Method Article

Простой протокол анализа ям для визуализации и количественной оценки остеокластической резорбции in vitro

DOI:

10.3791/64016

⸱

June 16th, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Oral and Maxillofacial Surgery, University Hospital Tübingen, 2Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, University Hospital Tübingen, 3Department of Orthopaedic Surgery, University Hospital Tübingen

In This Article

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем простую и эффективную процедуру анализа резорбционных ям с использованием пластин клеточных культур, покрытых фосфатом кальция.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Зрелые остеокласты представляют собой многоядерные клетки, которые могут разлагать кости за счет секреции кислот и ферментов. Они играют решающую роль при различных заболеваниях (например, остеопорозе и раке костей) и поэтому являются важными объектами исследований. In vitro их активность может быть проанализирована путем образования резорбционных ямок. В этом протоколе мы описываем простой метод анализа с использованием пластин клеточных культур, покрытых фосфатом кальция (CaP), которые можно легко визуализировать и количественно оценить. Предшественники остеокластов, полученные из мононуклеарных клеток периферической крови человека (PBMCs), культивировали на покрытых пластинах в присутствии остеокластогенных стимулов. После 9 дней инкубации остеокласты были зафиксированы и окрашены для флуоресцентной визуализации, в то время как покрытие CaP было противопоставлено кальцеину. Для количественной оценки рассасываемой области покрытие CaP на пластинах окрашивали 5% AgNO3 и визуализировали с помощью визуализации brightfield. Площадь резорбционной ямы была количественно определена с помощью ImageJ.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Остеокласты (OC) представляют собой тканеспецифические макрофаги, полученные из гемопоэтических стволовых клеток (HSC), играющие ключевую роль в ремоделировании кости вместе с остеобластами1. Вызванные половыми гормонами, иммунологические и злокачественные заболевания костей, которые разрушают кости системно или локально, обусловлены избыточной остеокластической активностью, включая остеопороз, связанный с менопаузой2, ревматоидный артрит3, пародонтоз4, заболевание кости миеломы5 и остеолитическое метастазирование в кости6. Напротив, дефекты образования и функции OC также могут вызывать остеопетроз7. ГСК подвергаются дифференцировке в предшественники OC при стимуляции макрофагов колониестимулирующим фактором (M-CSF, символ гена ACP5). В присутствии как M-CSF, так и рецепторного активатора лиганда NF-κB (RANKL, символ гена TNFSF11), предшественники OC дифференцируются далее в мононуклеарные OC и впоследствии сливаются, чтобы стать многоядернымиOC 8,9,10. Оба цитокина M-CSF и RANKL незаменимы и достаточны для индукции остеокластических маркеров, таких как рецептор кальцитонина (CT), активатор рецептора ядерного фактора κ B (RANK), протонная помпа V-АТФазы, альфа-субъединица хлоридного канала 7 (CIC-7), интегрин β3, тартраторезистентная кислая фосфатаза (TRAP, символ гена ACP5), лизосомальный цистеинпротеазный катепсин K (CTSK) и матрикс металлопептидаза 9 (MMP9). Активированные ОС образуют зону уплотнения на поверхности кости путем образования актинового кольца с взъерошенной границей11,12. В пределах зоны уплотнения ОС опосредуют резорбцию путем секреции протонов через протонный насос V-АТФазы 12,13, MMP914 и CTSK15, что приводит к образованию лакун.

Для экспериментов in vitro предшественники OC могут быть получены путем расширения макрофагов костного мозга из бедренной и большеберцовойкостей мышей 16,17, а также путем выделения мононуклеарных клеток периферической крови человека (PBMCs) из образцов крови и пышных покрытий 18,19,20 или путем дифференцировки увековеченных мышиных моноцитарных клеток RAW 264,7 21,22.

В настоящем протоколе мы описываем остеокластический резорбционный анализ в пластинах клеточных культур, покрытых CaP, с использованием OC, полученных из первичных PBMCs. Используемый здесь метод клеточных культуральных пластин с покрытием CaP принят и усовершенствован из метода, описанного ранее Patntirapong et al.17 и Maria et al.21. Для получения предшественников OC PBMC выделяют центрифугированием градиента плотности и расширяют, как описано ранее20.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол был рассмотрен и одобрен местным комитетом по этике (номер одобрения 287/2020B02).

1. Приготовление пластин для культивирования клеток, покрытых фосфатом кальция

  1. Приготовление раствора кальция (25 мМ CaCl2·2H2O, 1,37 мМ NaCl, 15 мМ MgCl2·6H2O в буфере Tris)
    1. Подготовьте буфер 1,0 М Трис и отрегулируйте рН до 7,4 с помощью 1 М HCl.
    2. Установите стеклянный стакан на магнитную мешалку и добавьте 100 мл буфера 1,0 М Tris.
    3. Вегетируют 0,368 г CaCl2·2H2O, 8,0 г NaCl и 0,305 г MgCl2·6H2Oи растворяют в буфере Tris один за другим.
    4. Отрегулируйте pH до 7,4 с помощью 1 M HCl. Хранить при комнатной температуре.
  2. Приготовление фосфатного стоковой раствора (11,1 мМ Na2HPO4· H2O, 42 мМ NaHCO3 в буфере Tris)
    1. Установите стеклянный стакан на магнитную мешалку и добавьте 100 мл буфера 1,0 М Tris.
    2. Вес 0,158 г Na2HPO4· H2Oи 0,353 г NaHCO3 растворяют в буфере Tris один за другим.
    3. Отрегулируйте pH до 7,4 с помощью 1 M HCl. Хранить при комнатной температуре.
  3. Предварительная кальцификация 96-луночных пластин для культивирования клеток
    1. Готовят 30 мл рабочего раствора, смешивая 15 мл буфера 1,0 М Триса, 7,5 мл раствора запаса кальция (стадия 1.1.4) и 7,5 мл раствора фосфатного сырья (стадия 1.2.3). Отфильтруйте раствор с помощью фильтра 0,2 мкм.
    2. Подготовьте 96-луночную пластину для культивирования клеток с плоским дном. Пипетка 300 мкл раствора фосфата кальция (стадия 1.3.1.) в каждую лунку. Накройте пластину крышкой и инкубируйте пластину при 37 °C в течение 3 дней.
  4. Приготовление раствора фосфата кальция (2,25 мМ Na2HPO4· H2O, 4 мМ CaCl2·2H2O, 0,14 M NaCl, 50 мМ Tris основания в ddH2O)
    1. Добавьте 2 мл 1 M HCl к 40 мл деионизированной воды в стакан с магнитным перемешивающим шариком и растворите 0,016 г Na2HPO4· H2O, 0,0295 г CaCl2·2H2O, 0,409 г NaCl и 0,303 г основания Tris один за другим.
    2. Отрегулируйте pH до 7,4, используя 1 M HCl. Добавьте деионизированную воду, чтобы заполнить объем до 50 мл. Отфильтруйте раствор с помощью фильтра 0,2 мкм.
  5. Кальцификация пластин для культивирования клеток из 96 лунок
    1. Аспирировать раствор предварительной кальцификации из предварительно кальцинированных 96-луночных пластин для культивирования клеток и добавлять 300 мкл раствора фосфата кальция (стадия 1.4.2) в каждую лунку. Накройте пластины крышкой и высиживайте при 37 °C в течение 1 дня.
    2. Переверните тарелку, чтобы вылить раствор, и тщательно вымойте тарелку три раза деионизированной водой. Немедленно высушите пластину с помощью фена или сжатого газа CO2 или N2 для поддержания однородной поверхности.
    3. Стерилизуйте покрытую пластину УФ-излучением в чистом стенде в течение 1 ч. Немедленно используйте пластину с покрытием или запечатайте пластину парапленкой и храните ее при комнатной температуре.

2. Выделение ПБМК из периферической крови человека

  1. Взять 15 мл крови из вены после получения письменного информированного согласия от донора крови (этическое голосование: 287/2020B02).
  2. Разбавьте 15 мл свежей крови с равным объемом PBS и перемешайте, перевернув трубку несколько раз или втянув смесь в пипетку и выйдя из нее.
  3. Приготовьте коническую трубку объемом 50 мл, содержащую 15 мл раствора градиента плотности (например, Ficoll, Table of Materials) на пробирку. Наклоните пробирку и аккуратно наложите 30 мл разбавленного образца крови на 15 мл раствора градиента плотности (разбавленный образец крови: раствор градиента плотности, соотношение 1:0,5-1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: При наложении образца обратите внимание на то, чтобы не смешивать раствор градиента плотности с разбавленным образцом крови.
  4. Центрифуга при 810 х г в течение 20 мин при 20 °C в поворотном роторе без тормоза.
  5. Аспирировать верхний слой, оставляя мононуклеарный клеточный слой (лимфоциты, моноциты и тромбоциты) нетронутым в интерфазе.
  6. Аккуратно переложите слой мононуклеарной клетки на новую коническую трубку объемом 50 мл.
  7. Заполните трубку PBS, перемешайте и центрифугу при 300 x g в течение 10 мин при 20 °C (тормоз можно использовать с этой стадии).
  8. Осторожно удалите супернатант полностью. Повторно суспендируют ячейку гранулы в 50 мл PBS и центрифугу при 300 х г в течение 10 мин при 20 °C. Осторожно удалите супернатант полностью.
  9. Для удаления тромбоцитов повторно суспендируют ячейку гранулы в 50 мл PBS и центрифугу при 200 х г в течение 10 мин при 20 °C. Осторожно удалите супернатант полностью.
  10. Перенос ресуспендированных клеток в колбы клеточных культур для расширения предшественников OC.

3. Расширение предшественников OC

  1. Повторное суспендирование МПК в полном α-MEM (10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% амфотерицин B), содержащих 20 нг/мл M-CSF. Семена НБМК при плотности 2,5 х 105 клеток/см2. Обычно клетки, выделенные из 15-20 мл свежей крови, можно посеять в одну колбуразмером 75 см2 (1,5-2 х 107 клеток).
  2. Кормите клетки свежим полным α-MEM, содержащим 20 нг/мл M-CSF каждый третий день, пока прикрепленные клетки не достигнут желаемого слияния. Типичные выходы составляют 1,5-2 х 106 клеток / колба, когда ячейки на 95% сливаются. Обычно период расширения длится 6 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Остеокластогенный потенциал предшественников может снижаться при длительном времени культивирования.

4. Индукция остеокластогенеза в пластинах, покрытых CaP

  1. Для облегчения клеточной адгезии инкубируют пластины, покрытые CaP, 50 мкл FBS в течение 1 ч в инкубаторе с температурой 37 °C.
  2. Чтобы отсоединить предшественники OC, дважды промойте колбу с PBS, чтобы удалить мертвые или неадгезивные клетки. Добавить 4 мл трипсина (Таблица материалов) на 75см2 колбы, в течение 30 мин.
    1. Добавьте 4 мл полной α-MEM, чтобы остановить пищеварение, аккуратно отсоедините клетки с помощью клеточного скребка и перенесите клетки в трубку объемом 50 мл.
    2. Определите общее число ячеек с помощью камеры Нойбауэра или аналогичной камеры.
  3. Гранулируйте ячейки центрифугированием в течение 7 мин при 350 х г. Повторно суспендируют гранулу в достаточном полном α-MEM, содержащем 20 нг/мл M-CSF и 20 нг/мл RANKL для получения концентрации 1 х 106 клеток/мл.
  4. Раствор аспирата FBS из 96-луночной пластины с покрытием CaP и пипетки 200 мкл клеточной суспензии на лунку (2 x 105 ячеек/лунка).
  5. Инкубируйте предшественники OC в течение желаемого периода времени или с желаемыми реагентами, относящимися к экспериментальной конструкции. Обычно большое количество крупных и многоядерных ОК может наблюдаться через 6 дней и при формировании ям рекорбции. Питательные ячейки со свежей полной средой α-MEM, содержащей 20 нг/мл M-CSF и 20 нг/мл RANKL каждый третий день.
  6. В конце инкубации дважды промыть клетки PBS, зафиксировать 4% параформальдегидом в течение 10 мин и снова промыть PBS.
  7. Используйте фиксированные OC непосредственно для флуоресцентного окрашивания или храните при температуре 4 °C.

5. Флуоресцентное окрашивание ОК и CaP покрытия

  1. Инкубируют фиксированные клетки с буфером пермеабилизации (0,1% тритона в PBS) в течение 5 мин.
  2. Окрашивание актиновых нитей 100 мкл меченого раствора фаллоидина AlexaFluor 546 в PBS в течение 30 мин и аспирация окрашивающего раствора. Добавьте 100 мкл окрашивающего раствора Hoechst 33342 (10 мкг/мл в PBS) в течение 10 мин для окрашивания ядер. DaPI также можно использовать.
  3. Окрашивание CaP-покрытия 100 мкл 10 мкМ кальциина в PBS в течение 10 мин. Трижды вымойте PBS и сделайте снимки.
  4. После флуоресцентной визуализации одни и те же пластины могут быть использованы для количественной оценки площади резорбционной ямки путем окрашивания фон Косса. Для этого дважды промыть тарелки деионизированной водой.

6. Количественная оценка общей площади карьера резорбции

  1. Для окрашивания CaP-покрытия окрашиванием фон Косса инкубируют с 50 мкл 5% AgNO3 в деионизированной воде на скважину под УФ-излучением в течение 1 ч, пока покрытие на дне скважин не станет коричневым.
  2. Трижды вымойте тарелку деионизированной водой и сделайте яркие снимки. Объектив с небольшим увеличением, такой как объектив 1,25x, может быть использован для захвата всей скважины на одном изображении. Это облегчает последующий анализ изображений. Могут применяться альтернативные методы захвата всей площади скважины.
  3. Откройте файл изображения с помощью ImageJ: файл | Открыть | Изображение | Тип | 8-бит. Проверьте единицу масштабирования в правом нижнем углу изображения, используя прямую линию | Анализ | Установите масштаб. Введите длину в поле «Известное расстояние», введите новую единицу масштабирования в поле Единица длины и установите флажок Глобальный.
  4. Список параметров измерения, подлежащих анализу: Анализ | Установка измерений. В окне Задание измерений установите флажки Область и Ограничить пороговыми значениями.
  5. Измерение площади ям: изображение | Отрегулируйте | Порог. В окне Порог установите флажок Темный фон и нажмите кнопку Авто. Площадь ям становится красной. Закройте окно Пороговое значение и выберите Анализировать | Мера. Сохраните результирующий файл: файл | Сохранить как.

7. Количественная оценка количества и размера ОС, а также нормированная площадь резорбционной ямы

  1. Откройте флуоресцентное изображение остеокластов с помощью ImageJ и проверьте единицу масштабирования (см. шаг 6.3).
  2. Список параметров измерения, подлежащих анализу: Анализ | Установка измерений. В окне Задание измерений установите флажок Область .
  3. Структурирование операционных систем с помощью выбора ROI Manager и Polygon: анализ | Инструменты | Менеджер по окупаемости инвестиций. Щелкните Выделения полигона в наборе инструментов, наметьте один OC (ячейки с актиновым кольцом и ≥ тремя ядрами) и нажмите кнопку Добавить [t] в окне МЕНЕДЖЕРА ROI. Повторяйте структурирование до тех пор, пока не будут включены все операционные системы.
  4. Измерение количества и размера операционных систем: выберите все элементы в ДИСПЕТЧЕРЕ ОКУПАЕМОСТИ инвестиций и нажмите кнопку Измерить. Сохраните результирующий файл: | Сохранить как (рисунок 3E).
  5. Измерьте площадь ямы флуоресцентных изображений. Откройте флуоресцентное изображение покрытия, коррелирующее с изображением на шаге 7.3, и проверьте единицу измерения масштаба (см. шаг 6.3).
    1. Перечислите параметры измерения, подлежащие анализу (см. шаг 6.4). Выберите | изображений Отрегулируйте | Порог. В окне Пороговое значение снимите все флажки и нажмите кнопку Авто. Площадь ям становится красной. Закройте окно Пороговое значение и выберите Анализ | Мера. Сохраните файл результатов.
  6. Рассчитайте нормированную площадь карьера по номеру OC.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Покрытие фосфатом кальция на дне пластин клеточной культуры выполняли в два этапа покрытия, включающих 3-дневную предварительную кальцификацию и 1-дневную стадию кальцификации. Как показано на фиг.1, равномерно распределенный фосфат кальция получали на дне 96-луночных пластин. Покрытие очень хорошо прилипало ко дну после выполненных этапов промывки.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы описываем простой и надежный метод анализа остеокластической резорбции с использованием OC, полученных и расширенных in vitro из PBMCs. Используемые пластины для культивирования клеток с покрытием CaP могут быть легко подготовлены и визуализированы с использованием лабораторных материалов. В дополнение к несортированным PBMCs, принятым в этом протоколе, OC, полученные из мышиных моноцитарных клеток21 и клеток макрофаговкостного мозга 17 , также культивиров...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была частично профинансирована Китайским стипендиальным советом [CSC No 201808440394]. W.C. финансировался CSC.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AgNO3SERVA Electrophoresis GmbH35110Нитрат серебра
a-MEMGibco32561-029MEM альфа, GlutaMAX, без нуклеозидов
амфотерицин BBiochrom03-028-1BРаствор амфотерицина B CaCl
2Sigma-Aldrich21097-50GДигидрат
хлорида кальцияКальцеинSigma-AldrichC0875Кальцеин
FBSSigma-AldrichF7524фетальная бычья сыворотка
FicollCytiva17144002Ficoll Paque Plus
Фиксирующий буферBiolegend420801Параформальдегид
HClMerk1.09057.1000Соляная кислота
Hoechst 33342ПромокинPK-CA707-40046Hoechst 33342
M-CSFPeproTech300-25Рекомбинантный человеческий M-CSF
MgCl2Sigma-Aldrich7791-18-6Магния хлорид
Na2HPO4AppliChem GmbHA2943,0250ди- натрия гидрофосфат безводный
NaClMerkS7653-250GХлорид натрия
NaHCO3MerkK15322429Бикарбонат соды
PBSLonza17-512FФосфатный буферный раствор Дульбекко (1X), DBPS без кальция и магния
Pen-StreppingLonzaDE17-602EПенициллин-стрептомициновая смесь
Фаллоидин-Alexa Fluor 546InvitrogenA22283Alexa Fluor 546 Фаллоидин
RANKLPeproTech310-01Рекомбинантный человеческий лиганд sRANK (производный от E.coli)
TrisSigma-Aldrich93362Tris(гидроксиметил)аминометан
Triton X-100Sigma-AldrichT8787алкилфенилполиэтиленгликоль
TrypLE ExpressGibco12605010Рекомбинантные ферменты диссоциации клеток

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jacome-Galarza, C. E., et al. Developmental origin, functional maintenance and genetic rescue of osteoclasts. Nature. 568 (7753), 541-545 (2019).
  2. Moller, A. M. J., et al. Aging and menopause reprogram osteoclast precursors for aggressive bone resorption. Bone Research. 8 (1), 1-11 (2020).
  3. Yokota, K., et al. Characterization and function of tumor necrosis factor and interleukin-6-induced osteoclasts in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheumatology. 73 (7), 1145-1154 (2021).
  4. Teng, Y. T., et al. Functional human T-cell immunity and osteoprotegerin ligand control alveolar bone destruction in periodontal infection. Journal of Clinical Investigation. 106 (6), 59-67 (2000).
  5. Terpos, E., et al. Soluble receptor activator of nuclear factor kappaB ligand-osteoprotegerin ratio predicts survival in multiple myeloma: proposal for a novel prognostic index. Blood. 102 (3), 1064-1069 (2003).
  6. Morony, S., et al. Osteoprotegerin inhibits osteolysis and decreases skeletal tumor burden in syngeneic and nude mouse models of experimental bone metastasis. Cancer Research. 61 (11), 4432-4436 (2001).
  7. Sobacchi, C., Schulz, A., Coxon, F. P., Villa, A., Helfrich, M. H. Osteopetrosis: genetics, treatment and new insights into osteoclast function. Nature Reviews Endocrinology. 9 (9), 522-536 (2013).
  8. Amarasekara, D. S., et al. Regulation of osteoclast differentiation by cytokine networks. Immune Network. 18 (1), 8(2018).
  9. Kim, J. M., Lin, C., Stavre, Z., Greenblatt, M. B., Shim, J. H. Osteoblast-osteoclast communication and bone homeostasis. Cells. 9 (9), (2020).
  10. Teitelbaum, S. L. Bone resorption by osteoclasts. Science. 289 (5484), 1504-1508 (2000).
  11. Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
  12. Baron, R., Neff, L., Louvard, D., Courtoy, P. J. Cell-mediated extracellular acidification and bone resorption: evidence for a low pH in resorbing lacunae and localization of a 100-kD lysosomal membrane protein at the osteoclast ruffled border. Journal of Cell Biology. 101 (6), 2210-2222 (1985).
  13. Blair, H. C., Teitelbaum, S. L., Ghiselli, R., Gluck, S. Osteoclastic bone resorption by a polarized vacuolar proton pump. Science. 245 (4920), 855-857 (1989).
  14. Zhu, L., et al. Osteoclast-mediated bone resorption is controlled by a compensatory network of secreted and membrane-tethered metalloproteinases. Science Translational Medicine. 12 (529), 6143(2020).
  15. Gowen, M., et al. Cathepsin K knockout mice develop osteopetrosis due to a deficit in matrix degradation but not demineralization. The Journal of Bone and Mineral Research. 14 (10), 1654-1663 (1999).
  16. Abu-Amer, Y. IL-4 abrogates osteoclastogenesis through STAT6-dependent inhibition of NF-kappaB. Journal of Clinical Investigation. 107 (11), 1375-1385 (2001).
  17. Patntirapong, S., Habibovic, P., Hauschka, P. V. Effects of soluble cobalt and cobalt incorporated into calcium phosphate layers on osteoclast differentiation and activation. Biomaterials. 30 (4), 548-555 (2009).
  18. Sorensen, M. G., et al. Characterization of osteoclasts derived from CD14+ monocytes isolated from peripheral blood. The Journal of Bone and Mineral Metabolism. 25 (1), 36-45 (2007).
  19. Kumar, A., et al. Synergistic effect of biphasic calcium phosphate and platelet-rich fibrin attenuate markers for inflammation and osteoclast differentiation by suppressing NF-kappaB/MAPK signaling pathway in chronic periodontitis. Molecules. 26 (21), 6578(2021).
  20. Henriksen, K., Karsdal, M. A., Taylor, A., Tosh, D., Coxon, F. P. Generation of human osteoclasts from peripheral blood. Methods in Molecular Biology. 816, 159-175 (2012).
  21. Maria, S. M., et al. Reproducible quantification of osteoclastic activity: characterization of a biomimetic calcium phosphate assay. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 102 (5), 903-912 (2014).
  22. Kong, L., Smith, W., Hao, D. Overview of RAW264.7 for osteoclastogensis study: Phenotype and stimuli. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (5), 3077-3087 (2019).
  23. Li, P., et al. Systemic tumor necrosis factor alpha mediates an increase in peripheral CD11bhigh osteoclast precursors in tumor necrosis factor alpha-transgenic mice. Arthritis & Rheumatology. 50 (1), 265-276 (2004).
  24. Arai, F., et al. Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor kappaB (RANK) receptors. Journal of Experimental Medicine. 190 (12), 1741-1754 (1999).
  25. Xing, L., et al. NF-kappaB p50 and p52 expression is not required for RANK-expressing osteoclast progenitor formation but is essential for RANK- and cytokine-mediated osteoclastogenesis. The Journal of Bone and Mineral Research. 17 (7), 1200-1210 (2002).
  26. Miyamoto, T., et al. Bifurcation of osteoclasts and dendritic cells from common progenitors. Blood. 98 (8), 2544-2554 (2001).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro
Posted by JoVE Editors on 6/10/2024. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/64016

Tags

Pit AssayOsteoclastic ResorptionCalcium Phosphate CoatingOsteoclast DifferentiationPBMC IsolationResorption Pit QuantificationVon Kossa StainingFluorescence ImagingM CSF RANKLImageJ Analysis

Related Articles