Желудочно-кишечный тракт является одним из наиболее чувствительных органов к травмам при радиотерапевтическом лечении рака. Это одновременно система органов с одной из самых высоких регенеративных способностей после таких инсультов. Представленный протокол описывает эффективный метод исследования регенеративной способности кишечного эпителия.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Регенерация эпителия кишечника в ответ на ионизирующее облучение
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Кишечный эпителий состоит из одного слоя клеток, но содержит несколько типов терминально дифференцированных клеток, которые образуются в результате активной пролиферации кишечных стволовых клеток, расположенных на дне кишечных крипт. Однако во время острого повреждения кишечника эти активные кишечные стволовые клетки подвергаются клеточной гибели. Гамма-облучение является широко используемым методом лечения колоректального рака, который, хотя и является терапевтически эффективным, имеет побочный эффект истощения активного пула стволовых клеток. Действительно, пациенты часто испытывают желудочно-кишечный лучевой синдром во время лучевой терапии, отчасти из-за активного истощения стволовых клеток. Потеря активных кишечных стволовых клеток в кишечных криптах активирует пул обычно спокойных резервных стволовых клеток кишечника и индуцирует дедифференцировку секреторных и энтероцитарных клеток-предшественников. Если бы не эти клетки, кишечный эпителий не смог бы восстановиться после лучевой терапии и других подобных серьезных повреждений тканей. Новые достижения в технологиях отслеживания линий позволяют отслеживать активацию, дифференцировку и миграцию клеток во время регенерации и успешно используются для изучения этого в кишечнике. Это исследование направлено на то, чтобы изобразить метод анализа клеток кишечного эпителия мыши после лучевого поражения.
Введение
Кишечный эпителий человека покрывал бы примерно половину площадки для бадминтона, если бы он былполностью плоским1. Вместо этого этот одноклеточный слой, отделяющий людей от содержимого их кишечника, уплотняется в серию пальцевидных выступов, ворсинок и углублений, крипт, которые максимизируют площадь поверхности кишечника. Клетки эпителия дифференцируются по оси крипты-ворсинки. Ворсинки в основном состоят из поглощающих питательные вещества энтероцитов, бокаловидных клеток, секретирующих слизь, и гормонопродуцирующих энтероэндокринных клеток, в то время как крипта в основном состоит из дефензин-продуцирующих клеток Панета, активных
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все мыши были размещены в Отделе лабораторных ресурсов животных (DLAR) в Университете Стоуни-Брук. Институциональный комитет по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Стоуни-Брук одобрил все исследования и процедуры с участием животных. Эксперименты с участием животных проводились строго в соответствии с утвержденным протоколом обращения с животными (IACUC #245094).
ПРИМЕЧАНИЕ: Штаммы мыши B6;129-Bmi1 tm1(cre/ERT)Mrc/J (Bmi1-Cre ER) и B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J (Rosa26eYFP) были коммерчески получены (см. Таблицу материалов) и скрещены для получения
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Использование облучения всего тела (ЧМТ) 12 Гр в сочетании с отслеживанием генетического происхождения мышей позволяет провести тщательный анализ последствий лучевого поражения кишечника. Для начала, Bmi1-CreER; Мыши Rosa26eYFP получили однократную инъекцию тамоксифена, которая индуцирует повышенную экспрессию желтого флуоресцентного белка (EYFP) в резервной популяции стволовых клеток Bmi1+ . Через два дня после инъекции тамоксифена мыши подверглись облучению или фиктивному облуч.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Этот протокол описывает надежную и воспроизводимую модель лучевого поражения. Это позволяет проводить точный анализ изменений в кишечном эпителии в течение 7 дней после травмы. Важно отметить, что выбранные временные точки отражают критические стадии повреждения и характеризуются отчетливыми изменениями в кишечнике (фазы травмы, апоптоза, регенерации и нормализации)60. Эта модель облучения была создана и тщательно оценена, демонстрируя подходящее проявление травмы, имитирующее то, что испытывают п.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Конфликт интересов у авторов отсутствует.
Благодарности
Авторы выражают благодарность Центру исследований гистологии Онкологического центра Стоуни-Брук за экспертную помощь в подготовке образцов тканей и Отделу ресурсов лабораторных животных Университета Стоуни-Брук за помощь в уходе за животными и обращении с ними. Эта работа была поддержана грантами Национального института здравоохранения DK124342, присужденными Агнешке Б. Бялковской, и DK052230 доктору Винсенту В. Янгу.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Шприц | 1 мл BD | 309659-16G | |
| Многоразовые иглы для кормления мелких животных: Прямая | VWR | 20068-630-27G | |
| x 1/2" игла | BD | ||
| 305109-28G x 1/2" Монопроект 1 мл инсулиновый шприц | Covidien | ||
| ′-дезоксиуридин (EdU) | Santa Cruz Biotechnology | sc284628A | 10 мг/мл в стерильном ДМСО:воде (1:4 об./об.), аликвоте и хранить при -20°С; C |
| Azer Scientific 10% нейтральный буферизованный формалин | Fisher Scientific | 22-026-213-B6.129X1-GT | |
| (ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J | Лабораторный | штамм Джексона #:006148 | |
| B6; 129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/J | Лабораторный | штамм Джексона #:010531 | |
| Бычья сыворотка Альбумин Фракция V, тепловой шок | Millipore-Sigma | 3116956001 | |
| Курица анти-GFP | Aves | GFP-1020 | |
| Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 набор для визуализации, Invitrogen | Thermo Fisher Scientific | C10638-Кукурузное | |
| масло | Millipore-Sigma | C8267-Decloaking | |
| Chamber | Biocare Medical | DC2012-Диметилсульфоксид | |
| (ДМСО) | Fisher BioReagents | BP231-100 | светочувствительная |
| ДНКаза-безпротеиназа K | Invitrogen | C10618H | разведенная в 25 раз в DPBS |
| Donkey anti-chicken AF647 | Jackson ImmunoResearch | 703-605-155 | |
| DPBS | Fisher Scientific | 21-031-CV-Eosin | |
| Fisher Scientific | S176 | ||
| Флуоресцентный микроскоп Nikon Eclipse 90i Яркий и флуоресцентный свет, с объективами: 10X, 20X | Nikon | ||
| Fluoromount Aqueous Mounting Medium | Millipore-Sigma | F4680-25ML | |
| Gamma Cell 40 Exactor | Best Theratronics Ltd. | - | 0,759 Гр мин<суп>-1 |
| козий антикролик AF488 | Jackson ImmunoResearch | 111-545-144 | |
| Раствор гематоксилина, Гилл No3 | Millipore-Sigma | GHS332 | |
| HM 325 Ротационный микротом от Thermo | Scientific Fisher Scientific | 23-900-668 | |
| Hoechst 33258, пентагидрат (бис-бензимид) | Thermo Fisher Scientific | H3569 | разбавление 1:1000 |
| раствор перекиси водорода, ACS, 29-32%, Spectrum Chemical | Fisher Scientific | 18-603-252-In | |
| Situ Cell Death Kit, флуоресцеин (Roche) | Millipore-Sigma | 11684795910 | |
| блокатор жидкости Super PAP PEN, Mini | Fisher Scientific | DAI-PAP-S-M | |
| Карбонат лития (порошок/сертифицированный ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | L119-500 | 0,5 г/1 л dH2O |
| Luer-Lok Шприц стерильный, одноразового использования, 10 мл | VWR | 89215-218-метанол | |
| VWR | BDH1135-4LP | ||
| Pharmco Products Этиловый спирт, 200 PROOF | Fisher Scientific | ||
| NC1675398-Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Уксусная кислота ACS Grade | Capitol Scientific | AAP-281000ACSCSLT-Rabbit | |
| anti-Ki67 | BioCare Medical | CRM325 | |
| Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL монтаж Medium | Fisher Scientific | 22-050-262 | |
| Scientific Industries Инкубатор-джинн для выпечки горок при температуре 65 градусов | Fisher Scientific | 50-728-103 | |
| Дигидрат цитрата натрия | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Набор для препарирования нержавеющей стали | VWR | 25640-002 | |
| Superfrost Plus микрослайды [размер: 25 x 75 x 1 мм] | VWR | 48311-703 | |
| Тамоксифен | Millipore-Sigma | T5648 | 30 мг/мл в стерильном кукурузном масле, предпочтительно в свежем виде или при краткосрочном хранении при температуре -20°С; C, светочувствительные |
| держатели Tissue-Tek 24-Slide со съемной ручкой | Sakura | 4465 | |
| Tissue-Tek Акку-Эдж Низкопрофильные лезвия | Sakura | 4689 | |
| Tissue-Tek Ручной набор для окрашивания слайдами | Sakura | 4451 | |
| Tissue-Tek Тарелка для окрашивания, зеленый с крышкой | Sakura | 4456 | |
| Тарелка для окрашивания Tissue-Tek, белый с крышкой | Sakura | 4457 | |
| Tween 20 | Millipore-Sigma | P7949 | |
| Unisette Кассеты для обработки | VWR | 87002-292-VWR | |
| Micro Cover Glasses | VWR | 48393-081 | |
| Ксилол | Фишер Научный | X5P-1GAL |
Ссылки
- Helander, H. F., Fandriks, L. Surface area of the digestive tract - Revisited. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 49 (6), 681-689 (2014).
- vander Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithel....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
