Методическая статья

Использование двойного оптического пинцета и микрофлюидики для исследований одной молекулы

DOI:

10.3791/64023

⸱

18 ноября 2022 г.

1Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of Nebraska Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Визуальная, одномолекулярная биохимия, изучаемая через микрофлюидные камеры, значительно облегчается с помощью стеклянной бочки, газонепроницаемых шприцев, стабильных соединений трубки с проточными клетками и устранения пузырьков путем размещения переключающих клапанов между шприцами и трубками. Протокол описывает двойные оптические ловушки, которые позволяют визуализировать транзакции ДНК и межмолекулярные взаимодействия.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Визуальная биохимия является мощным методом наблюдения стохастических свойств отдельных ферментов или ферментных комплексов, которые скрыты при усреднении, которое происходит в объемно-фазовых исследованиях. Для достижения визуализации двойные оптические пинцеты, где одна ловушка фиксирована, а другая подвижна, фокусируются в одном канале многопоточной микрофлюидной камеры, расположенной на ступени перевернутого флуоресцентного микроскопа. Оптический пинцет улавливает отдельные молекулы флуоресцентно меченой ДНК и жидкости, протекающей через камеру и мимо захваченных шариков, растягивает ДНК до В-формы (под минимальной силой, то есть 0 пН) с нуклеиновой кислотой, наблюдаемой в виде белой нити на черном фоне. Молекулы ДНК перемещаются из одного потока в другой, переводя стадию перпендикулярно потоку, чтобы обеспечить инициирование реакций контролируемым образом. Для достижения успеха микрофлюидные устройства с оптически чистыми каналами соединяют со стеклянными шприцами, удерживаемыми на месте в шприцевом насосе. Оптимальные результаты используют соединители, постоянно связанные с проточной ячейкой, трубки, которые являются механически жесткими и химически стойкими, и которые подключены к переключающим клапанам, которые устраняют пузырьки, препятствующие ламинарному потоку.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Способность визуализировать взаимодействия белка и ДНК на уровне одной молекулы и в режиме реального времени обеспечила значительное понимание стабильности генома 1,2. В дополнение к работе с отдельными молекулами ДНК по одной за раз, возможность просматривать транзакции между отдельными молекулами поблизости обеспечивает дополнительное понимание 3,4,5. Манипулирование дополнительными молекулами ДНК требует как дополнительных оптических ловушек, так и высококачественных, многоканальных, микрофлюидных проточных клеток6.

Существует несколько методов создания более одной оптической ловушки. К ним относятся сканирующие зеркала гальванометра, акустические оптические модуляторы и дифракционная оптика, которые генерируют голографический оптический пинцет 4,7,8,9. Часто сканирующие зеркала и акустические оптические модуляторы производят ловушки, которые делят время. В описанной здесь установке луч одного лазера Nd:YAG расщепляется на поляризацию, а затем лазерные сканирующие зеркала гальванометра контролируют положение того, что называется мобильной ловушкой (рисунок 1)4. Для облегчения позиционирования зеркал и фильтров для направления улавливающего луча на заднюю апертуру объектива микроскопа используется лазер HeNe. Это облегчает общее выравнивание, так как луч HeNe виден невооруженным глазом, в то время как инфракрасные лучи — нет. Луч HeNe также безопаснее для работы, что делает позиционирование зеркал и других компонентов менее напряженным. Первоначально путь луча для этого лазера отделен от луча 1064 нм, но вводится в тот же путь луча, а затем в объектив микроскопа. Как только физическое выравнивание достигнуто, позиционирование луча 1064 нм поверх луча HeNe выполняется, и это облегчается использованием инфракрасного средства просмотра и различных инструментов визуализации луча для визуализации положения и качества луча. Затем вводится расширитель луча, и полученный расширенный инфракрасный луч выравнивается по задней диафрагме объектива. Наконец, цель удаляется, а мощность в каждом поляризованном луче измеряется и регулируется с использованием волновых пластин λ/2, чтобы быть равной (рисунок 1C). Измерения мощности также выполняются после возврата цели, и обычно происходит потеря мощности 53%. Однако имеется достаточная мощность для формирования устойчивых фиксированных и движущихся оптических ловушек в фокальной плоскости (рисунок 1D).

Для получения изображений транзакций ДНК микрофлюидные проточные клетки играют ключевую роль, поскольку они позволяют проводить контролируемые измерения на уровне одной молекулы с высоким пространственным и временным разрешением (рисунок 2). Термин микрофлюидный относится к способности манипулировать жидкостями в одном или нескольких каналах с размерами от 5-500 мкмдо 10,11. Термин поток относится к фактической жидкости в канале, а канал относится к физическому каналу, в котором движется поток жидкости или потоки. Конструкция одноканальной проточной ячейки имеет общий физический канал, где наблюдаются реакции, и обычно присутствует только один поток жидкости. Таким образом, эти конструкции известны как однопоточные проточные ячейки. Напротив, многопоточные проточные ячейки определяются как микрофлюидное устройство, в котором два или более входных канала сходятся в один, общий, физический канал (рисунок 2A). В пределах общего канала потоки жидкости, которые исходят из отдельных каналов, текут параллельно друг другу и остаются разделенными с минимальным перемешиванием между ними, происходящим из-за диффузии (рисунок 2B). В большинстве экспериментальных установок один насос проталкивает жидкости в каждый канал с одинаковой скоростью. Напротив, когда используется граничное рулевое управление, три или более независимо управляемых насосов проталкивают жидкости через каналы. Однако каждый насос работает с разной скоростью, но чистый расход в общем канале постоянен12. Это позволяет быстро менять компоненты основного канала, просто изменяя скорость насоса.

В дополнение к ламинарному потоку, другим критическим фактором является профиль параболической скорости в ламинарном потоке жидкости. Самая высокая скорость потока происходит в середине потока, а самая медленная - рядом с поверхностями (рисунок 2C)13. Этот профиль должен рассматриваться как полностью растягивающий молекулу ДНК, которая прикреплена к шарику, удерживаемому в потоке, для точной визуализации флуоресцентной ДНК и точных одномолекулярных анализов. Здесь ДНК растягивается до В-формы и удерживается на месте под 0 пН силы. Для этого фокусировка положения оптической ловушки должна быть в положении 10-20 мкм от нижней поверхности крышки (рисунок 2D). Необходимо соблюдать осторожность, чтобы молекула ДНК не растягивалась за пределы В-формы, так как это может ингибировать ферментные реакции. В типичных буферных условиях 1 мкм = 3000 bp ДНК14. Кроме того, захватывая 10-20 мкм от покровного листа, комплекс ДНК позиционируется далеко от поверхности, тем самым сводя к минимуму поверхностные взаимодействия.

Многие методы были использованы для создания каналов микрофлюидных устройств, и они могут быть сделаны в лаборатории или проточные ячейки могут быть приобретены из коммерческих источников 6,15,16,17. Оптимальные материалы, используемые для построения проточных ячеек, должны быть механически жесткими, оптически прозрачными с низкой флуоресценцией и непроницаемыми для органических растворителей6. Часто боросиликатное флоат-стекло или плавленый кремнезем используются для обеспечения стабильной среды потока в течение длительного времени, которая подходит для оптического улавливания, визуализации и обнаружения силы. Эти материалы также позволяют использовать неводные растворители (например, спектрофотометрический метанол) для упрощения поверхностного смачивания и удаления пузырьков воздуха, а также денатуранты (например, 6M гуанидиния гидрохлорид) или моющие средства для очистки проточной ячейки. Наконец, методы, используемые для введения жидкостей в проточные ячейки, варьируются от сложных вакуумных насосных систем до насосов с одним шприцем 14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. В описанном здесь подходе используется шприцевой насос, который может вместить до 10 шприцев (рисунок 3А). Это обеспечивает гибкость при использовании одноканальных проточных ячеек или проточных ячеек с несколькими входными каналами. Здесь используется трехканальная проточная ячейка, которая соединена со шприцами, удерживаемыми на месте на шприцевом насосе с использованием трубки поли-эфир-эфир-кетон (PEEK) (рисунок 3A-C). Поток жидкостей контролируется четырехходовыми переключающими клапанами и, таким образом, служит для минимизации введения пузырьков в проточную ячейку (рисунок 3A,D). Кроме того, рекомендуются газонепроницаемые шприцы Hamilton, которые имеют жесткие стеклянные стенки и плунжеры с политетрафторэтиленовым (PTFE) покрытием, поскольку они обеспечивают исключительно плавное движение плунжера, что необходимо для получения плавного потока14,27.

В описанной экспериментальной системе использовались проточные ячейки с двумя-пятью входными каналами. Количество входных каналов диктуется проводимым экспериментом. Для исследования RecBCD и Hop2-Mnd1 было достаточно двух потоковых каналов14,28. Для геликазы фермент связывали со свободным концом ДНК и переводили в поток, содержащий магний и АТФ, чтобы инициировать транслокацию и раскручивание. Для Hop2-Mnd1 оптически захваченную ДНК переводили в соседний поток жидкости, содержащий белки и буферные ± двухвалентных ионов металлов. Использование трехканальных проточных клеток позволяет улавливать ДНК в потоке 1, переводить ДНК в поток 2, чтобы обеспечить связывание белка, а затем в поток 3, где присутствует АТФ, например, инициировать реакции. Вариацией вышесказанного является использование флуоресцентного помеченного белка в канале 2, что приводит к тому, что поток жидкости становится полностью белым и исключает визуализацию ДНК. Когда эта молекула транслируется в поток 3, и белки, и ДНК теперь видны, когда инициируются реакции.

Использование четырехходовых переключающих клапанов для управления потоком жидкости является критически важным компонентом системы для устранения пузырьков в проточных ячейках. Пузырьки наносят ущерб стабильному потоку жидкости, поскольку они сжимаются и расширяются непредсказуемым образом, что приводит к быстрым изменениям скорости потока и введению турбулентности. Когда клапаны расположены между шприцами и впускными трубками, путь потока отключается путем переключения положения клапана при смене шприцев. Когда новый шприц установлен на место, плунжер может быть вручную нажат, так что >6 мкл выбрасывается (мертвый объем клапана), и это почти полностью устраняет пузырьки.

Прикрепление соединителей к проточным ячейкам часто является шагом, ограничивающим скорость использования проточной ячейки. Описано использование двух типов разъемов: съемных, известных как press-fit, и постоянных (нанопортовых сборок). Съемные разъемы легко прикрепляются к проточной ячейке, и различные типы гибких трубок в дополнение к рекомендуемому PTFE могут быть протестированы с этими разъемами. Это быстрый и экономичный способ тестирования трубок и соединителей без ущерба для более дорогих стеклянных проточных ячеек. Напротив, нанопортовые сборки крепятся постоянно, выдерживают давление до 1000 фунтов на квадратный дюйм, и, в наших руках, их использование ограничено трубками PEEK разных диаметров. Это не является недостатком, так как предпочтительно использовать трубки PEEK. Одна стеклянная проточная ячейка с прикрепленными постоянными узлами может быть повторно использована более 1 года при тщательном использовании.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Выравнивание и тестирование лазерной ловушки с полистирольными шариками

ПРИМЕЧАНИЕ: Для установки обратитесь к рисунку 1A,B.

ВНИМАНИЕ: Экспериментатор должен носить соответствующие защитные очки или лазерные защитные очки во время выравнивания лазерного луча. Поскольку оптическая система пинцета, описанная в настоящем описании, использует как HeNe, так и ИК-лучи, требуются два отдельных набора лазерной безопасной стеклянной посуды.

  1. Выравнивание луча HeNe
    1. Расположите все оптические компоненты на макетной плате. Выровняйте макетную доску так, чтобы она была как можно ближе к углу 90° относительно микроскопа.
    2. Прикрепите к микроскопу сопрягаемую трубку, содержащую объектив и телановую линзу (рисунок 1А-11,12).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объектив telan представляет собой линзовую систему, которая используется для фокусировки изображения в промежуточной плоскости изображения в окулярах.
    3. Включите лазер HeNe и откройте затвор (рисунок 1А-18). Луч должен ударить фильтром (рисунок 1А-3) на высоте 54 мм, отражая 50% света на зеркало 5 (рисунок 1А-5). Остальные 50% луча ударяются о зеркало 4 (рисунок 1А-4) на той же высоте, что и зеркало 3.
    4. Отрегулируйте зеркало 4 (рисунок 1А-4) так, чтобы луч ударялся о зеркало 6 (рисунок 1А-6) на высоте 51 мм.
    5. Отрегулируйте зеркало 6 (рисунок 1А-6) так, чтобы луч был направлен на нижнее гальваническое зеркало на высоте 51 мм. Луч, выходящий из верхнего гальванического зеркала, будет на уровне 57,5 мм.
    6. Отрегулируйте зеркало 3 (рисунок 1А-3) так, чтобы этот луч ударялся о зеркало 5 (рисунок 1А-5) на высоте 57,5 мм. После отражения от зеркала 5 луч должен удариться о зеркало 9 (рисунок 1А-9) на той же высоте. Луч эффективно рекомбинируется в зеркале 9, проходит через объектив, а система линз телана на зеркало 21 (рисунок 1А-21), которое отражает его в объектив.
    7. Поместите чистый слайд микроскопа на сцену микроскопа. Включите камеру и нарисуйте лучи фиксированного и сканирующего лучей по отдельности на экране. Начиная с зеркала 3, затем 5 и 9, наконец, 21, выполняйте небольшие корректировки, чтобы расположить фиксированный луч в центре экрана.
    8. Чтобы убедиться, что угол выхода из зеркала луча 21 составляет 90°, измените Z-высоту микроскопа и расположите луч, изображенный на верхней и нижней поверхностях слайда. Когда они идентичны, луч находится в правильном положении, которое перпендикулярно сцене. Закройте этот луч с помощью затвора 19 (рисунок 1А-19).
    9. Начиная с зеркал 4 и 6, выполните небольшие настройки, чтобы расположить фиксированный луч в центре экрана. Затвор этого луча.
  2. Выравнивание инфракрасного (ИК) луча
    ВНИМАНИЕ: Выполняйте все шаги при низкой мощности лазера по соображениям безопасности.
    1. Отрегулируйте волновую пластину 14 (фиг.1А-14) для регулировки соотношения передаваемых и отраженных пучков, расщепляемых на делителе пучка 2 (фиг.1А-2). Делитель луча 2 отражает s-компонент лазерного луча и передает p-компонент.
    2. Луч, проходящий через 2, ударяется о зеркало 7 (рисунок 1А-7), которое отклоняет луч на нижнее гальваническое зеркало. Он должен следовать по пути луча HeNe на зеркало 21. Выполняйте небольшие движения зеркала 7 для достижения этого позиционирования.
    3. Отрегулируйте зеркало 2 так, чтобы луч, отраженный зеркалом 2, ударял по зеркалу 10 (рисунок 1А-10) на высоте 57,5 мм.
    4. Луч отражается от зеркала 10 на зеркало 8 (рисунок 1А-8) на высоте 57,5 мм. Последующий луч должен ударить зеркалом 9 на той же высоте. Если нет, внесите небольшие коррективы в зеркала 10 и 8 по мере необходимости.
    5. Снимите объектив и поместите головку измерителя мощности над портом в объективную башню.
    6. Используйте пластины 14, 15 и 16 (рисунок 1A-14,15,16) для регулировки мощности каждого лазерного луча таким образом, чтобы они были равны, как показано на рисунке 1C.
    7. Поставьте расширитель балки 1 (рисунок 1А-1) на место. Отрегулируйте расширенный лазерный луч, чтобы он был круглым без комы или астигматизма.
    8. Для проверки оптических ловушек делают раствор из 1 мкм полистирольных шариков, взвешенных в воде. Затем поместите 10 мкл этого раствора на предметное стекло микроскопа, сверху поместите накладку и запечатайте лаком для ногтей. Поместите затвор на ступень микроскопа и проверьте оптические ловушки, захватив эти шарики размером 1 мкм. Убедитесь, что бусины засасываются в ловушки и удерживаются стабильно при перемещении сцены. Отлов должен происходить одинаково эффективно со всех сторон ловушки.

2. Подготовка микрофлюидной камеры

  1. Если проточная ячейка представляет собой коммерчески сконструированное устройство, изготовленное из полидиметилсилоксана (PDMS) на крышке, перейдите к этапу 3. Если это стеклянное устройство с подключенными разъемами, перейдите к шагу 4.
  2. Если проточная ячейка не имеет разъемов, сначала прикрепите их к входным отверстиям на слайде микроскопа. В шаге 3 приведены инструкции по подключению соединителей.

3. Соединения проточных ячеек с помощью проточной ячейки PDMS

ПРИМЕЧАНИЕ: Для настройки обратитесь к рисунку 2D.

  1. Поместите проточную ячейку на чистую плоскую поверхность. Удерживайте трубку из PTFE на расстоянии 3 мм от свободного конца щипцами. Вставьте трубку в предварительно сформированное отверстие (порт может поддерживать давление в линии 2 бара).
  2. Повторите эту процедуру для каждого из оставшихся портов. Подключите входные отверстия к шприцевому насосу, а выходное отверстие к бутылке для отходов (рисунок 4A,B).
  3. Наполните каждый стеклянный шприц 1 мл спектрофотометрического метанола. Прикрепите каждый шприц к переключающему клапану. Убедитесь, что клапан имеет выходное отверстие, направленное на отходы, и продувайте каждую линию 50 мкл метанола (рисунок 4C, закрытое положение).
  4. Переключите положение выходного отверстия на проточную ячейку (рисунок 4C, открытое положение). Перекачивайте 800 мкл метанола через проточную ячейку со скоростью потока 100 мкл/ч для намокания поверхностей и устранения пузырьков.
  5. На следующий день повторите этот процесс, используя 800 мкл сверхчистой воды. Теперь проточная ячейка готова к использованию.

4. Крепление разъемов для нажимной трубки

ПРИМЕЧАНИЕ: Для настройки обратитесь к рисунку 2F.

  1. Если необходимо использовать нажимные соединители трубки, осторожно снимите клейкую ленту с одной стороны разъема и поместите ее над отверстием в слайде микроскопа. Нажмите вниз в течение нескольких секунд. Повторите этот процесс для остальных соединителей.
  2. Поместите проточную ячейку на чистую плоскую поверхность. Удерживайте трубку из PTFE на расстоянии 3 мм от свободного конца щипцами. Вставьте трубку в предварительно сформированное отверстие в порту и повторите эту процедуру для каждого из оставшихся портов.
  3. Прикрепите трубку от впускных отверстий к переключающим клапанам. Перейдите к шагу 7.

5. Прикрепление постоянных собраний

ПРИМЕЧАНИЕ: Для настройки обратитесь к рисунку 2A-C.

  1. Выполните крепление либо на чистой, плоской поверхности, либо на специально изготовленном коллекторе, чтобы удерживать проточную ячейку и соединители на месте во время склеивания.
  2. Поместите проточную ячейку на чистую плоскую поверхность или в утопленную секцию коллектора (рисунок 2B). Поместите небольшое количество стеклянного клея на дно сборки и вставьте уплотнение.
  3. Расположите нанопорт над одним из входных отверстий на слайде микроскопа. Осторожно надавите вниз и удерживайте на месте без бокового движения. Повторите этот процесс для остальных портов.
  4. Дайте высохнуть или зажать на месте в коллекторе. Осторожно извлеките проточную ячейку из коллектора и убедитесь, что сборки хорошо выровнены с входными портами в проточной ячейке. Перейдите к шагу 7, когда будете готовы.

6. Соединения и подготовка проточных ячеек

ПРИМЕЧАНИЕ: Для установки обратитесь к рисунку 4A,B.

  1. Поместите проточную ячейку на ступень микроскопа. Прикрепите трубку с помощью герметичных разъемов.
  2. Наполните каждый стеклянный шприц 1 мл спектрофотометрического метанола. Прикрепите каждый шприц к переключающему клапану. Убедитесь, что клапан имеет выходное отверстие, направленное на отходы, и продувайте каждую линию 50 мкл метанола (рисунок 4C, закрытое положение).
  3. Переключите положение выходного отверстия на проточную ячейку (рисунок 4C, открытое положение). Перекачивайте 800 мкл метанола через проточную ячейку со скоростью потока 100 мкл/ч для намокания поверхностей и устранения пузырьков.
  4. На следующий день повторите этот процесс, используя 800 мкл сверхчистой воды. Теперь проточная ячейка готова к использованию.

7. Контроль потока жидкости

  1. Поверните переключающие клапаны в закрытое положение (рисунок 4C). Извлеките шприцы, выбросьте остаточную воду, а шприцы наполните экспериментальными растворами, например, ДНК-шариками; фермент; и СПС. Верните шприцы в насос и подключите их к переключающим клапанам.
  2. В этом положении вручную зажмите плунжеры вниз на 5-10 мкл, чтобы удалить пузырьки. Измените положение переключающего клапана на Открыть.
  3. Используйте схему расхода для достижения оптимальной скорости потока жидкости для улавливания и визуализации, как описано в таблице 1. Оптимальный поток жидкости для оптического улавливания должен обеспечивать стабильное улавливание шариков, и как только ДНК растягивается, она должна быть B-формой (~ 3000 bp / μm).

8. Улавливание полистирольных шариков с прикрепленными одиночными молекулами ДНК

  1. При 10-кратном увеличении найдите границу между потоками жидкости близко к точкам входа в канал. Добавьте масло к 100-кратному объективу и переключитесь на более высокое увеличение.
  2. Откройте жалюзи для оптических ловушек (оба или по одному). Сфокусированные лазерные лучи должны захватывать бусины, а ДНК должна немедленно растягиваться.
  3. После того, как комплекс был захвачен, переведите стадию перпендикулярно потоку (рисунок 3A, C, вставка). Это переместит захваченный комплекс из раствора ДНК в поток 2. Дальнейший перевод переместит комплекс в поток 3.

9. Очистка проточных ячеек

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте это ежедневно.

  1. Выключите насос после завершения эксперимента. Поверните переключающие клапаны в закрытое положение (рисунок 4C).
  2. Снимите шприцы и опорожните их. Промыть три раза фильтрованной дистиллированной водой.
  3. Наполните шприцы чистящим раствором. Поместите шприцы в насос и подключите к переключающим клапанам.
  4. Продувка коммутационных клапанов и изменение положения на открытие. Перекачивайте 800 мкл чистящего раствора со скоростью потока 100 мкл/ч обычно в течение ночи.
  5. На следующий день закройте переключающие клапаны, а затем снимите и промойте шприцы водой. Промыть проточную ячейку и линии 4-800 мкл воды со скоростью потока 400-800 мкл/ч. Если требуется более напряженная очистка проточных клеток, замените чистящий раствор 6 М гуанидия гидрохлорида.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Первоначальные испытания выравнивания и прочности ловушки проводятся с помощью 1 мкм, нефлуоресцентных полистирольных шариков. Поскольку большая часть исследований, проведенных в лаборатории, использует флуоресценцию, мы дополнительно проверяем прочность ловушки с использованием 1 мкм, зеленых полистирольных шариков Dragon (рисунок 1D, E). После этого работа переходит на оптическое улавливание ДНК-шариковых комплексов, где ДНК окрашивается бис-интеркалирующим красителем YOYO...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Тщательная сборка системы потока имеет решающее значение для успешного исхода экспериментов 4,6. Одним из наиболее сложных аспектов протокола является прикрепление разъемов к поверхности стекла. Для этого мы используем следующие два подхода: прижимные подгонки трубных разъемов и нанопортовые сборки. Прижимные разъемы легко прилипают к стеклу с последующим проталкиванием трубки из PTFE в предварительно сформированные отверстия с помощью щипцов. Когда требуется бол...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследования в лаборатории Bianco поддерживаются грантами NIH GM100156 и GM144414 P.R.B.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
100-кратный объективLeica506318 или 506038масляные иммерсионные линзы; Только визуализация и оптический захват; План APO объективы оптимизированы для флуоресцентной визуализации
10X ОбъективLeica506263Используется для определения местоположения лазерных лучей во время юстировки; для определения фокуса и положения X-Y в проточной ячейке
1 мм флуоресцентныешарики Bangs LabsFSDG004Используется для выполнения отвода, определения положения фокуса
1 мм полистирольные шарикиBangs LabsCPO1004Используется для оценки производительности ловушек и связывания с биотинилированными молекулами
63-кратный объективLeica506081Используется для определения местоположения лазерных лучей во время юстировки и для определения фокуса и положения X-y в проточной ячейке; может использоваться для оптической ловушки, так как имеет диаметр задней апертуры, идентичный диаметру 100X; масляная иммерсионная линза
Юстировочный лазерLumentumсерии1100HeNe лазер мощностью 10 мВт, видимый невооруженным глазом, который используется для позиционирования оптики
Камера выравнивания лучаAmscopeMU303Простая, недорогая и управляемая программным обеспечением камера для визуализации положения луча
Программное обеспечение для управления камерой и захвата изображенийHamamatsuHCImageКоординаты деятельности Lambda DG4 с камерой для облегчения быстрого переключения длин волн
Камера; Orca flash 4Hamamatsuc13440-20cuCCD камера для визуализации экспериментов с одиночными молекулами
C-mount для юстировки луча камерыSpot imaging solutionsDE50CMTОбеспечивает оптимальное позиционирование камеры для визуализации лазерных лучей во время юстировки
C-mount для камерыOrca Flash 4Имеет стопорное кольцо для удержания ИК-блокирующего фильтра на месте. Это устраняет отраженный ИК-луч от оптических ловушек и способствует более четкому изображению захваченных объектов.
Cy5  куб флуоресцентного фильтраSemrockcy5-404a-lsc-zeroИспользуется в сочетании с Lambda DG4 для изображения только Cy5
Fitc-Txred  куб флуоресцентного фильтраSemrockfitc/txred-2x-b-000Используется в сочетании с Lambda DG4 для визуализации трубки FITC и TXRed
FluidicsGrace Bio46004Трубки из ПТФЭ в качестве альтернативы ПЭЭК; Хорошо работает на некоторых проточных ячейках. Может использоваться с проточными ячейками PDMS или стеклянными проточными ячейками, когда используются соединители трубок Grace Bio fit
GFP Куб флуоресцентного фильтраSemrockgfp-3035b-lsc-zeroИспользуется в сочетании с Lambda DG4 для визуализации только GFP
Стеклянные проточные ячейкиTranslumeCustomClear Flow channels для визуализации (рис. 2E)
Стеклянный клейLoctite233841Надежно и легко прикрепляет нанопортовые сборки к стеклянным проточным ячейкам
Стеклянные/PDMS многослойные проточные ячейкиCIDRA Прецизионные услуги ИндивидуальныйдизайнПроточные ячейки изготовлены в соответствии с вашими спецификациями; каналы визуализации прозрачны (рис. 2C)
Чистящее решение HamiltonHamilton18311Щадящее, но эффективное чистящее раствор для стеклянных проточных ячеек; не пузырится при аккуратном использовании
Система освещенияSutter InstrumentLamda DG4Снято с производства так что рекомендуем Lambda 721
Система освещенияSutter InstrumentLamda DG4Снято с производства поэтому рекомендуем Lambda 721
Программное обеспечение для анализа изображенийМедиакибернетикаImage Pro PremiereАнализ изображений и отслеживание одиночных молекул
Программное обеспечение для анализа изображенийFiji/NIH Image/Image JSharewareАнализ изображений и отслеживание одиночных молекул
Изображение дисплей картыMelles Griot06 DLA 001Альтернативный продукт от Thorlabs: VRC5
Immersion oilZeiss444960Immersol 518 F Флуоресцентные
инструменты для юстировки лазерного лучаThor labsFMP05/M; dgo5-1500-h1; BHM1 Используется для обеспечения горизонтального расположения балок на правильной высоте
Просмотрщик лазерного лучаCanadian Photonics labsIR 3150Используется для отображения пятен ИК-луча на зеркалах и  мишенях
Измеритель мощности лазераThor labsИзмерение выходной мощности лазера, а также прочности ловушки
Лазерные защитные очки (HeNe)Thor labsLG7 или 8блоков >3 единицы OD света длин волн >600 нм
Лазерные защитные очки (IR)Thor labsLG11Блоки >7 ОД единиц света длин волн ³ 1000 нм
Mcherry  флуоресцентный фильтр кубSemrockmcherry-a-lsc-zeroИспользуется в сочетании с Lambda DG4 для получения изображений только на черри
МикроскопLeicaDMIRE2Порт DIC удален для размещения дихроичного захвата/юстировки зеркала
Программное обеспечение для управления микроскопом UCSF/условно-бесплатное программное обеспечениеuManagerУправление микроскопом, позволяет фокусное выравнивание объективов, а также управление столиком
Сборка нанопортовIDEXN333Разъемы, которые соединяются с проточными ячейками
Поддержка оптических столовThor LabsPA52502Поддержка активных изоляционных столов
Оптика и линзыSolar TIIРазличныеИнтерференционные зеркала, телескопы и линзы специально разработаны для системы
проточных ячеек PDMSufluidixПользовательскиепроточные ячейки изготовлены в соответствии с вашими спецификациями; каналы визуализации прозрачны (рис. 2B и D)
Трубка PEEKIDEX1532Обеспечивает отличное соединение с проточными ячейками и переключающими клапанами
Флуоресцентный фильтр Пинкеля кубSemrocklf488/543/635-3x-a-000Используется в сочетании с Lambda DG4 для визуализации нескольких флуорофоров, быстро
прижимает трубки, разъемыGraceBio46003прозрачный силиконовый соединитель с клеем, который хорошо прилипает к стеклу
сканирующие зеркала,GSI LumonicsVM500используются для обеспечения контроля второй оптической ловушки. GSI Lumonics больше не существует. Подобные зеркала можно приобрести в Кембриджском научном
комплексеLeica
Stage микрометрЭлектронная микроскопия Sciences68042-08Обеспечивает на экране линейку для позиционирования луча и калибровки системы
Переключающие клапаныIDEXV-101TКонтролируют направление потока жидкости и исключают попадание пузырьков в проточные
ячейки Шприц и клапанный коллекторМеханический цехНетИзготовленный на заказ
Шприцевой насосHarvard ApparatusPHD 2000Контролирует расход жидкости через проточные ячейки
Программное обеспечение шприцевого насосаHarvard Apparatus70-6000Flowcontrol обеспечивает бесшовное, программируемое управление потоком жидкости
ШприцыHamilton81320Газонепроницаемый, PTFE Luer Lock, стеклянные цилиндры с Плунжеры с тефлоновым покрытием
СтолешницаThor LabsT36HОптическая настольная или макетная плата
Улавливающий лазерNewport/Spectra PhysicsJ-series; BL106CNd:YAG лазер; 1064 нм; 5 Вт лазер
, , ,

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bianco, P. R., Lu, Y. Single-molecule insight into stalled replication fork rescue in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 49 (8), 4220-4238 (2021).
  2. Kaur, G., Lewis, J. S., van Oijen, A. M. Shining a spotlight on DNA: Single-molecule methods to visualise DNA. Molecules. 24 (3), Basel, Switzerland. 491(2019).
  3. Dame, R. T., Noom, M. C., Wuite, G. J. Bacterial chromatin organization by H-NS protein unravelled using dual DNA manipulation. Nature. 444 (7117), 387-390 (2006).
  4. Bianco, P. R., Bradfield, J. J., Castanza, L. R., Donnelly, A. N. Rad54 oligomers translocate and cross-bridge double-stranded DNA to stimulate synapsis. Journal of Molecular Biology. 374 (3), 618-640 (2007).
  5. Amitani, I., Liu, B., Dombrowski, C. C., Baskin, R. J., Kowalczykowski, S. C. Watching individual proteins acting on single molecules of DNA. Methods in Enzymology. 472, 261-291 (2010).
  6. Brewer, L. R., Bianco, P. R. Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions. Nature Methods. 5 (6), 517-525 (2008).
  7. Visscher, K., Brakenhoff, G. J., Krol, J. J. Micromanipulation by multiple optical traps created by a single fast scanning trap integrated with the bilateral Confocal scanning laser microscope. Cytometry. 14, 105-114 (1993).
  8. Vermeulen, K. C., Mameren, J. v Calibrating bead displacements in optical tweezers using acousto-optic deflectors. Review of Scientific Instruments. 77 (1), 013704(2006).
  9. Dufresne, E. R. Computer-generated holographic optical tweezers arrays. Review of Scientific Instruments. 72 (3), 1810(2001).
  10. Squires, T. M., Quake, S. R. Microfluidics: fluid physics at the nanoliter scale. Reviews of Modern Physics. 77, 977-1026 (2005).
  11. Weibel, D. B., Whitesides, G. M. Applications of microfluidics in chemical biology. Current Opinion in Chemical Biology. 10 (6), 584-591 (2006).
  12. Tan, X., Mizuuchi, M., Mizuuchi, K. DNA transposition target immunity and the determinants of the MuB distribution patterns on DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (35), 13925-13929 (2007).
  13. Lima, R., Wada, S., Takeda, M., Tsubota, K., Yamaguchi, T. In vitro confocal micro-PIV measurements of blood flow in a square microchannel: the effect of the haematocrit on instantaneous velocity profiles. Journal of Biomechanics. 40 (12), 2752-2757 (2007).
  14. Bianco, P. R., et al. Processive translocation and DNA unwinding by individual RecBCD enzyme molecules. Nature. 409 (6818), 374-378 (2001).
  15. Forget, A. L., Dombrowski, C. C., Amitani, I., Kowalczykowski, S. C. Exploring protein-DNA interactions in 3D using in situ construction, manipulation and visualization of individual DNA dumbbells with optical traps, microfluidics and fluorescence microscopy. Nature Protocol. 8 (3), 525-538 (2013).
  16. Streets, A. M., Huang, Y. Microfluidics for biological measurements with single-molecule resolution. Current Opinion in Biotechnology. 25, 69-77 (2014).
  17. Madariaga-Marcos, J., Corti, R., Hormeno, S., Moreno-Herrero, F. Characterizing microfluidic approaches for a fast and efficient reagent exchange in single-molecule studies. Scientific Reports. 10 (1), 18069(2020).
  18. Grayson, P., Han, L., Winther, T., Phillips, R. Real-time observations of single bacteriophage lambda DNA ejections in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (37), 14652-14657 (2007).
  19. Luo, G., Wang, M., Konigsberg, W. H., Xie, X. S. Single-molecule and ensemble fluorescence assays for a functionally important conformational change in T7 DNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (31), 12610-12615 (2007).
  20. Sia, S. K., Whitesides, G. M. Microfluidic devices fabricated in poly(dimethylsiloxane) for biological studies. Electrophoresis. 24 (21), 3563-3576 (2003).
  21. Wuite, G. J. L., Davenport, R. J., Rappaport, A., Bustamante, C. An integrated laser trap/flow control video microscope for the study of single biomolecules. Biophysical Journal. 79 (2), 1155-1167 (2000).
  22. Kim, S., Blainey, P. C., Schroeder, C. M., Xie, X. S. Multiplexed single-molecule assay for enzymatic activity on flow-stretched DNA. Nature Methods. 4 (5), 397-399 (2007).
  23. Tanaka, H., Ishijima, A., Honda, M., Saito, K., Yanagida, T. Orientation dependence of displacements by a single one-headed myosin relative to the actin filament. Biophysical Journal. 75 (4), 1886-1894 (1998).
  24. Merenda, F., et al. Refractive multiple optical tweezers for parallel biochemical analysis in micro-fluidics. Proceeding of SPIE. Andrews, D. L., Galves, E. J., Nienhuis, G. , 6483(2007).
  25. Brewer, L. R., Corzett, M., Balhorn, R. Protamine-induced condensation and decondensation of the same DNA molecule. Science. 286 (5437), 120-123 (1999).
  26. Ladoux, B., Quivy, J. P., Doyle, P. S., Almouzni, G., Viovy, J. L. Direct imaging of single-molecules: from dynamics of a single DNA chain to the study of complex DNA-protein interactions. Science Progress. 84, 267-290 (2001).
  27. Bianco, P. R., Bradfield, J. J., Castanza, L. R., Donnelly, A. N. Rad54 oligomers translocate and cross-bridge double-stranded DNA to stimulate synapsis. Journal of Molecular Biology. 374 (3), 618-640 (2007).
  28. Pezza, R. J., Camerini-Otero, R. D., Bianco, P. R. Hop2-Mnd1 condenses DNA to stimulate the synapsis phase of DNA strand exchange. Biophysical Journal. 99 (11), 3763-3772 (2010).
  29. Rye, H. S., et al. Stable fluorescent complexes of double-stranded DNA with bis-intercalating asymmetric cyanine dyes: properties and applications. Nucleic Acids Research. 20 (11), 2803-2812 (1992).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи