичности и имеет незначительную стоимость по сравнению с методами18 на основе липофекции. В этой ситуации PEI может быть использован для расширенного применения производства LVS с высоким титром за счет концентрации лентивирусных частиц из супернатантов культуры с использованием различных методов. В представленной статье описано применение PEI для трансфекции клеток HEK293T и концентрации лентивирусных векторов с использованием ультрацентрифугирования через сахарозную подушку. Используя этот метод, мы регулярно получаем титры значительно выше 5 x 107 МЕ/мл с низкими вариациями от партии к партии. Метод прост, прост и экономически эффективен для масштабируемых приложений для доставки генов в гЭСК и клетки, полученные из гЭСК.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Трансфекция клеток HEK293T с использованием реагента PEI или Lipofectamine 3000

  1. Культивирование клеток HEK293T в DMEM + 10% FBS + 1x пенициллин/стрептомицин при 37 °C в увлажненном инкубаторе с атмосферой 5% CO2 и 21% O2 до тех пор, пока они не станут 90% сливающимися перед посевом для трансфекции. Используйте относительно низкое количество прохождения клеток для производства вируса с высоким титром (в идеале менее P30).
  2. Семена 4 х 106 клеток в 10 мл полной питательной среды в 100 мм тканевой культуральной пластине и растут в течение ночи в инкубаторе культуры увлажненной ткани с атмосферой 5% CO2 и 21% O2.
  3. Для каждой трансфекции разбавляют плазмидную ДНК (запасы 1 мг/мл) в 1 мл свободной от сыворотки среды DMEM в центрифужных пробирках объемом 1,5 мл, используя следующее соотношение плазмид входа и упаковки:
    Входной вектор = 10 мкг
    psPAX2.0 = 7.5 мкг
    pMD2.G = 5 мкг
  4. Вихрь в течение 10 с и вращение трубки при 10 000 х г в течение 30 с при комнатной температуре для сбора.
  5. Добавьте 70 мкл (1 мг/мл стокового раствора) PEI в трубку, а затем кратковременно вращайте и вращайте, как описано выше, чтобы собрать. Объем используемого PEI основан на соотношении 1:3 общей ДНК (мкг) :P EI (мкг).
  6. Для трансфекции на основе липофектамина разводят вышеуказанные векторы в 500 мкл бессывороточной DMEM-среды, содержащей 45 мкл реагента Р, поставляемого в комплекте, и инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин.
  7. Разбавить 70 мкл реагента L, поставляемого в комплекте, используя 500 мкл бессывороточной DMEM среды, и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин.
  8. Соедините содержимое обоих трубок и инкубируйте трубки при комнатной температуре в течение 20 минут, чтобы обеспечить образование комплекса.
  9. Добавьте по каплям 1 мл ДНК/PEI или 1 мл комплексов ДНК/липофектамина к пластине, содержащей клетки, и инкубируйте в течение 6 ч при 37 °C в увлажненном инкубаторе с атмосферой 5% CO2 и 21% O2.
  10. Через 6 ч переходят на свежие полные питательные среды (10 мл) и возвращают клетки обратно в увлажненный инкубатор с атмосферой 5% CO2 и 21%O2.

2. Сбор LVS и ультрацентрифугирование

  1. После 2 дней трансфекции соберите вирусосодержащую среду и снова наложите на клетки 10 мл свежих полноценных питательных сред.
  2. После 3 дней трансфекции соберите вирусосодержащую среду и объедините ее с вируссодержащей средой, собранной в 2-дневный момент времени.
  3. Центрифугировать вирусный супернатант при 2000 х г в течение 10 мин при 4 °C в гранулированный клеточный мусор.
  4. Фильтруйте супернатант с помощью фильтра с низким содержанием белка размером пор 0,45 мкм (PES или SFCA) и храните при 4 °C до готовности к ультрацентрифугированию. Фильтрованный супернатант, содержащий лентивирусные частицы, может храниться при 4 °C в течение 5 дней без значительной потери вирусных титров.
  5. Стерилизуйте ультрацентрифужные трубки, удерживающие чашки, промыв их 70% этанолом в течение 10 минут, высушите на воздухе, закройте и держите при температуре 4 °C.
  6. Добавьте 36 мл фильтрованного материала, содержащего лентивирусные частицы, в стерильную ультрацентрифужную трубку.
  7. Заполните 5 мл стерильной полосы 4 мл стерильного 20% раствора сахарозы (приготовленного в PBS) и дозируйте его прямо на дно ультрацентрифужной трубки (UC), содержащей LVS. Важно, чтобы раствор сахарозы не смешивался со средой и делал градиент в нижней части трубки.
  8. Сбалансируйте все ультрацентрифужные трубки с помощью бессывороточной среды DMEM, поместите в холодную ультрацентрифужную трубку, удерживающую чашки, и закройте крышки.
  9. Вращайте трубки при 125 000 х г в течение 2 ч при 4 °C.
  10. После отжима осторожно выбросьте супернатант, перевернув содержимое трубки в контейнер, содержащий отбеливатель, не нарушая гранулу. Отметьте гранулу, если она видна.
  11. Поместите ультрацентрифужную трубку в стерильную трубку объемом 50 мл и добавьте 200 мкл стерильного DPBS точно в верхнюю часть гранулы. Хранить при температуре 4 °C в течение ночи без помех.
  12. На следующий день аккуратно перемешайте, пипеткой вверх и вниз 40x.
  13. Ненадолго вращайте при 13 000 х г в настольной центрифуге, чтобы гранулировать любой мусор.
  14. Перенесите супернатант в новую трубку и аликвотируйте препарат вируса в виде 20 мкл аликвот. Хранить при температуре −80 °C.
  15. Откладывают 5 мкл препарата для измерения титра вируса.

3. Измерение титра LVS для векторов на основе pLKO.1

  1. Определите титр лентивирусных частиц с помощью qPCR в соответствии с рекомендациями производителя.
  2. Для стандартной кривой подготовьте пять 10-кратных последовательных разведений стандартной контрольной ДНК (поставляемой в комплекте) путем разбавления 5 мкл ДНК в 45 мкл свободного от нуклеазыH2Oна каждой стадии. Используйте разбавления от 1:100 до 1:100 000 для создания стандартной кривой.
  3. Настраивайте реакции на льду в дубликатах следующим образом:
    2x qPCR мастер микс 10 мкл
    Грунтовочная смесь 2 мкл
    Образец или стандарт ДНК 2 мкл
    Не содержащий нуклеаз H2O 6 мкл
  4. Выполняйте qPCR с использованием условий цикла, указанных в руководстве по эксплуатации комплекта, в общей сложности 35 циклов.
  5. Построение пороговых значений цикла (Ct) по оси Y и титру вируса по оси X.
  6. Генерация логарифмической регрессии с использованием четырех стандартных контрольных разведений ДНК (от 1:100 до 1:100 000) для определения титра неизвестного образца вируса с использованием уравнения линии тренда.

4. Измерение титра LVS для векторов на основе pll3.7

  1. Семена 1 х 105 клеток HEK293T в каждой лунке P12-луночной пластины в 1 мл полной питательной среды за 24 ч до заражения.
  2. Дополните среду полибреном 8 мкг/мл и добавьте 1 мл в каждую стерильную трубку объемом 1,5 мл.
  3. Разбавляют вирусные частицы, используя 4 мкл, 2 мкл, 1 мкл, 0,5 мкл и 0,1 мкл концентрированных лентивирусных частиц в каждом из 1 мл полибреносодержащей среды.
  4. Заменить среду из клеток HEK293T средой, содержащей указанные количества лентивирусных частиц вместе с полибреном 8 мкг/мл, и инкубировать в течение 24 ч при 37 °C в увлажненном инкубаторе с атмосферой 5% CO2 и 21% O2.
  5. На следующий день переходят на свежие носители и продолжают культивирование в течение 72 ч при 37 °C в увлажненном инкубаторе с атмосферой 5% CO2 и 21% O2.
  6. Через 72 ч промыть ячейки PBS, трипсинизировать при 37 °C по протоколу производителя и повторно использовать в 1 мл PBS.
  7. Выполняйте сортировку ячеек FACS с помощью сортировщика ячеек в соответствии с рекомендациями производителя. Установите затвор на 0% положительных клеток GFP с использованием неинфицированных клеток HEK293T и подсчитайте 50 000 событий для каждого образца, чтобы определить процент положительных клеток для каждого вирусного разведения.
  8. Используйте только объемы лентивирусных частиц, которые дают %GFP положительные клетки в диапазоне 2%-20% для расчета титра лентивирусных частиц.

5. Заражение гЭСК и стабильный отбор

  1. Промыть клетки 2 мл PBS, растущих в каждой лунке многолуночной пластины клеточной культуры с 6 лунками.
  2. Отсоедините клетки от пластины клеточной культуры с помощью 1 мл 1x клеточного диссоциационного реагента путем инкубации при 37 °C в течение 5 мин.
  3. Соберите ячейки в среде DMEM/F12 и центрифуге при 1,500 х г в течение 5 мин при комнатной температуре для сбора гранулы ячейки.
  4. Аспират, повторно суспендируют клетки в 1 мл, и подсчитывают с помощью гемоцитометра.
  5. Сделать клеточную суспензию с 2 х 105 клетками / мл полной питательной среды, содержащей mTeSR1, дополненную 10 нг / мл основного фактора роста фибробластов (bFGF), пенициллина / стрептомицина (P / S) и ингибитора ROCK (RI) 10 мкМ (RI).
  6. Семена 1 х 105 клеток на 50x разбавлены полной базальной мембраной с матричным покрытием P24-луночных пластин в 500 мкл полной питательной среды и культивируют клетки при 37 °C в увлажненном инкубаторе с атмосферой 5% CO2 и 21% O2.
  7. На следующий день инфицируют гЭСК при кратности инфекции (MOI) 10 с полибреном 8 мкг/мл и инкубируют при 37 °C в течение 8 ч.
  8. Через 8 ч замените вируссодержащую среду свежими питательными средами (-RI) и продолжайте культивирование до тех пор, пока клетки не сольются на 90%.
  9. Начинают выделение пуромицина (0,8 мкг/мл), когда клетки достигают 90% конфлюентности, которая обычно составляет 48-72 ч после заражения.
  10. После завершения отбора (обычно через 4-6 дней) расщепляют стабильные клетки (1:4) и расширяют клетки для криоконсервации и дальнейшего анализа.

6. Трансдукция нейронных клеток-предшественников H9 (NPC)

ПРИМЕЧАНИЕ: NPC были получены из клеток H9 с использованием протокола двойного ингибирования Smad, как описано ранее19.

  1. Вкратце, обрабатывайте клетки H9 реагентом диссоциации клеток при 37 °C в течение 5 мин для получения одиночных клеток и повторного суспендирования в полной среде роста, содержащей mTeSR1, дополненную 10 нг/мл основного фактора роста фибробластов (bFGF), пенициллина/стрептомицина (P/S) и ингибитора ROCK 10 мкМ (RI). Семена на 1:50 разбавляют покрытые Матригелем 6-луночные чашки для культивирования клеток при плотности 60 000 клеток/см2 (день 0).
  2. Инициируют дифференцировку, когда клетки достигают 95%-100% конфлюзии, изменяясь на 100% KSR среды, содержащие LDN193189 (200 нМ) и SB431542 (10 мкМ) (день1).
  3. На 2-й день снова замените носитель 100% KSR, дополненным LDN193189 (200 нМ), SB431542 (10 мкМ) и XAV939 (5 мкМ).
  4. На 4-й день дифференциации переключитесь на смесь среды KSR (75%) и среды N2 (25%) с LDN193189 (200 нМ), SB431542 (10 мкМ) и XAV939 (5 мкМ).
  5. С 6-го по 12-й день постепенно переключайте носитель на 100% N2, дополненный LDN193189 (200 нМ), SB431542 (10 мкМ) и XAV939 (5 мкМ), увеличивая носитель N2 на 25% каждый день и меняя носитель через каждые 2 дня.
  6. День культуры 12 NPC в среде N2:B27 дополнен 20 нг/мл bFGF.
  7. Семена 2 х 105 клеток в каждой лунке 1:50 разбавлены полной базальной мембраной с покрытием P6-пластины в 2 мл культуральной среды NPC и инкубируют, чтобы позволить клеткам прикрепляться.
  8. На следующий день заражают клетки лентивирусными частицами при MOI 6 в присутствии полибрена 8 мкг/мл.
  9. Через 8 ч заменить вирусосодержащую среду свежими средами роста NPC.
  10. На следующий день повторите инфекции и смените среду через 8 ч.
  11. Храните клетки в культуре в течение 72 ч перед сбором урожая для дальнейшего анализа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

После переноса генов неизбежно требуется высокая жизнеспособность гЭСК. Несмотря на усилия и оптимизацию протоколов по снижению гибели клеток после электропорации гЭСК, более 50% гибели клеток все еще наблюдается после электропорации этих клеток, наряду с низкой эффективностью трансфекции20. Лентивирусный опосредованный перенос генов не только приводит к высокой эффективности переноса генов, но и демонстрирует высокий уровень жизнеспособности клеток после трансдукции. В приведенных ниже результата...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Способность генетически модифицировать стволовые клетки для изучения или клинических целей ограничена как технологией, так и базовым пониманием биологии hESCs. Методы, которые показали значительный потенциал в мышиных ЭСК, такие как липофекция и электропорация, не очень эффективны для hESCs, которые, как известно, трудны для доставки генов обычными методами20. Это понятие привело не только к оптимизации существующих методов, но и к разработке новых методов повышения эффективности трансфекции в hES...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что конфликта интересов нет.

Благодарности

Эта работа была поддержана исследовательскими грантами Университета Объединенных Арабских Эмиратов (ОАЭУ), грантом No 31R170 (Центр медицинских наук Зайеда) и No 12R010 (грант ОАЭУ-АУА). Мы благодарим профессора Рэндалла Морса (Центр Уодсворта, Олбани, Нью-Йорк) за помощь в редактировании рукописи для стиля и грамматики.

Все данные предоставляются по запросу.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2-меркаптоэтанолInvitrogen31350010
38,5 мл, стерильный + сертифицированный бесплатный открытый тонкостенный ультрапрозрачный пробиркиBeckman CoulterC14292
AccutaseStem Cell Technologies7920
bFGF Рекомбинантный человеческийинвитрогенPHG0261
бычий сывороточный альбумин FRAC VInvitrogen15260037
Матрица базальной мембраны Corning Matrigel, не содержащий LDEVCorning354234
технологии циклопаминовыхстволовых клеток72074
DMEM mediaInvitrogen11995073
DMEM Питательная смесь F12 Invitrogen11320033
DPBS без: Ca и MgPAN BiotechP04-36500
Сыворотка плодаInvitrogen10270106
GAPDH (14C10) Антитело к mAb кроликаCST2118S
Реагент для мягкой диссоциации клетокТехнологии стволовых клеток7174
HyClone Заменимые аминокислоты (NEAA) 100X РастворGE healthcareSH30238,01
л глютамина, 100X Invitrogen2924190090
L2HGDH Поликлональное антителоProteintech15707-1-AP
L2HGDH shRNAMacrogenSeq: CGCATTCTTCATGTGAGAAAT
Lipofectamine 3000 kit ThermoFisherL3000001
mTesR1 полная средаТехнологии стволовых клеток85850
Нейробазальная среда 1X CTSДобавка InvitrogenA1371201
Neuropan 2 100xPAN BiotechP07-11050
Neuropan 27 Добавка 50xPAN BiotechP07-07200
Пенициллин стрептомицин SOLInvitrogen15140122
pLKO.1 TRC векторAddgene10878
pLL3.7 вектор Addgene11795
pMD2.GAddgene12259
Полибреновый реагент для инфекцииSigmaTR1003- G
Полиэтиленимин, разветвленныйSigma408727
psPAX2.0Addgene12260
PurmorphamineTocris4551/10
PuromycinInvitrogen
Ингибитор ROCK Y-27632
дигидрохлорид 		Tocris1254
SB 431542Tocris1614/10
трипсин .05% ЭДТА Invitrogen25300062
XAV 939Tocris3748/10
A1113802

Ссылки

  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  2. Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: Somatic differentiation in vitro. Nature Biotechnology. 18 (4), 399-404 (2000).
  3. Strulovici, Y., Leopold, P. L., O'Connor, T. P., Pergolizzi, R. G., Crystal, R. G. Human embryonic stem cells and gene therapy. Molecular Therapy. 15 (5), 850-866 (2007).
  4. Kane, N., McRae, S., Denning, C., Baker, A. Viral and nonviral gene delivery and its role in pluripotent stem cell engineering. Drug Discovery Today. Technologies. 5 (4), 105(2008).
  5. Li, S. D., Huang, L. Nonviral is superior to viral gene delivery. Journal of Controlled Release. 123 (3), 181-183 (2007).
  6. Mastrobattista, E., Bravo, S. A., vander Aa, M., Crommelin, D. J. Nonviral gene delivery systems: From simple transfection agents to artificial viruses. Drug Discovery Today. Technologies. 2 (1), 103-109 (2005).
  7. Cao, F., et al. Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells. Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 15-24 (2010).
  8. Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. Electroporation of human embryonic stem cells: Small and macromolecule loading and DNA transfection. Biotechnology Progress. 22 (3), 825-834 (2006).
  9. Sukhorukov, V. L., et al. Surviving high-intensity field pulses: Strategies for improving robustness and performance of electrotransfection and electrofusion. The Journal of Membrane Biology. 206 (3), 187-201 (2005).
  10. Floch, V., et al. Cationic phosphonolipids as non viral vectors for DNA transfection in hematopoietic cell lines and CD34+ cells. Blood Cells, Molecules and Diseases. 23 (1), 69-87 (1997).
  11. Lakshmipathy, U., et al. Efficient transfection of embryonic and adult stem cells. Stem Cells. 22 (4), 531-543 (2004).
  12. Siemen, H., et al. Nucleofection of human embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 14 (4), 378-383 (2005).
  13. Zhang, X., Godbey, W. T. Viral vectors for gene delivery in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (4), 515-534 (2006).
  14. Ma, Y., Ramezani, A., Lewis, R., Hawley, R. G., Thomson, J. A. High-level sustained transgene expression in human embryonic stem cells using lentiviral vectors. Stem Cells. 21 (1), 111-117 (2003).
  15. Gropp, M., et al. Stable genetic modification of human embryonic stem cells by lentiviral vectors. Molecular Therapy. 7 (2), 281-287 (2003).
  16. Tan, E., Chin, C. S. H., Lim, Z. F. S., Ng, S. K. HEK293 cell line as a platform to produce recombinant proteins and viral vectors. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 796991(2021).
  17. Merten, O. W., Hebben, M., Bovolenta, C. Production of lentiviral vectors. Molecular Therapy: Methods & Clinical Development. 3, 16017(2016).
  18. Lungwitz, U., Breunig, M., Blunk, T., Göpferich, A. Polyethylenimine-based nonviral gene delivery systems. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 60 (2), 247-266 (2005).
  19. Parween, S., et al. Higher O-GlcNAc levels are associated with defects in progenitor proliferation and premature neuronal differentiation during in-vitro human embryonic cortical neurogenesis. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 415(2017).
  20. Weissinger, F., et al. Gene transfer in purified human hematopoietic peripheral-blood stem cells by means of electroporation without prestimulation. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 141 (2), 138-149 (2003).
  21. Cui, Y., et al. Targeting transgene expression to antigen-presenting cells derived from lentivirus-transduced engrafting human hematopoietic stem/progenitor cells. Blood. 99 (2), 399-408 (2002).
  22. Yu, X., et al. Lentiviral vectors with two independent internal promoters transfer high-level expression of multiple transgenes to human hematopoietic stem-progenitor cells. Molecular Therapy. 7 (6), 827-838 (2003).
  23. Sweeney, N. P., Vink, C. A. The impact of lentiviral vector genome size and producer cell genomic to gag-pol mRNA ratios on packaging efficiency and titre. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 21, 574-584 (2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Лентивирусная доставкатрансфекция шРНКчеловеческие эмбриональные стволовые клеткинейральные клетки-предшественникитрансфекция полиэтилениминомклетки HEK293Tультрацентрифугированиеконцентрирование вирусных частицвестерн-блоттингэкспрессия GFP
Лентивирусная опосредованная доставка шРНК в гЭСК и NPC с использованием недорогого катионного полимера полиэтиленимина (PEI)
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.