Методическая статья

Стратегия гликомики бактериальных гликопротеинов на основе неспецифического протеолиза

765 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/63977

⸱

30 июня 2022 г.

 ,  , 
1Human Health Therapeutics Research Center, National Research Council Canada

В этой статье

Краткое содержание

В данном исследовании представлен метод гликомического анализа гликопротеинов путем комбинации расщепления проназы Е, перметилирования и масс-спектрометрического анализа. Этот метод способен анализировать все типы N-связанных гликанов, включая бактериальные N-гликаны.

Аннотация

Гликозилирование белка является одной из наиболее распространенных и сложных посттрансляционных модификаций. Было разработано множество методик для характеристики специфической роли гликанов, взаимосвязи между их структурами и их влияния на функции белков. Распространенным методом анализа гликанов является использование расщепления экзогликозидазы для высвобождения N-связанных гликанов из гликопротеинов или гликопептидов с использованием пептид-N-гликозидазы F (PNGase F). Тем не менее, гликан-белковые связи у бактерий различны, и не существует фермента, который мог бы высвобождать гликаны из бактериальных гликопротеинов. Кроме того, свободные гликаны также были описаны в клетках млекопитающих, бактериях, дрожжах, растениях и рыбах. В этой статье мы представляем метод, который может охарактеризовать N-связанную систему гликозилирования у Campylobacter jejuni путем обнаружения аспарагин-связанных (Asn) и свободных гликанов, которые не присоединены к их белкам-мишеням. В этом методе общие белки C. jejuni расщеплялись проназой Е с более высоким отношением ферментов к белкам (2:1−3:1) и более длительным временем инкубации (48−72 ч). Полученные Asn-гликаны и свободные гликаны затем очищали с помощью пористых графитовых углеродных картриджей, перметилировали и анализировали с помощью масс-спектрометрии.

Введение

N-гликозилирование белка является одной из наиболее распространенных и сложных посттрансляционных модификаций у эукариот1. N-гликаны играют важную роль в сворачивании белка, а также влияют на сортировку белков в биосинтетическом трафике2. Масс-спектрометрия широко используется для анализа гликанов, высвобождаемых при расщеплении экзогликозидазы (гликомика). Остальные дегликозилированные пептиды (гликопротеомика) обычно используются для идентификации последовательностей гликозилированных пептидов у эукариот3. Идентификация N-связанных гликанов у Campylobacter jejuni показала, что N-гликозилирование не ограничивается эукариотами 4,5,6,7,8. Однако для бактерий не хватает эффективных экзогликозидаз или эндогликозидаз для высвобождения олигосахаридов для анализа гликанов.

Был разработан альтернативный подход к характеристике сайтов гликозилирования и структур гликанов в гликопротеинах, который основан на использовании неспецифического протеолиза для переваривания основного остова большинства пептидов и получения псевдоолигосахаридов, которые содержат всего несколько аминокислот. Для получения псевдоолигосахаридов использовались различные неспецифические ферменты, и было обнаружено, что проназа Е обеспечивает наиболее эффективное и воспроизводимоепищеварение. Мы разработали стратегию гликомики на основе проназы Е для анализа N-гликанов C. jejuni 10,11. Псевдоолигосахариды анализировали непосредственно с помощью масс-спектрометрии с капиллярным электрофорезом (CE-MS) и/или с помощью матричной лазерной десорбционной/ионизационной времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF MS) после перметилирования.

Здесь описан универсальный метод гликомического анализа, который использует неспецифическое расщепление и перметилирование проназы Е для изучения гликозилирования из патогена слизистой оболочки C. jejuni. Этот метод способен охарактеризовать N-связанные гликаны, экспрессируемые как эукариотическими, так и бактериальными системами, а также полезен для идентификации новых промежуточных продуктов в путях N-связанного гликозилирования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Культивирование C. jejuni 11168H и экстракция общих белков

ПРИМЕЧАНИЕ: C. jejuni 11168H является гипермоторным клональным производным NCTC 1116812.

  1. Начните культивирование клеток с регидратации клеточной гранулы (приблизительно 0,15 г, NCTC) с помощью приблизительно 5 мл питательной среды Мюллера-Хинтона. Используйте несколько капель первичной пробирки с бульоном для инокуляции агаровой пластины Мюллера-Хинтона. Инкубировать при 37 °C в течение 18 ч в микроаэрофильной атмосфере, т.е. 5%O2, 10%CO2 и 85%N2.
  2. Соберите бактериальные газоны с 1 мл бульона Brain Heart Infusion (BHI). Разбавьте собранный урожай примерно до 1 x 105 c.f.u./мл с бульоном BHI. Выращивать клетки в течение 18 ч с встряхиванием (100 об/мин) в микроаэрофильной атмосфере при 37 °С.
  3. Охладите ячейки, положив пластины на лед на 10 минут, и соберите клетки центрифугированием (4 500 x g при 4 °C). Выбросьте надосадочную жидкость и промойте клетки 2x в 3 л ледяного 0,1 М Tris-HCl (pH 7,8).
  4. Ресуспендируйте клетки (10 8-10 и11клеток C. jejuni) в 8 мл ледяного 0,1 М Tris-HCl (pH 7,8) и лизируйте с помощью ультразвука (Таблица материалов). Выполняйте ультразвуковую обработку следующим образом: импульс 4 с, выкл 1 с, каждый раз по 1 минуте и всего три раза. 
  5. Центрифугируйте при давлении 9 500 x g в течение 45 мин при 4 °C и перенесите надосадочную жидкость в другую пробирку. Диализируйте белки надосадочной жидкости 2x против 0,1 М Tris-HCl (pH 7,5) при 4 °C в течение 3 ч.
  6. Определяйте концентрации белка с помощью коммерчески доступного Protein Assay13 (должен быть в диапазоне от 4 до 6 мкг/мкл).
  7. Растворите 1 мг белков в 1 мл 0,1 М буфера Tris-HCl (pH 7,5) и добавьте в раствор 2,5 мг Pronase E. Инкубировать при 37 °C в течение 48 ч, после чего кипятить раствор при 100 °C в течение 5 мин для дезактивации фермента.
  8. Храните раствор для расщепления белка при температуре -80 °C для дальнейшего использования.

2. Очистка с использованием пористого графитового углерода (ПГК)

  1. Активируйте картриджи PGC (100 мг, 5 мл) путем добавления 1 мл 80% (v/v) ацетонитрила (ACN), содержащего 0,1% трифлоуксусной кислоты (TFA), и повторите 2 раза.
  2. Промойте картридж PGC 1 мл воды 3 раза.
  3. Загрузите расщепление проназы Е из 1 мг белка на ПГК (объем зависит от концентрации белка).
  4. Каждый раз промывайте картридж 1 мл воды, чтобы удалить соли.
  5. Элюируйте Asn-гликаны с 1 мл 25% АКН в 0,1 % ТЖК, а затем 1 мл 50% АКН в 0,1 % ТЖК.
  6. Объедините обе фракции и высушите образцы с помощью охлаждаемого вакуумного концентратора (Таблица материалов) для дальнейшей обработки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте растворители класса MS для очистки Asn-гликаном.

3. Перметилирование Asn-гликанов

  1. Солюбилизируйте высушенные Asn-гликаны со 100 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) в пробирке объемом 1,5 мл.
  2. Приготовьте суспензию ДМСО-NaOH, смешав две гранулы NaOH с 2 мл ДМСО. Добавьте в образец 200 μл суспензии DMSO-NaOH и 100 μл метилйодида.
  3. Плотно закройте тюбик и помешивайте при 3 000 об/мин в течение 10 минут при комнатной температуре с помощью вихревого миксера.
  4. Угасите перметилирование, добавив 1 мл воды.
  5. Добавьте 1 мл хлороформа и вортекс на 1 мин для извлечения перметилированных Asn-гликанов.
  6. Центрифуга при 9 000 x g в течение 3 мин. Удалите надосадочную жидкость и оставьте нижнюю хлороформную фазу с перметилированными Asn-гликанами.
  7. Органический слой промыть, добавив 1 мл воды с вортексированием на 1 мин. Центрифугируйте при давлении 9 000 x g в течение 3 минут и удалите надосадочную жидкость. Повторите 2 раза.
  8. Поместите органическую фазу в вытяжной шкаф и дайте ей высохнуть струей азота при комнатной температуре.
  9. Храните перметилированные Asn-гликаны при температуре -80 °C для масс-спектрометрического анализа.

4. Масс-спектрометрия с ионизационной ионизацией электрораспылением (ЭСИ-МС) и анализ ЭСИ-МС/МС

  1. Растворите перметилированные Asn-гликаны в 20 мкл 50% 2-пропанола в воде (v/v).
  2. Анализ CE-ESI-MS проводят с использованием 90-сантиметрового капилляра из плавленого диоксида кремния с потоком 50% 2-пропанола в воде со скоростью 1 μл/мин.
    Примечание: КЭ-МС — это система, сочетающая в себе капиллярный электрофорез (КЭ) и масс-спектрометрию. CE разделяют ионы на основе их ионной подвижности. В этом протоколе система CE используется для ввода мельчайшего объема проб и выполнения обессоливания в режиме реального времени.
  3. Установите напряжение ESI на 5 кВ в положительный режим.
  4. Загрузите перметилированные образцы Asn-гликана при давлении 500 мбар на 0,2 мин, что соответствует примерно 100 нл.
  5. Получение данных MS с помощью масс-спектрометра (Таблица материалов) с использованием следующих параметров сбора.
    1. Для полного МС установите время задержки на уровне 2,0 мс с шагом 0,1 м/з. В экспериментах MS2 и MS3 с расширенным сканированием ионов продукта (EPI) установите скорость сканирования на 4000 Да/с с захватом Q0. Установите время заполнения ловушки как Динамическое и разрешение Q1 как Единица измерения. Для экспериментов MS3 установите коэффициент возбуждения, чтобы убедиться, что выбран только моноизотопный пик для одного заряженного прекурсора. Установите время возбуждения на 100 мс.

5. Анализ перметилированных гликанов методом MALDI-TOF MS

  1. Растворите перметилированные Asn-гликаны в 10 мкл 50% метанола/воды (v/v).
  2. Смешайте 1 мкл растворенных Asn-гликанов с 2 мкл раствора 2,5-дигидроксибензойной кислоты (10 мг/мл в 50% ацетонитриле/воде (v/v)).
  3. Добавьте 1 л смешанного образца в 384-луночный планшет MALDI и подождите, пока образец полностью высохнет.
  4. Вставьте пластину в масс-спектрометр MALDI-TOF, оснащенный импульсным азотным лазером (337 нм). Установите ускоряющее напряжение на 20 кВ в положительный режим.
  5. Установите мощность лазера на произвольный масштаб 6 000 и получите данные в режиме положительного рефлектрона от m/z от 1 000 до 5 000.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Метод, основанный на сочетании расщепления проназы Е и перметилирования, был применен к анализу N-гликанов из экстрактов общего белка C. jejuni 11168H. На рисунке 1 показана блок-схема экспериментальной процедуры. При типичном пищеварении соотношение фермента и гликопротеина было установлено в диапазоне от 1:100 до 1:20. В этом случае отношение проназы Е к белку увеличивали до 2:1-3:1, и для получения отработанного сбраживания путем инкубации при 37 °C в течение 48 часов использовал...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В протоколе есть два важнейших шага для реализации этой универсальной стратегии гликомики. Первым важным этапом является завершение сбраживания выхлопных газов. Этот метод сильно зависит от завершения расщепления проназы Е. Таким образом, важно использовать длительное время переваривания и высокое соотношение ферментов и белков. Как правило, рекомендуется использовать соотношение 2:1-3:1 для проназы Е/белка, а время инкубации составляет 48 часов. Было продемонстрировано, что в результате...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов.

Благодарности

Авторы благодарят Кеннета Чана, Дэвида Макнелли, Харальда Нотхафта, Кристин М. Шимански, Жана-Робера Бриссона и Элеонору Альтман за помощь и полезные дискуссии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2,5-дигидроксибензойная кислота (DHB),Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури149357
2-пропанолFisher Scientific (Оттава, Онтарио, Канада)AA22906K7
4000 Q-TrapAB Sciex (Конкорд, Канада)Масс-спектрометр
4800 MALDI-TOF/TOFApplied Biosystems (Фостер-Сити, Калифорния)Масс-спектрометр
ацетонитрил ( ACN)Fisher Scientific (Оттава, Онтарио, Канада)A996-4
Бульон для инфузии сердца (BHI)Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури)5121
C18 Sep-Pak картриджиWaters (Милфорд, Массачусетс).
хлороформSigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури)CX1054
DifcoFisher Science (Оттава, Онтарио, Канада)DF0037-17-8
Диметилсульфоксид (ДМСО)Science (Сент-Луис, Миссури)Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури)276855
Eppendorf tubeDiamed (Миссисога Онтарио, Канада)SPE155-N
ледниковая уксусная кислота кислотаSigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури)A6283
метанолFisher Scientific, Оттава, Онтарио,Канада)A544-4
метилйодидSigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури)289566
картридж PGCThermo Scientific (Уолтем, Массачусетс)60106-303Пористый графитовый углерод
Pronase ESigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури)7433-2
Набор для анализа белкаBio-rad (Миссиссога, Онтарио, Канада)5000001
Охлаждаемый вакуумный концентраторThermo Scientific (Уолтем, Массачусетс)SRF110P2-230
гидроксид натрияSigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури)367176
процессорMandel Scientific (Гуэлф, Онтарио, Канада)XL 2020
Трифлуоуксусная кислота (ТФК)Fisher Scientific (Оттава, Онтарио, Канада)A11650
Tris-HClSigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури)T3253
WAT036945 Fisher ультразвуковой

Ссылки

  1. Dwek, R. A. Glycobiology: more functions for oligosaccharides. Science. 269 (5228), 1234-1235 (1995).
  2. Scheiffele, P., Peränen, J., Simons, K. N-glycans as apical sorting signals in epithelial cells. Nature. 378 (6552), 96-98 (1995).
  3. Hofmann, J., Hahm, H. S., Seeberger, P. H., Pagel, K. Identification of carbohydrate anomers using ion mobility-mass spectrometry. Nature. 526 (7572), 241-244 (2015).
  4. Kowarik, M., et al. N-linked glycosylation of folded proteins by the bacterial oligosaccharyltransferase. Science. 314 (5802), 1148-1150 (2006).
  5. Young, N., et al. Structure of the N-linked glycan present on multiple glycoproteins in the Gram-negative bacterium, Campylobacter jejuni. Journal of Biological Chemistry. 277 (45), 42530-42539 (2002).
  6. Wacker, M., et al. N-linked glycosylation in Campylobacter jejuni and its functional transfer into E. coli. Science. 298 (5599), 1790-1793 (2002).
  7. Szymanski, C. M., Wren, B. W. Protein glycosylation in bacterial mucosal pathogens. Nature Review Microbiology. 3, 225-237 (2005).
  8. Linton, D., et al. Functional analysis of the Campylobacter jejuni N-linked protein glycosylation pathway. Molecular Microbiology. 55 (6), 1695-1703 (2005).
  9. Nwosu, C. C., et al. Simultaneous and Extensive Site-specific N- and O-Glycosylation Analysis in Protein Mixtures. Analytical Chemistry. 85, 956-963 (2013).
  10. Liu, X., et al. Mass spectrometry-based glycomics strategy for exploring N-linked glycosylation in eukaryotes and bacteria. Analytical Chemistry. 78 (17), 6081-6087 (2006).
  11. Nothaft, H., Liu, X., McNally, D. J., Li, J., Szymanski, C. M. Study of free oligosaccharides derived from the bacterial N-glycosylation pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 15019-15024 (2009).
  12. Macdonald, S. E., et al. Draft genome sequence of Campylobacter jejuni 11168H. Genome Announcements. 5 (5), e01556(2017).
  13. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  14. Liu, X., Chan, K., Chu, I. K., Li, J. Microwave-assisted nonspecific proteolytic digestion and controlled methylation for glycomics applications. Carbohydrate Research. 343 (17), 2870-2877 (2008).
  15. Liu, X., et al. 34;One-pot" methylation in glycomics application: Esterification of sialic acids and permanent charge construction. Analytical Chemistry. 79 (10), 3894-3900 (2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

NEAsn
Видео скоро будет доступно

Похожие статьи