Методическая статья

Выделение и анализ прослеживаемых и функционализированных внеклеточных везикул из плазмы и твердых тканей

DOI:

10.3791/63990

⸱

17 октября 2022 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Military Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases & Shaanxi International Joint Research Center for Oral Diseases, Center for Tissue Engineering, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 2Department of Orthodontics, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 3Department of VIP Dental Care, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 4School of Basic Medicine, The Fourth Military Medical University, 5College of Life Science, Northwest University, 6Xi'an Institute of Tissue Engineering and Regenerative Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В настоящем протоколе описан способ извлечения внеклеточных везикул из периферической крови и солидных тканей с последующим профилированием поверхностных антигенов и белковых грузов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Циркулирующие и резидентные в тканях внеклеточные везикулы (ВВ) представляют собой многообещающие мишени в качестве новых тераностических биомаркеров, и они становятся важными игроками в поддержании гомеостаза организма и прогрессировании широкого спектра заболеваний. В то время как текущие исследования сосредоточены на характеристике эндогенных экзосом эндосомального происхождения, микровезикулы, выделяющиеся из плазматической мембраны, привлекают все большее внимание к здоровью и болезням, которые характеризуются обилием поверхностных молекул, повторяющих мембранную сигнатуру родительских клеток. Здесь представлена воспроизводимая процедура, основанная на дифференциальном центрифугировании для извлечения и характеристики EV из плазмы и твердых тканей, таких как кость. Далее в протоколе описывается последующее профилирование поверхностных антигенов и белковых грузов EV, которые, таким образом, прослеживаются на предмет их происхождения и идентифицируются с компонентами, связанными с потенциальной функцией. Этот метод будет полезен для коррелятивного, функционального и механистического анализа ЭВ в биологических, физиологических и патологических исследованиях.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Внеклеточные везикулы (ВВ) были предложены для определения высвобождаемых клетками липидных двухслойных внеклеточных структур1, которые играют важную роль в различных физиологических и патологических событиях2. ЭВ, высвобождаемые здоровыми клетками, можно разделить на две основные категории, а именно экзосомы (или малые ВВ), образующиеся через внутриклеточный эндоцитарный путьтрафика 3 , и микровезикулы (или большие ЭВ), развивающиеся в результате почкования плазматической мембраны клетки4 наружу. В то время как многие исследования сосредоточены на функции ЭВ, собранных из культивируемых клеток in vitro5, ВВ, полученные из кровообращения или тканей, являются более сложными и неоднородными, что имеет то преимущество, что отражает истинное состояние организма in vivo6. Кроме того, почти все виды тканей могут продуцировать ЭВ in vivo , и эти ЭВ могут действовать как мессенджеры внутри ткани или переноситься различными жидкостями организма, особенно периферической кровью, для облегчения системной коммуникации7. ВВ в кровообращении и тканях также являются мишенями для диагностики и лечения заболеваний8.

В то время как экзосомы интенсивно изучались в последние годы, микровезикулы также обладают важными биологическими функциями, которые могут быть легко извлечены без ультрацентрифугирования, что способствует фундаментальным и клиническим исследованиям9. Примечательно, что критическая проблема, касающаяся EV, выделенных из кровообращения и тканей, заключается в том, что они получены из разных типов клеток10. Поскольку микровезикулы выводятся из плазматической мембраны и характеризуются обилием молекулклеточной поверхности 9, возможно использование маркеров родительской клеточной мембраны для идентификации клеточного происхождения этих EV. В частности, метод проточной цитометрии (FC) может быть применен для обнаружения мембранных маркеров. Кроме того, исследователи могут изолировать электромобили и проводить дальнейший анализ на основе функциональных грузов.

Настоящий протокол предусматривает тщательную процедуру извлечения и определения характеристик электромобилей из образцов in vivo. EV выделяют с помощью дифференциального центрифугирования, а характеристика EV включает морфологическую идентификацию с помощью анализа отслеживания наночастиц (NTA) и просвечивающей электронной микроскопии (TEM), анализ происхождения с помощью FC и анализ белкового груза с помощью вестерн-блоттинга. В качестве представителей используется плазма крови и верхнечелюстная кость мышей. Исследователи могут ссылаться на этот протокол для электромобилей из других источников и вносить соответствующие изменения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эксперименты на животных проводились в соответствии с Руководством Комитета по уходу за животными и их использованию Четвертого военно-медицинского университета и руководящими принципами ARRIVE. Для настоящего исследования использовались 8-недельные мыши C57Bl / 6 (без предпочтения ни самок, ни самцов). Этапы, связанные с выделением плазменных и тканевых EV, проиллюстрированы на рисунке 1. Плазма взята в качестве репрезентативной для описания процедуры выделения EV из жидкостей организма. Верхнечелюстная кость берется в качестве репрезентативной для объяснения процедуры изоляции EV от твердых тканей.

1. Подготовка образцов плазмы и верхнечелюстной кости

  1. Подготовьте образцы плазмы, выполнив следующие действия.
    1. Определите массу тела мыши с помощью стандартных лабораторных весов.
    2. Добавьте 20 мкл, 2 мг/мл гепарина в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл и используйте смесительное устройство (см. Таблицу материалов), чтобы гепарин прикрепился к стенке пробирки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Антикоагулянтные трубки также можно использовать непосредственно для сбора крови.
    3. Обезболивают мышей внутрибрюшинной инъекцией 50 мг/кг пентобарбитала натрия (см. Таблицу материалов). Возьмитесь за шею мыши большим и указательным пальцами, затем зафиксируйте мизинцем хвост и левую заднюю ногу и введите пентобарбитал натрия шприцем для инъекций объемом 1 мл после обнажения живота.
    4. Подтвердите, что мышь правильно обезболена, основываясь на отсутствии рефлекса роговицы и реакции конечностей при защемлении подушечки стопы.
    5. Сбрейте волосы на лице и ресницы глаз изогнутыми ножницами.
    6. Возьмитесь за кожу шеи мыши и прижмите кожу вокруг глаз к задней части шеи так, чтобы глазное яблоко выступало. Используйте офтальмологический пинцет, чтобы быстро зажать глазное яблоко, и соберите отток крови с помощью центрифужных пробирок объемом 1,5 мл, подготовленных на этапе 1.1.2. Пожертвуйте мышью, вывихнув шейный позвонок.
      ВНИМАНИЕ: Будьте осторожны с волосами и ресницами, потому что они могут вызвать гемолиз.
    7. Аккуратно переверните трубку вверх дном несколько раз, чтобы предотвратить свертывание крови.
      ВНИМАНИЕ: Как можно скорее переверните трубку вверх дном.
    8. Центрифугируйте образец крови в течение 15 мин при 1 200 x g при 4 ° C.
    9. Осторожно перенесите надосадочную жидкость в новые и чистые центрифужные пробирки объемом 1,5 мл и немедленно используйте образец плазмы или храните его при температуре 4 ° C в течение нескольких часов.
    10. Разбавьте надосадочную жидкость равным объемом 1x фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) и хорошо перемешайте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приведенный выше протокол для сбора плазмы приводит к летальному исходу. Кровь также может быть собрана через пункцию подключичной вены11 без ущерба для мыши.
  2. Подготовьте образцы верхнечелюстной кости, выполнив следующие действия.
    1. Изолируйте верхнечелюстную кость с помощью офтальмологического пинцета и ножниц и промойте их PBS, чтобы избавиться от мягких тканей пинцетом.
    2. Поместите верхнечелюстную кость в центрифужные пробирки объемом 1,5 мл и разрежьте кость на мелкие кусочки (размер должен быть менее 1 мм в диаметре) ножницами. Добавьте определенное количество Libera (5 мкг / мл, см. Таблицу материалов), чтобы покрыть ткань (обычно 1 мл для образцов костей от 8-недельной мыши), а затем инкубируйте в течение 30 минут при 37 ° C.
    3. Центрифугируют образец при 800 x g в течение 10 мин при 4 °C.
    4. Осторожно перенесите надосадочную жидкость с помощью пипетки в новые и чистые центрифужные пробирки объемом 1,5 мл.

2. Извлечение электромобилей

  1. Центрифугируют образцы (приготовленные на этапах 1.1.10 и 1.2.4) в течение 15 мин при 2 500 x g (4 °C) для удаления крупного клеточного мусора и оставшихся тромбоцитов.
  2. Осторожно перенесите надосадочные жидкости в новые и чистые центрифужные пробирки объемом 1,5 мл и центрифугу в течение 30 мин при 16 800 x g (4 °C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость центрифугирования может быть установлена на более чем 10 000 x g для извлечения EV12. Чем выше скорость центрифуги, тем большее количество электромобилей можно получить. Поскольку предельная скорость центрифуги, которую мы использовали, составляет 16 800 x g (см. Таблицу материалов), мы выбрали эту скорость в этом протоколе.
  3. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулы в каждой пробирке с 1 мл PBS. Центрифуга в течение 30 мин при 16 800 x g (4 °C).
  4. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулы в каждой пробирке с 50 мкл PBS. Храните эти образцы при температуре 4 °C менее 24 часов или, предпочтительно, немедленно используйте для следующих анализов (этапы 3-5).
    ВНИМАНИЕ: Хранение при -80 °C недопустимо, так как это снизит концентрацию EV и увеличит размеры частиц EV13, тем самым влияя на последующий анализ EV.

3. Морфологическая идентификация ВВ

  1. Выполните NTA-анализ.
    1. В зависимости от количества EV (грубо судят по размеру гранул, частицы плазмы 50 мкл являются минимальными), перенесите 5-50 мкл ресуспендирования (этап 2.4), разбавьте в 10 мл буферного раствора (PBS отфильтровали фильтром 0,22 мкм) и достаточно смешайте с наконечниками микропипеток объемом 1 мл. Используйте эту окончательную суспензию для измерения частиц.
    2. Используйте стерильный шприц объемом 1 мл для введения не менее 5 мл дистиллированной воды с умеренной и постоянной скоростью до тех пор, пока количество частиц, отображаемых на интерфейсе обнаружения, не станет менее пяти.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После впрыска 1 мл дистиллированной воды по всему каналу количество частиц отображается непосредственно на интерфейсе обнаружения. Если число все еще превышает пять, продолжайте вводить 1 мл дистиллированной воды до тех пор, пока критерии не будут выполнены.
    3. Восстановите 1 мкл калибровочного раствора в 1 мл дистиллированной воды для получения первичного раствора, а затем возьмите 100 мкл первичного раствора на 25 мл дистиллированной воды для приготовления стандартного исходного раствора (1:250 000). Хранить этот рабочий реагент при температуре 4 °C в течение 1 недели.
    4. Откалибруйте прибор NTA с помощью стандартного исходного раствора (этап 3.1.3). Введите 1-5 мл рабочего калибровочного раствора стерильным шприцем объемом 1 мл для промывки канала машины до тех пор, пока количество частиц, отображаемых на интерфейсе обнаружения, не достигнет 50-400 (предпочтительно около 300). Запустите программу калибровки.
    5. Повторите шаг 3.1.2 для промывки канала машины перед каждым измерением образца.
    6. Используйте стерильный шприц объемом 1 мл для введения не менее 2 мл буферного раствора для промывки канала машины с постоянной скоростью до тех пор, пока количество частиц, отображаемых на интерфейсе обнаружения, не станет меньше 10.
    7. Введите 1 мл образца EV, приготовленного на этапе 3.1.1, с умеренной и постоянной скоростью (рекомендуемая скорость 0,5-1 мл / с).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальной концентрацией частиц является то, что количество частиц, отображаемых на границе раздела детектирования, составляет от 50 до 400, предпочтительно около 300. Если количество частиц слишком велико, повторите шаг 3.1.2, чтобы немедленно промыть канал машины, чтобы избежать задержки частиц на стенке канала, и отрегулируйте концентрацию образца EV с помощью шага 3.1.1, затем повторите с шага 3.1.5.
    8. Проведите анализ частиц и сформируйте отчеты об анализе в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов).
    9. Если образец ценный, откачайте образец EV с помощью шприца объемом 1 мл и соберите его в центрифужные пробирки объемом 1,5 мл. Повторите шаг 2.2, чтобы извлечь электромобили.
    10. После обнаружения всех образцов введите не менее 2 мл буферного раствора в канал машины, а затем введите не менее 5 мл дистиллированной воды до тех пор, пока количество частиц, отображаемых на интерфейсе обнаружения, не станет менее пяти.
    11. Используйте стерильный шприц объемом 5 мл для введения не менее 10 мл воздуха с постоянной скоростью (рекомендуемая скорость составляет 1 мл / с) для удаления воды из канала.
  2. Проведите анализ ПЭМ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните следующие шаги со свежей ресуспендацией электромобиля. Сетка электронного микроскопа с формварно-углеродным покрытием имеет две стороны, причем рабочая сторона светится в центральных сетках. Минимальный объем плазмы для извлечения ЭВ для приведенной ниже процедуры составляет 50 мкл.
    1. Смешайте образец EV (этап 2.4) с равным объемом 4% параформальдегида (PFA). Поместите 4 мкл электромобилей на одну сетку и инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре (RT).
    2. Четыре капли ПБС (одна капля равна 50 мкл) нанести на лист полиэтиленовой пленки (см. Таблицу материалов). Переложите сетки чистым микроскопическим пинцетом и промойте рабочую сторону сетки в ПБС от одной капли до другой.
    3. Используйте фильтровальную бумагу, чтобы удалить лишние PBS, оставшиеся в сетках.
    4. Инкубируйте рабочую сторону решетки в 1% фосфовольфрамовой кислоте (см. Таблицу материалов) в течение 2 мин, а затем повторите шаг 3.2.2.
      ВНИМАНИЕ: Поскольку фосфовольфрамовая кислота ядовита, эту процедуру необходимо выполнять в вытяжном шкафу, а избыточную фосфовольфрамовую кислоту необходимо специально перерабатывать, а не выбрасывать напрямую.
    5. Положите решетки лицевой стороной вверх в 10-сантиметровую посуду, застеленную фильтровальной бумагой. Сетки могут храниться при РТ в течение нескольких лет.
    6. Наблюдайте за сетками под электронным микроскопом, следуя инструкциям производителя (см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы обеспечить наблюдение за отдельными частицами, концентрация EV должна быть отрегулирована, а суспензия должна быть прозрачной без явной мутности. Перед каплей пробу следует хорошо перемешать. Репрезентативные анализы ТЕА и НТА показаны на рисунке 2.

4. Анализ происхождения электромобилей

ПРИМЕЧАНИЕ: Идентификация клеточного происхождения ЭВ требует применения антител к типичным маркерам клеточной мембраны. Минимальный объем плазмы для извлечения ЭВ для приведенной ниже процедуры составляет 300 мкл. Основываясь на липидных двухслойных структурах ВВ, для их маркировки можно использовать мембранный краситель. Для образцов плазмы крови для представления выбирается CD18 для лимфоцитов14 . Для образцов верхнечелюстной кости в качестве примера выбран остеокласт-ассоциированный рецептор (OSCAR) для остеокластов15 . Перед FC убедитесь, что проточный цитометр адаптирован к измерению EVs16, так как нижний предел размера в значительной степени отличается между различными проточными цитометрами.

  1. Ресуспендируют образцы (этап 2.4) 500 мкл PBS и переносят 50 мкл в новую и чистую центрифужную пробирку объемом 1,5 мл в качестве заготовки (пробирка A) и еще 50 мкл в новую и чистую центрифужную пробирку объемом 1,5 мл в качестве простой пробирки для окрашивания для FITC (пробирка B). Добавьте 0,5 мкл мембранного красителя в первичную пробирку для окрашивания мембраны. Инкубировать в течение 5 минут при РТ.
  2. Центрифугируйте первичную пробирку в течение 30 мин при 16 800 x g (4 °C). Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулы 200 мкл PBS.
  3. Разделите каждый образец объемом 50 мкл на четыре центрифужные пробирки по 1,5 мл для простого окрашивания пробирок для ПЭ (пробирка С), окрашивания поверхностными маркерами (пробирка D) и контроля только вторичных антител (пробирка E).
  4. Добавьте первичное антитело OSCAR в образцах EV кости, а также антитело CD18 в образцах EV в плазме (см. Таблицу материалов) в пробирку B (этап 4.1) и пробирку D (стадия 4.3) отдельно (разбавленную в соотношении 1:100). Инкубировать в течение 1 ч при 4 °C.
  5. Центрифугируйте пробирки в течение 30 мин при 16 800 x g (4 °C). Выбросьте надосадочную жидкость, ресуспендируйте гранулы с 500 мкл PBS, а затем снова центрифугу в течение 30 мин при 16 800 x g (4 ° C) для удаления лишних первичных антител.
  6. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулы 50 мкл PBS с последующим добавлением вторичных антител, конъюгированных с FITC (см. Таблицу материалов), соответственно (разбавленных в соотношении 1:200) (пробирка E). Добавьте одни и те же вторичные антитела в пробирку B (этап 4.1) и пробирку D (этап 4.3). Инкубировать все пробирки в течение 1 ч, при 4 °C в темноте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Прямые флуоресцентно-конъюгированные меченые антитела также могут быть использованы для обработки обнаружения FC с надлежащим контролем изотипа.
  7. Разбавьте одну каплю суспензии шариков размером 0,2, 0,5 и 1 мкм (см. Таблицу материалов) соответственно в 1 мл PBS и сначала запустите шарики каждого размера, чтобы убедиться, что затвор выбран для электромобилей. Установите пороговое значение проточного цитометра для поиска шариков и популяции EV с помощью подходящего прямого рассеяния (FSC) и бокового рассеяния (SSC).
    1. Установите конечное условие как расчет 100 000 частиц, окрашенных в мембрану. Проанализируйте образец с помощью проточного цитометра в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов). Репрезентативные результаты показаны на рисунке 3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оборудование NTA с флуоресцентными каналами также может использоваться для анализа происхождения, а подготовка образцов такая же, как и FC.

5. Анализ содержания белка в электромобилях

ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ содержания белка в EV проводится с помощью вестерн-блоттинга. Например, плазменные и костные EV были отобраны для анализа 6-фосфоглюконатдегидрогеназы (ПГД) и пируваткиназы М2 (PKM2) на метаболический статус. Golgin84 (органелла Гольджи) использовали в качестве отрицательного контроля, а флотиллин (мембранный белок), кавеолин (интегральный белок кавеол) и β-актин (цитоскелет)17 использовались в качестве положительного контроля в EV по сравнению с образцами клеток. Митофилин и α-актинин-4 были выбраны в качестве больших маркеров EV, в то время как CD9 и CD81 были выбраны в качестве небольших маркеров EV для демонстрации субпопуляций EV18. Apoa1 был выбран в качестве маркералипопчастиц плазмы 19. Сведения о соответствующем реагенте см. в таблице материалов.

  1. Ресуспендируют гранулы (этап 2.4) в 50 мкл лизирующего буфера RIPA и инкубируют в течение 30 мин на льду.
  2. Количественно определите концентрацию белка во всех образцах в 96-луночной микропланшете с помощью анализа белка BCA в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов).
    1. Разбавьте 2 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (BSA) 0,9% физиологического раствора (NS) (содержащего 0,9% (мас./об.) хлорида натрия) до 0,5 мг/мл. Добавьте 0,5 мг/мл BSA и 0,9% NS в три дублированные лунки с определенными объемами, как показано в таблице 1.
    2. Опустите 2 мкл образцов (этап 5.1) и добавьте 18 мкл NS в три дублированные лунки отдельно.
    3. Приготовьте рабочий раствор, смешав реагент BCA A с реагентом B (50:1 Reagent A:B). Добавьте по 200 мкл рабочего раствора в каждую лунку и осторожно встряхните в течение 30 с.
    4. Инкубируйте 96-луночную микропланшет в течение 20-25 минут при 37 °C.
    5. Измерьте наружный диаметр на длине волны 596 нм с помощью спектрофотометра (см. Таблицу материалов).
    6. Экспортируйте данные.
    7. Нарисуйте стандартную кривую и рассчитайте концентрацию белка в образцах.
  3. Согласно результатам, разбавляют образцы до 1 мкг/мкл с 0,9% NS и 5-кратным загрузочным буфером SDS-PAGE (250 мМ Tris· HCl, pH 6,8, 10% SDS, 30% (об./об.) глицерина, 10 мМ DTT, 0,05% (мас./об.) бромфенольного синего, см. Таблицу материалов). Плотно закройте трубки пленкой и нагревайте в течение 5 минут при 100 °C.
  4. Загрузите образцы и белковую лестницу в градиентную концентрацию 4-20% геля Hepes-Tris (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите процентное содержание геля в соответствии с молекулярной массой интересующих белков.
  5. Запустите гель в проточном буфере при 80 В, пока белки не образуют линию, а затем переключитесь на 120 В в течение 1 ч, пока загрузочный краситель не окажется на дне геля.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время работы может варьироваться в зависимости от используемого оборудования или типа и концентрации геля.
  6. Перенесите гель на мембрану из поливинилиденфторида (PVDF) (см. Таблицу материалов), предварительно инкубированную в метиловом спирте в течение 20 с. Используйте систему влажного переноса для переноса в течение 1 часа при 200 мА.
    ВНИМАНИЕ: Убедитесь, что внутри системы переноса нет пузырьков, и держите мембрану PVDF влажной.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время переноса может варьироваться в зависимости от молекулярной массы белка-мишени; 1 KD обычно требуется 1 мин.
  7. Приготовьте 5% буфер, блокирующий BSA, добавив 2,5 г BSA (см. Таблицу материалов) в 50 мл трис-буферного физиологического раствора-твина (TBST) (2 мл Tween добавляют в 2 л раствора PBS) в центрифужную пробирку объемом 50 мл. Взбалтывайте до тех пор, пока порошок не растворится. Блокируют мембраны в этом буфере на 2 ч при РТ при перемешивании.
  8. Инкубируют мембраны со специфическими первичными антителами, разбавленными TBST до надлежащей концентрации (митофилин, 1:1000; α-актинин-4, 1:1000; CD9, 1:1000; CD81, 1:1000; Апоа1, 1:1000; Гольгин84, 1:1000; Флотилин-1, 1:1000; Кавеолин-1, 1:1000; ПГД, 1:1000; ПКМ2, 1:1000; β-актин, 1:3000) на ночь при 4 °C.
  9. Промойте мембраны в моющем буфере (2 мл Tween, добавленного в 2 л раствора PBS) четыре раза (каждый раз по 15 мин) и инкубируйте мембраны с подходящими вторичными антителами в соотношении 1:4000 в течение 1 ч при RT с перемешиванием.
  10. Промойте мембраны в моющем буфере четыре раза (каждый раз по 15 минут) и сделайте снимок мембран с помощью набора для хемилюминесценции и системы визуализации геля (см. Таблицу материалов).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Согласно экспериментальному рабочему процессу, ЭВ могут быть извлечены из периферической крови и твердых тканей (рис. 1). Верхнечелюстная кость мыши в возрасте 8 недель составляет примерно 0,1 ± 0,05 г, и у мыши можно собрать около 300 мкл плазмы. Следуя этапам протокола, можно собрать 0,3 мг и 3 мкг EV соответственно. Как проанализировано TEM и NTA, типичными морфологическими характеристиками EV являются круглые чашеобразные мембранные везикулы диаметром от 50 до 300 нм (

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

При изучении особенностей, судьбы и функций электромобилей крайне важно изолировать электромобили с высокой производительностью и низким уровнем загрязнения. Существуют различные методы извлечения EV, такие как центрифугирование в градиенте плотности (DGC), эксклюзионная хроматография (SEC) и анализы иммунозахвата 4,20. Здесь был использован один из наиболее часто используемых методов - дифференциальное центрифугирование; Преимущества этого заключаются в том, что...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликтов интересов, которые необходимо раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантами Национального фонда естественных наук Китая (32000974, 81870796, 82170988 и 81930025) и Китайского фонда постдокторантуры (2019M663986 и BX20190380). Мы благодарны за помощь Национальному экспериментально-учебному демонстрационному центру фундаментальной медицины (АМФУ).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
4% параформальдегида Biosharp143174Просвечивающий электронный микроскоп
Alexa fluor 488 против козы вторичное антителоYeason34306ES60Проточная цитометрия
Alexa fluor 488 против кролика вторичное антителоInvitrogenA11008Проточная цитометрия
Anti-CD18 антителоAbcamab131044Проточная цитометрия
Anti-CD81 антителоAbcamab109201Вестерн-блот
анти-CD9 антителаHuabioET1601-9Вестерн-блот
Анти-митофилин антителаAbcamab110329Вестерн-блот
APOA1 Кролик pAbAbcloneA14211Вестерн-блот
для анализа белка BCATIANGENPA115Вестерн-блот
BLUeye Prestained Protein LadderSigma-Aldrich94964-500ULВестерн-блот
Бычий сывороточный альбуминMP Биомедицинский218072801Вестерн-блот
Кавеолин-1 антителоSanta Cruz Biotechnologysc-53564Вестерн-блот
CellMask Оранжевый окрашиватель плазматической мембраныInvitrogenC10045Проточная цитометрия
ХемилюминесценцияAmersham BiosciencesN/AВестерн-блот
Изогнутые операционные ножницыJZ Хирургический инструментJ21040EV изоляция
Электронные весыZhi KeZK-DSTEV
изоляция Epoch спектрофотометрBioTekN/A Westernblot
Eppendorf tubes Eppendorf3810XEV изоляция
Flotillin-1 антителоPTM BIOPTM-5369Western blot
Гелевая система визуализацииTanon4600Western blot
Golgin84Novusnbp1-83352Western blot
Grids - Formvar/Carbon Coated - Медь 200 мешPolysciences24915Просвечивающий электронный микроскоп
Раствор гепаринаStemCell 7980EV изоляция
Liberase Research GradeSigma-Aldrich5401127001EV изоляция
Микроскопический пинцетJZ Хирургический инструментJD1020EV изоляция
NovoCyte проточный цитометрACEAN/AПроточная цитометрия
Omni-PAGE Hepes-Tris Gels Hepes 4~20%, 10 лунокEpizymeLK206Western blot
OSCAR ( D-19) антителоSanta Cruz BiotechnologySC-34235Проточная цитометрия
PBS (2x)ZHHCPW013Вестерн-блот
Пентобарбитал натрияSigma-Aldrich57-33-0Анестезирующая
пероксидаза AffiniPure Goat Anti-mouse IgG (H+L)Jacson115-035-003Вестерн-блоттинг
Пероксидаза AffiniPure Goat Anti-rabbit IgG (H+L)Jacson111-035-003Вестерн-блоттинг
Фосфовольфрамовая кислотаRHAWN12501-23-4Просвечивающий электронный микроскоп
PKM2(d78a4) xp rabbit  mab Клеточная сигнализация4053tВестерн-блоттинг
Полиэтилен (ПЭ) пленкаXiang yi200150055Просвечивающий электронный микроскоп
Поливинилиденфторидные мембраны Roche3010040001Вестерн блот
Ингибиторы протеазыРош4693132001Вестерн блот
Рекомбинантные анти-ПГД антителаAbcamab129199Вестерн блот
RIPA буфер для лизисаBeyotimeP0013Вестерн блот
SDS-PAGE загрузочный буфер (5x)CwbioCW0027Sвестерн блот
Размер шариковInvitrogenF13839Проточная цитометрия
Настольные высокоскоростные микроцентрифугиHitachiCT15EEV
изоляция Просвечивающий электронный микроскопHITACHIH-7650Просвечивающий электронный микроскоп
Tween-20MP Biomedicals19472Western blot
Vortex Mixer GenieScientific IndustriesSI0425EV изоляция
ZetaView BASIC NTA - Видеомикроскоп для слежения за наночастицами PMX-120Particle MetrixN/AАнализ отслеживания наночастиц
α-Actinin-4 Rabbit mAbAbcloneA3379Вестерн-блот
&бета;-актинCwbioCW0096MВестерн-блоттинг
Набор

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to extracellular vesicles: biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake. Cellular and Molecular Neurobiology. 36 (3), 301-312 (2016).
  2. Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
  3. Van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
  4. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360(2013).
  5. Keshtkar, S., Azarpira, N., Ghahremani, M. H. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: novel frontiers in regenerative medicine. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 63(2018).
  6. Thietart, S., Rautou, P. E. Extracellular vesicles as biomarkers in liver diseases: A clinician's point of view. Journal of Hepatology. 73 (6), 1507-1525 (2020).
  7. Xia, W., et al. Damaged brain accelerates bone healing by releasing small extracellular vesicles that target osteoprogenitors. Nature Communications. 12 (1), 6043(2021).
  8. In’t Veld, S. G. J. G., Wurdinger, T. Tumor-educated pletelets. Blood. 133 (22), 2359-2364 (2019).
  9. Schwager, S. C., Reinhart-King, C. A. Mechanobiology of microvesicle release, uptake, and microvesicle-mediated activation. Current Topics in Membranes. 86, 255-278 (2020).
  10. Brahmer, A., et al. endothelial cells and leukocytes contribute to the exercise-triggered release of extracellular vesicles into the circulation. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1615820(2019).
  11. Yang, H., et al. Blood collection through subclavian vein puncture in mice. Journal of Visualized Experiments. (147), e59556(2019).
  12. Han, L., Lam, E. W., Sun, Y. Extracellular vesicles in the tumor microenvironment: old stories, but new tales. Molecular Cancer. 18 (1), 59(2019).
  13. Gelibter, S., et al. The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12162(2022).
  14. Forsyth, C. B., Mathews, H. L. Lymphocytes utilize CD11b/CD18 for adhesion to Candida albicans. Cellular Immunology. 170 (1), 91-100 (1996).
  15. Kodama, J., Kaito, T. Osteoclast multinucleation: review of current literature. International Journal of Molecular Sciences. 21 (16), 5685(2020).
  16. Welsh, J. A., et al. MIFlowCyt-EV: a framework for standardized reporting of extracellular vesicle flow cytometry experiments. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1713526(2020).
  17. Durcin, M., et al. Characterisation of adipocyte-derived extracellular vesicle subtypes identifies distinct protein and lipid signatures for large and small extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1305677(2017).
  18. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 968-977 (2016).
  19. Noren Hooten, N., et al. Association of extracellular vesicle protein cargo with race and clinical markers of mortality. Scientific Reports. 9 (1), 17582(2019).
  20. Sidhom, K., Obi, P. O., Saleem, A. A review of exosomal isolation methods: is size exclusion chromatography the best option. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6466(2020).
  21. Pietrowska, M., Wlosowicz, A., Gawin, M., Widlak, P. MS-based proteomic analysis of serum and plasma: problem of high abundant components and lights and shadows of albumin removal. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1073, 57-76 (2019).
  22. Coumans, F., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).
  23. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  24. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360(2013).
  25. Coumans, F., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).
  26. Görgens, A., et al. Identification of storage conditions stabilizing extracellular vesicles preparations. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (6), 12238(2020).
  27. Maroto, R., et al. Effects of storage temperature on airway exosome integrity for diagnostic and functional analyses. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1359478(2017).
  28. Zheng, C., et al. Apoptotic vesicles restore liver macrophage homeostasis to counteract type 2 diabetes. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (7), 12109(2021).
  29. Liu, D., et al. Circulating apoptotic bodies maintain mesenchymal stem cell homeostasis and ameliorate osteopenia via transferring multiple cellular factors. Cell Research. 28 (9), 918-933 (2018).
  30. Vander Pol, E., van Gemert, M. J., Sturk, A., Nieuwland, R., van Leeuwen, T. G. Single vs. swarm detection of microparticles and exosomes by flow cytometry. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 10 (5), 919-930 (2012).
  31. Dawson, G. Isolation of lipid rafts (detergent-resistant microdomains) and comparison to extracellular vesicles (exosomes). Methods in Molecular Biology. 2187, 99-112 (2021).
  32. Zhang, G., et al. Extracellular vesicles: Natural liver-accumulating drug delivery vehicles for the treatment of liver diseases. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (2), 12030(2020).
  33. Vella, L. J., et al. A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1348885(2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи