Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

Summary

В эпоху иммунотерапии рака интерес к выяснению динамики микроокружения опухоли резко возрос. Этот протокол детализирует метод масс-спектрометрической визуализации в отношении его этапов окрашивания и визуализации, которые позволяют проводить пространственный анализ с высокой степенью мультиплексирования.

Abstract

Достижения в области иммунотерапии произвели революцию в лечении рака и исследованиях. Это вызвало растущий спрос на характеристику иммунного ландшафта опухоли. Хотя стандартная иммуногистохимия подходит для изучения тканевой архитектуры, она ограничивается анализом небольшого количества маркеров. И наоборот, такие методы, как проточная цитометрия, могут оценивать несколько маркеров одновременно, хотя информация о морфологии тканей теряется. В последние годы мультиплексированные стратегии, которые интегрируют фенотипический и пространственный анализ, появились в качестве комплексных подходов к характеристике иммунного ландшафта опухоли. Здесь мы обсуждаем инновационную технологию, сочетающую металлически меченые антитела и масс-спектрометрию вторичных ионов, уделяя особое внимание техническим этапам разработки и оптимизации анализа, подготовки тканей, а также получения и обработки изображений. Перед окрашиванием должна быть разработана и оптимизирована металлическая панель антител. Эта высокосложная система визуализации поддерживает до 40 металлических антител в одном участке ткани. Следует отметить, что риск помех сигнала увеличивается с количеством маркеров, включенных в панель. После проектирования панели особое внимание следует уделить назначению изотопа металла антителу, чтобы свести к минимуму это вмешательство. Предварительное панельное тестирование проводится с использованием небольшого подмножества антител и последующее тестирование всей панели в контрольных тканях. Закрепленные формалином, парафиновые участки тканей получаются и монтируются на слайды с золотым покрытием и далее окрашиваются. Окрашивание занимает 2 дня и очень напоминает стандартное иммуногистохимическое окрашивание. Как только образцы окрашиваются, они помещаются в инструмент получения изображения. Поля зрения выбираются, а изображения получаются, загружаются и сохраняются. Заключительным этапом является подготовка изображения к фильтрации и устранению помех с помощью программного обеспечения системы для обработки изображений. Недостатком данной платформы является отсутствие аналитического программного обеспечения. Тем не менее, генерируемые изображения поддерживаются различным программным обеспечением вычислительной патологии.

Introduction

Важность многочисленных типов клеток, окружающих популяции клональных опухолей, является решающим элементом в категоризации канцерогенеза. Интерес к выяснению состава и взаимодействий этого микроокружения опухоли (TME) постоянно рос после создания иммунной терапии как части арсенала лечения рака. Поэтому стратегии лечения сместились от опухолецентрического подхода к TME-центричному¹.

Усилия по выяснению роли иммунных клеток в эпиднадзоре за опухолями и развитии рака резко возросли в последние годы ^2,3. В медицинских исследованиях множество методов, включая методы на основе цитометрии и технологии одноплексной и мультиплексной визуализации, возникло в рамках этой попытки расшифровать уникальные взаимодействия нескольких элементовTME.

Новаторские методы, такие как проточная цитометрия (изобретенная в 1960-х годах), флуоресцентно-активированная сортировка клеток и массовая цитометрия, сосредоточены главным образом на идентификации и количественной оценке компонентов^{TME 4}. Несмотря на то, что количественные методы, основанные на цитометрии, позволяют фенотипировать иммунный ландшафт, определение клеточного пространственного распределения невозможно. И наоборот, такие методы, как стандартная одноплексная иммуногистохимия, сохраняют тканевую архитектуру и позволяют исследователям анализировать клеточное распределение, хотя уменьшенное количество мишеней в одном участке ткани является ограничением этих методов ^5,6. За последние несколько лет мультиплексированные технологии визуализации для одноклеточного разрешения, такие как мультиплексная иммунофлуоресценция, флуоресцентная визуализация штрихкодирования и масс-спектрометрия изображений, стали всеобъемлющими стратегиями получения информации об одновременном окрашивании маркеров с использованием одного и того же раздела⁷ ткани.

Здесь мы представляем технологию, которая соединяет помеченные металлом антитела и масс-спектрометрию вторичных ионов и позволяет количественно определять разрешение одной клетки, коэкспрессию маркеров (фенотипирование) и пространственный анализ с использованием образцов тканей с формалин-фиксированным, парафиновым (FFPE) и свежезамороженной (FF) тканью ^8,9. Образцы FFPE являются наиболее широко используемыми материалами для архивирования образцов тканей и представляют собой более доступный ресурс для мультиплексированных технологий визуализации, чем свежезамороженные образцы¹⁰. Кроме того, эта технология предлагает возможность повторного получения изображений через несколько месяцев. Здесь мы обсуждаем наши протоколы окрашивания и обработки изображений с использованием образцов тканей FFPE.

Protocol

Образцы тканей были получены для исследовательских целей в соответствии с Институциональным наблюдательным советом Онкологического центра Андерсона при Техасском университете, и образцы были дополнительно деидентифицированы. 1. Выбор антител Определите вопросы исследования, чтобы выбрать наилучшие доступные клоны антител. Используйте Атлас белков человека, опубликованные исследования и веб-сайты производителей антител в качестве исследовательских ресурсов.ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор адекватных средств контроля тканей человека и тех же элементов управления тканями человека, которые должны быть окрашены на разных этапах, имеет решающее значение для обеспечения того, чтобы маркеры были окрашены правильно, в правильном месте и в правильном клеточном компартменте. Небольшой тканевый микрочип (TMA), включая нормальные ткани и опухолевые ткани, всегда рекомендуется для проверки окрашивания. Используйте только антитела без носителей для проектирования панели.ПРИМЕЧАНИЕ: Использование составов антител без носителей требуется, если коммерческие антитела без носителей недоступны; Наборы для очистки могут быть использованы для адаптации антител к правильному составу. Известно, что белковые добавки, такие как бычий сывороточный альбумин, уменьшают конъюгационную способность. Тестировать и титровать каждое антитело с использованием стандартной хромогенной иммуногистохимии для определения субклеточной картины экспрессии маркера; мембранное, цитоплазматическое или ядерное окрашивание; и экспрессия в специфических клетках контрольных тканей.ПРИМЕЧАНИЕ: Однако каждое антитело должно быть протестировано в рН 6 цитрата и рН 9 этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), и должно быть определено, будет ли панель окрашена рН 6 цитратом или рН 9 ЭДТА. Применение рН 9 ЭДТА рекомендуется для получения хороших сигналов, особенно при работе с данной методикой. Выберите оптимальную концентрацию окрашивания в соответствии с паттерном выражения в положительных элементах управления. Назначают каждое антитело к одному из доступных изотопов металлов в соответствии с обилием иммуногистохимических маркеров, субклеточной локализацией и клеточной коэкспрессией с другими мишенями. Окрашивают антитело соответствующим назначенным металлом и сравнивают с экспрессией в той же контрольной ткани, применявшейся ранее.ПРИМЕЧАНИЕ: Конъюгация металла антител начинается с получения антител, восстановления и последующей конъюгации (Дополнительный файл 1). Каждой металлической полимерной трубки достаточно для маркировки 100 мкг антитела. 2. Конструкция панели антител Создавайте небольшие партии окрашивания антителами. Протестируйте до пяти маркеров в коктейле.ПРИМЕЧАНИЕ: Тестирование антител, уже конъюгированных и проанализированных с использованием иммуногистохимии в партиях, облегчает раннее выявление интерференций каналов и дает возможность повторного сопряжения антител с другим металлом. Это также дает возможность оценить адекватное маркерное выражение. Окрашивают каждую небольшую партию четырьмя различными концентрациями антител (0,05 мкг/мл, 0,2 мкг/мл, 1 мкг/мл и 4,0 мкг/мл).ПРИМЕЧАНИЕ: Сравнивая различные титры, определите концентрацию антител, которая приводит к правильному расположению и наибольшей экспрессии с минимальным фоновым окрашиванием (наилучшее соотношение сигнал/шум). 3. Сечение тканей FFPE Выбирайте слайды с золотым покрытием (специально для этой цели) и держите их близко к микротому. Подготовьте микротом, вставив новое лезвие в держатель. Установите толщину сечения 4-5 мкм. Положите блоки FFPE на лед перед секционированием. Подготовьте тканевую плавающую ванну, нагревая дистиллированную воду или деионизированную воду (diH2O) до 40-45 °C.ПРИМЕЧАНИЕ: Использование diH2O или дистиллированной воды снижает вероятность загрязнения. Начните секционирование. Поместите участок ткани в воду с помощью пинцета и дайте ему сплющиться. Используйте слайды, чтобы удалить участки тканей из воды. Поместите горки в подставку для слайдов и дайте им высохнуть при комнатной температуре в течение ночи. 4. Окрашивание антител FFPE ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс окрашивания происходит в течение двух отдельных дней. ВНИМАНИЕ: Растворы, используемые в этом протоколе, потенциально коррозионны и представляют опасность для кожи и глаз. Ношение перчаток, лабораторного халата и защитного оборудования для глаз и лица является частью политики нашего учреждения в области биобезопасности. Подготовка реагентов (день 1)Разбавьте 50 мл 20-кратного трис-буферного физиологического раствора с Tween (TBS-T) в 950 мл diH2O, чтобы получить 1 л TBS-T. Разбавьте 8 мл 10-кратной трис-этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в 72 мл diH2O, чтобы получить 1-кратный термоиндуцированный раствор для извлечения эпитопа (HIER). Разбавьте ослиную сыворотку в 1x TBS-T до конечной концентрации 5%, чтобы сделать блокирующий буфер. Хранить раствор при температуре 4 °C до готовности к использованию. Подготовка к HIER: модуль предварительной обработки (PT)ВНИМАНИЕ: Надевайте химические защитные перчатки при работе с любыми реагентами или деталями, погруженными в любые реагенты, используемые в модуле PT.Разбавьте 140 мл 10-кратного фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) в 1 260 мл diH2O, чтобы получить 1,4 л 1x PBS. Альтернативно, развести семь таблеток PBS в 1,4 л diH2O. Наполните резервуар 1,4 л PBS и поместите подготовленный контейнер с камерой слайдов со 100 мл 1x раствора HIER в резервуар. Разогрейте резервуар в модуле PT до 75 °C. Удаление излишков парафинаВыпекать горки при 70 °C в духовке не менее 20 минут.ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторым тканям или секциям может потребоваться более длительное время выпечки. Рекомендуемое время выпечки для мозговой ткани или ТМА составляет 1 ч. Это может быть продлено до 16 ч (ночью) или в соответствии с лабораторным опытом. Поместите запеченные горки в держатель для слайдов и выполните следующие шаги мытья на шейкере под вытяжным капюшоном. Промывайте горки в следующем растворе: ксилол 2x в течение 30 с (без металлов), 100% спирт 2x в течение 30 с (без металлов), 95% спирт 2x в течение 30 с (без металлов), 80% спирт в течение 30 с (без металлов), 70% спирт в течение 30 с (без металлов) и diH2O 2x в течение 30 с (без металлов). Храните слайды в свежем контейнере diH2O до тех пор, пока они не будут готовы к извлечению антигена.ПРИМЕЧАНИЕ: Слайды не следует сушить до конца процедуры. Извлечение антигенаПоместите слайды в предварительно нагретую слайдовую камеру, содержащую 1 буфер HIER внутри модуля PT. Поместите крышку на бак. Закройте и зафиксируйте крышку. Нажмите кнопку Menu на модуле PT, чтобы открыть главное меню, и нажмите кнопку Setup cycle (время и температура), чтобы создать пользовательскую программу. Запустите модуль PT при 97 °C в течение 40 минут. После этого модуль PT автоматически остынет до 65 °C. Снимите слайды из модуля PT после достижения температуры 65 °C. Держите горки при комнатной температуре в течение 30 минут.ПРИМЕЧАНИЕ: Модуль PT не будет открываться до тех пор, пока температура не остынет до 65 °C. Не прикасайтесь к золотистой поверхности горок во время этого процесса, и всегда используйте перчатки. Блокирование антителУстановите шейкер на 70 об/мин. Мойте горки, погружая их в 1x TBS-T на 5 мин 2x. Используя гидрофобную барьерную ручку, проведите границу вокруг участка ткани на расстоянии не менее 1 мм от краев слайда и дайте ему высохнуть в течение 15-30 с.ПРИМЕЧАНИЕ: Позаботьтесь о том, чтобы жидкость ручки не касалась участка ткани, чтобы избежать любого вмешательства тканей в окрашивание. Не нажимайте на перо слишком сильно, рисуя барьер, чтобы избежать потенциальных утечек. Для получения оптимальных результатов окрашивания и получения изображения срезы ткани размещаются в середине слайдов с золотым покрытием в рамке размером не более 15 мм х 30 мм, чтобы обеспечить достаточно места для рисования барьера, не касаясь ткани или направляющих точек, размещенных на внешнем краю слайда. Чтобы удалить остатки пера, окуните слайды в TBS-T. В влагокамере при комнатной температуре инкубируют участок ткани со 100-200 мкл блокирующего буфера в течение 20 мин. Оставьте ткань, инкубируемую в блокирующем буфере, пока не будет готова смесь антител. Подготовка панели антителПРИМЕЧАНИЕ: Конечный объем коктейля панели антител варьируется в зависимости от предполагаемой площади поверхности среза ткани. Чтобы покрыть площадь 20 мм х 20 мм, приготовьте 100-200 мкл коктейля.Сделайте следующее, чтобы приготовить коктейль антител панели из металлических изотоп-конъюгированных антител:Подтвердите окончательный объем коктейля, равный объему коктейля антител, добавленному к объему блокирующего буфера. Подтвердите спецификации для всех антител, разведений и/или концентраций антител в электронной таблице панели для проекта. Раскрутите все антителосодержащие пробирки по 10 000 х г в течение 5 мин. Добавьте отдельные антитела в блокирующий буфер и очень хорошо перемешайте. Не нарушайте дно трубки антитела при ее пипетке. Фильтруйте панель антител путем предварительного смазывания центробежного фильтрующего устройства 0,1 мкм со 100 мкл блокирующего буфера. Раскрутите фильтр при 10 000 x g в течение 2 минут и удалите блокирующий буфер с помощью пипетки. Переместите панель антител в спиновую колонну и вращайте фильтр при 10 000 х г в течение 2 мин. Отбросьте спиновую колонну и используйте проточную панель в качестве фильтрованной панели антител.ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните окрашивание сразу после приготовления коктейля, чтобы предотвратить обмен металла. Если требуется хранение коктейля антител в течение длительного времени, его можно подвергнуть лиофилизации. Окрашивание антителамиОсторожно снимите блокирующий буфер со слайдов, опрокинув каждый слайд на бок и осторожно постукивая краями по рабочему стеклоочистителю. Поместите слайды во влагоукладку и добавьте в ткань 100-200 мкл смеси антител (избегайте контакта с тканью и создания пузырьков воздуха). Добавьте положительные и отрицательные контрольные слайды в пакет окрашивания. Инкубировать горки при температуре 4 °C в течение ночи (14-16 ч). Подготовка реагентов (день 2)Разбавьте 100 мл 10x PBS с низким содержанием бария, рН 7,4, в 900 мл diH2O, чтобы получить 1x PBS. Готовят 350 мл рабочего сырья раствора 2% глутаральдегида в низкобариевом ПБС (340 мл низкобариевого ПБС + 10 мл 70% глутарового альдегида).ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните разбавление под капотом. Глутаральдегид является очень вязкой жидкостью. Используйте пипетку 1 мл и добавляйте 1 мл PBS с низким содержанием бария в глутаровую альдегидную трубку каждый раз, пока она не станет достаточно жидкой, чтобы вылиться из трубки. Разбавить 10x Tris, pH 8,5, в 900 мл diH20, чтобы получить 1x Tris. Фиксация и обезвоживаниеУдалите смесь антител с каждого слайда, опрокинув зажим на бок и осторожно постукивая краем о стеклоочиститель. Промыть слайды легким и умеренным перемешиванием в следующих буферах: 1x TBS-T, 3x по 5 мин каждый (без металлов); фильтрованный 2% глутаровый альдегид в течение 5 мин; фильтрованный 1x трис, рН 8,5, 3х в течение 30 с; фильтрованный diH2O 2x в течение 30 с; 70% спирт на 30 с (без металлов); 80% спирт на 30 с (без металлов); 95% спирт на 30 с (без металлов); и 100% спирт в течение 30 с (без металлов). Осторожно постучите краем каждого предмета о стеклоочиститель, чтобы удалить лишний спирт и дать остаточному спирту испариться при комнатной температуре (~ 5-10 мин). Сушите горки в адсорбаторе не менее 1 ч до получения изображения или храните слайды в вакуумной камере для длительного хранения. 5. Получение изображений Настройка слайдовПРИМЕЧАНИЕ: Перед сканированием с помощью прибора слайды должны быть определены и настроены с помощью веб-приложения для управления изображениями, следуя шагам, описанным ниже.На странице слайда в веб-приложении для управления изображениями щелкните Присоединение нового слайда и введите нужные сведения (имя, идентификация слайда, расположение и описание). Создайте разделы сканирования, нажав кнопку Добавить раздел. Заполните информацию для каждого раздела (название проекта, название слайда, блок и должность). Чтобы сохранить новые созданные слайды/разделы, нажмите кнопку Отправить. На вкладке Ресурсы откройте страницу панелей и выберите панель, которая будет использоваться. Для новых панелей нажмите кнопку Создать новую панель. После выбора панели нажмите на Разделы. Добавьте разделы, созданные на шаге 2. щелкнув Изменить назначение раздела. Сохраните, нажав кнопку Отправить. Настройка приборовПРИМЕЧАНИЕ: Этот прибор (см. Таблицу материалов) эксплуатируется с помощью специальной программы управления (см. Таблицу материалов).Войдите в управляющее программное обеспечение. Нажмите кнопку Пробуждение , если инструмент находится в спящем режиме.ПРИМЕЧАНИЕ: По крайней мере, за 1 ч до операции рекомендуется прогрев инструмента, что помогает со стабилизацией фокусировки луча. Чтобы загрузить слайд, щелкните Образец Exchange, а затем нажмите кнопку Продолжить , чтобы открыть дверь. Поместите слайд в загрузочный слот с образцом вверх и этикеткой справа. Нажмите кнопку Продолжить , чтобы закрыть дверь.ПРИМЕЧАНИЕ: Если слайд загружен неправильно, появится предупреждающий звук и уведомление о настройке слайда. Выберите проект, а затем выберите имя слайда для загруженного образца. Визуализируйте панорамное изображение на панели оптического изображения слайда. Выбор и получение поля зрения (FOV)Нажмите на меню Режим и выберите SED (Вторичный детектор электронов). Нажмите на меню режима изображения и выберите QC −300 мкм. Нажмите на Jog Stage , чтобы контролировать местоположение FOV, а затем нажмите на стрелки, чтобы перемещаться и выбирать положение FOV. Нажмите кнопку Добавить FOV, установите размер поля 400 мкм x 400 мкм и выберите режим обработки изображений и 1 мс времени ожидания. Нажмите кнопку Подтвердить.ПРИМЕЧАНИЕ: Установленное время выдержки будет зависеть от желаемого разрешения. Время ожидания увеличивается по мере увеличения разрешения. Время обнаружения может варьироваться в зависимости от нескольких факторов, включая период обкатки детектора и продолжительность работы. Наше среднее время сбора для одного FOV составляет около 17 минут. Используйте прибор без остановок в течение 8 ч, что позволяет сканировать около 28 FOV. Качество полученных изображений снижается после многих последовательных часов использования. После создания списка FOV перейдите к фокусировке изображения и отрегулируйте стигматизацию, переместив луч в область ткани, которая не будет изображена. Настраивайте параметры до получения четкого центрального изображения.ПРИМЕЧАНИЕ: Для оптимизации получения изображения идеально подходит централизованный участок ткани на слайде. При фокусировке можно получить четкое изображение только центральной области. Если срез ткани слишком большой, края окажутся не в фокусе, а изображение будет размытым. Нажмите кнопку Начать запуск. Полученные изображения будут автоматически загружены и сохранены в веб-приложении для управления изображениями. 6. Подготовка изображения Изобарическая коррекция изображенияПРИМЕЧАНИЕ: Целью изобарической коррекции является удаление побочного сигнала между каналами, возникающего в результате присутствия изотопов равной или очень похожей массы, различия в массе которых не могут быть обнаружены с помощью анализатора массы.В веб-приложении для управления изображениями щелкните зеленый значок Загрузить , чтобы сохранить FOV (изображения TIFF). Загрузите самую последнюю версию программного обеспечения для обработки изображений (см. Таблицу материалов), доступную на вкладке «О программе» в веб-приложении для управления изображениями, и сохраните ее в файле. Откройте .zip архивный файл и следуйте инструкциям по установке. Откройте программное обеспечение после завершения установки. Выберите папку, содержащую изображения, подлежащие исправлению, щелкнув значок Файл на панели ввода программного обеспечения для обработки изображений. Будет загружен список FOV. Щелкните значок Фильтр на панели ввода, чтобы применить исправления по умолчанию. Для каждого канала визуализируйте изображения, полученные до и после коррекции в правой части экрана. Щелкните значок дискеты на панели вывода, чтобы сохранить исправленный образ. Фильтрация изображений: Тесселяция ВороногоПРИМЕЧАНИЕ: Диаграммы тесселяции Вороного иллюстрируют разделение пространства, содержащего начальные точки, на ячейки Вороного. Цель состоит в том, чтобы оценить плотность клеток и определить границы ячеек. С помощью расчета тесселяции Вороного сгенерируется маска и применяется к исходному изображению для фильтрации.Перейдите на вкладку Фильтрация и выберите Voronoi Tesselation в меню параметров фильтрации. В области ввода выберите изображение MassCorrected.tiff. Щелкните значок Фильтр на панели ввода. Щелкните значок дискеты на панели вывода, чтобы сохранить отфильтрованное изображение. Два результирующих файла будут иметь суффиксы -Filtered.tiff и -Filtered.json.ПРИМЕЧАНИЕ: Изображение с именем MassCorrected-Filtered.tiff затем может быть загружено в стороннюю программу цифрового анализа или программу с открытым исходным кодом.

Representative Results

Участки тканей ТМА миндалин и аденокарциномы легких (толщиной 5 мм) были получены и размещены на середине слайдов с золотым покрытием в соответствии со спецификациями в отношении размера ткани и надежных краев слайдов. Свободные стеклянные края 5 мм и 10 мм между краем ткани и боковыми и ?…

Discussion

Всестороннее выяснение сложных, запутанных взаимодействий между многочисленными компонентами TME остается ключевой целью исследований рака. Производители ввели многочисленные мультиплексированные анализы в рамках этих усилий, особенно за последние 5 лет. Мультиплексированный прост?…

Materials

100% Reagent Alcohol	Sigma-Aldrich	R8382
95% Reagent Alcohol	Sigma-Aldrich	R3404
80% Reagent Alcohol	Sigma-Aldrich	R3279
70% Reagent Alcohol	Sigma-Aldrich	R315
20X TBS-T	Ionpath	567005
10X Low-Barium PBS pH 7.4	Ionpath	567004
10X Tris pH 8.5	Ionpath	567003
4°C Refrigerator	ThermoScientific	REVCO
Aerosol Barrier Pipette Tips P10	Olympus	24-401
Aerosol Barrier Pipette Tips P20	Olympus	24-404
Aerosol Barrier Pipette Tips P200	Olympus	24-412
Aerosol Barrier Pipette Tips P1000	Olympus	24-430
Centrifugal Filter Ultrafree-MC	Fisher Scientific	UFC30VV00
Deionized H2O	Ionpath	567002
Donkey serum	Sigma-Aldrich	D9663
EasyDip Slide Staining Jar, Green	Electron Microscopy Sciences	71385-G
EasyDip Slide Staining Jar, Yellow	Electron Microscopy Sciences	71385-Y
EasyDip Slide Staining Kit (Jar+Rack), White	Electron Microscopy Sciences	71388-01
EasyDip Stainless Steel Holder	Electron Microscopy Sciences	71388-50
Glutaraldehyde 70% EM Grade	Electron Microscopy Sciences	16360
Heat Induced Epitope Retrieval (HIER) buffer: 10X Tris with EDTA, pH 9	Dako	S2367
Heat resistant slide chamber	Electron Microscopy Sciences	62705-01
Hydrophobic barrier pen	Fisher	50-550-221
MIBI/O software	Ionpath	NA
MIBIcontrol software	Ionpath	NA
MIBIslide	Ionpath	567001
MIBIscope	Ionpath	NA
Microcentrifuge	Eppendorf	5415D
Microtome	Leica	RM2135
Moisture Chamber (Humid Chamber)	Simport	M922-1
Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets	Fisher Scientific	BP2944100
PT Module	Thermo Scientific	A80400012
Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units	Fisher Scientific	097403A
Shaker	BioRocker	S2025
Spin column (Ultrafree-MC Spin Filter, 0.5mL 0.1μm )	MillQ	UFC30VV00
Slide oven	Fisher Scientific	6901
Vaccum Cabinet Desiccator	VWR	30621-076
Task-whipe	Kimberly Clark	34155
Xylene	Sigma-Aldrich	534056-4L