Обнаружение и количественная оценка туннельных нанотрубок с использованием изображений 3D Volume View

Summary

Туннельные нанотрубки (TNT) представляют собой в основном открытые F-актиновые мембранные нанотрубки, которые соединяют соседние клетки, облегчая межклеточную связь. Примечательной характеристикой, которая отличает ТНТ от других клеточных выступов, является парящая природа нанотрубок между клетками. Здесь мы характеризуем TNT, создавая 3D-объемное представление конфокальных изображений z-стека.

Abstract

Недавние открытия показали, что клетки выполняют прямой, дальний, межклеточный перенос через наноразмерные, актин-мембранные каналы, а именно «туннельные нанотрубки» (TNT). ТНТ определяются как открытые, липидные двухслойные мембранные расширения, которые опосредуют непрерывность между соседними клетками диаметром от 50 нм до 1 мкм. ТНТ были продемонстрированы первоначально в нейрональных клетках, но последовательные исследования выявили существование ТНТ в нескольких типах клеток и заболеваниях, таких как нейродегенеративные заболевания, вирусные инфекции и рак. В нескольких исследованиях упоминались близкие, электрически связанные мембранные наноструктуры между соседними клетками как TNT или TNT-подобные структуры.

Выяснение ультраструктуры с точки зрения непрерывности мембраны в конечной точке является технически сложной задачей. Кроме того, исследования клеточно-клеточной коммуникации являются сложными с точки зрения характеристики ТНТ с использованием обычных методов из-за отсутствия специфических маркеров. ТНТ в первую очередь определяются как открытые мембранные протрузии на основе F-актина. Однако одним из основных ограничений является то, что F-актин присутствует во всех типах выступов, что затрудняет дифференциацию ТНТ от других выступов. Одной из примечательных характеристик ТНТ на основе F-актина является то, что эти структуры парят между двумя клетками, не касаясь субстрата. Таким образом, различные F-актин-окрашенные ТНТ можно удобно отличить от других выступов, таких как филоподии и нейриты, на основе их парения между клетками.

Недавно мы показали, что интернализация олигомерного амилоид-β_1-42 (oAβ) через актин-зависимый эндоцитоз стимулирует активированную р21-активированную киназу-1 (PAK1), которая опосредует образование F-актин-содержащих ТНТ, совместно экспрессируемых с фосфо-PAK1 между нейрональными клетками SH-SY5Y. Этот протокол описывает метод 3D-объемного анализа для идентификации и характеристики ТНТ по захваченным z-стековым изображениям F-актин- и фосфо-PAK1-иммуноокрашенных мембранных протрузий в нейронных клетках, обработанных oAβ. Кроме того, ТНТ отличаются от развивающихся нейритов и нейрональных выростов на основе F-актин- и β-III тубулин-иммуноокрашенных мембранных каналов.

Introduction

Туннельные нанотрубки (ТНТ) основаны на F-актинах, в первую очередь на открытых мембранных каналах и играют жизненно важную роль в межклеточном переносе груза и органелл¹. Уникальной характеристикой ТНТ является то, что они соединяют соседние клетки без какого-либо контакта с субстратом; они имеют длину более 10-300 мкм, а их диаметр колеблется от 50 нм до 1 мкм ^2,3. ТНТ являются переходными структурами, и их срок службы длится от нескольких минут до нескольких часов. ТНТ были впервые продемонстрированы в нейронных клетках PC12¹; позже многочисленные исследования....

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки SH-SY5Y, культивируемые в средах DMEM/F-12, дифференцировали 10 мкМ ретиноевой кислоты в течение 7 дней и обрабатывали 1 мкМ oAβ олигомерами в течение 2 ч при 37 °C (5% CO₂). После лечения клетки фиксировали фиксирующим раствором Карновского и двойным иммуноокрашиванием фосфо-PAK1 (Thr423)/PAK2 (Thr402) антителом и F-актин-связывающим фаллоидином. Позже конфокальные изображения z-стека были сделаны с использованием конфокального лазерного сканирующего микроскопа. TNT были количественно определены методом ручного подсчета и отличались от других нейритов / протрузий клеток путем построения 3D-изображений объемного вида и идентификации струк....

Results

Здесь мы идентифицируем и характеризуем oAβ-индуцированные TNT в нейронных клетках SH-SY5Y путем построения 3D-объемных представлений из конфокальных изображений z-стека (рисунок 1). Клетки были дважды иммуноизолированы F-актином и фосфо-PAK1. Конфокальные изображения z-стека иммуноокрашенных клеток были проанализированы для идентификации ТНТ (рисунок 2). Кроме того, изображения ДВС-синдрома были проанализированы, чтобы убедиться, что F-актин- и фосфо-PAK1-окраш.......

Discussion

Несколько исследователей в течение последних 2 десятилетий пытались понять и охарактеризовать структуру TNT¹⁸. Отсутствие специфических маркеров препятствует прогрессу, и существует растущий спрос на удобный, стандартизированный метод, который можно использовать для идентификации, характеристики и количественной оценки ТНТ. ТНТ определяются как мембранные каналы на основе F-актина, которые парят между двумя клетками. Исследования показали, что β-тубулин-положительные, близкие, развивающиеся нейрит.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Чашка 35 мм с размером лунки 14 мм изготовлена из защитного стекла #1.5	Cellvis	D35-14-1.5-N	Чашка для визуализации, используемая для посева клеток для экспериментов по окрашиванию
Aβ (1-42) 1 мг	AnaSpec	#64129	Олигомеры бета-амилоида для обработки клеток
Alexa flour 488 Goat Anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A11070	Вторичное антитело к фосфо-PAK1
Шкаф биологической безопасности	Thermo Scientific (MSC Advantage)	51025411	Обеспечить оптимальные условия для выращивания клеточных культур
CO2 Инкубатор	Thermo Electron Corporation (Heraeus Hera Cell 240)	51026556	Для выращивания клеток при температуре тела или близкой к ней
Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп	ZEISS (Carl Zeiss)	LSM 880	Способен генерировать трехмерные изображения крупных образцов со сверхвысоким разрешением
DABCO [октановое число 1,4-диазобицикло-(2,2,2)]Merck		8034560100	реагент против отбеливания
DAPI (4′,,6-диамидино-2-фенилиндол)	Sigma	D9542-1MG	краситель
Neuclear DMEM media	Gibco	11965092	Используется для получения 100 мкМ A&бета; (1-42)
DMEM/F12 (смесь DMEM и ветчины 1:1) s F12)	Gibco	12500062	Питательные среды для SH-SY5Y DMSO
(диметилсульфид) Сорт клеточной культуры	Криопур	CP-100	Сорт клеточной культуры используется в качестве растворителя ретиноевой кислоты
ДМСО (диметилсульфид) Молекулярный сорт	Himedia	MB058	Используется в качестве одного из растворяющих агентов для лиофилизированного A&бета; (1-42)
Фетальная бычья сыворотка	Gibco	16000044	Основная добавка для питательных сред (происхождение из США)
Фиксатор формалина (нейтральный буферный 10%)	Компонент Sigma Aldrich	HT5014-120ML	в растворе фиксатора Карновского
Глутаральдегид (Grade I, 25% в H2O)	Sigma	G5882	Компонент в растворе фиксатора Карновского
HFIP (1,1,1,3,3,3-гексафтор-2-пропанол) раствор	TCI	H024	Используется для растворения Aβ (1-42) 1 мг
Программное обеспечение для обработки/анализа изображений: FIJI (ImageJ)	Национальный институт здравоохранения (NIH)		Используется для обработки/анализа изображений и дифференциации тротиловых нейтрализаторов от нейритов с помощью своего плагина под названием "volume viewer".
Лиофилизатор	Христос, Альфа	2,4 ЛДплюс	0,05 мг аликвоты А и бета; (1-42) может храниться при температуре -20 °°; C после лиофилизации только
смесь пенициллин-стрептомицин-неомицин Thermo	fisher Scientific	15640055	Смесь антибиотиков
Phalloidin-iFlor 555	Abcam	ab176756	F-актин-связывающий краситель
Phospho-PAK1 (Thr423) /PAK2 (Thr402) [Rabbit]	CST	#2601	Первичное антитело
Поликлональное антитело к тубулину бета 3 (TUBb3)	Клон облака	PAE711Hu01	Первичное антитело
Ретиноевая кислота	Sigma-Aldrich	R2625-50MG	Дифференцирующий реагент
Сапонин	Merck	8047-15-2	Моющее средство, используемое в инкубационном буфере при иммуноокрашивании
Ультразвуковой банный ультразвуковой аппарат (Quart, Дренажный клапан Нагреватель)	Ультразвуковой очиститель	3,0 л/3,2	Ультразвуковой аппарат, используемый для растворения Aβ (1-42) бульон, после добавления в него ДМСО во время приготовления 100&мкм; М А&бета; (1-42)
Программное обеспечение ZEN для микроскопии	ZEISS (Carl Zeiss)		Программное обеспечение для получения изображений конфокальной микроскопии с интеллектуальной автоматизацией