Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Конструирование аденовирусных векторов с использованием технологии сборки ДНК

1.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/64033

⸱

16 июня 2022 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1NHC Key Laboratory of Medical Virology and Viral Diseases, State Key Laboratory for Infectious Disease Prevention and Control, National Institute for Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, 2Laboratory of Infection and Virology, Beijing Pediatric Research Institute, Beijing Children’s Hospital, Capital Medical University, Key Laboratory of Major Diseases in Children, Ministry of Education, National Clinical Research Center for Respiratory Diseases, National Center for Children’s Health, 3Henan Chemical Technician College, 4Research Unit of Critical Infection in Childre, Chinese Academy of Medical Sciences, 5Chinese Academy of Sciences Joint Research Center for Emerging Infectious Diseases and Biosafety, Chinese Center for Disease Control and Prevention-Wuhan Institute of Virology

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В этом исследовании был сконструирован инфекционный клон аденовируса человека типа 7 (HAdV-7) и создана векторная система HAdV-7, удаленная E3, путем модификации инфицированного клона. Эта стратегия, используемая здесь, может быть обобщена для создания векторов переноса генов от других аденовирусов дикого типа.

Аннотация

Аденовирусные векторы используются в качестве инструмента переноса генов в генной терапии уже более трех десятилетий. В данной работе мы представляем протокол для конструирования аденовирусного вектора путем манипулирования геномной ДНК HAdV-7 дикого типа с использованием метода сборки ДНК. Во-первых, инфекционный клон HAdV-7, pKan-Ad7, был получен путем слияния вирусной геномной ДНК с продуктом ПЦР из плазмидного каркаса, состоящим из гена, устойчивого к канамицину, и источника репликации (Kan-Ori), посредством сборки ДНК. Это было сделано путем разработки пары ПЦР-праймеров, которые содержали ~25 нуклеотидов концевой последовательности инвертированного концевого повтора (ITR) HAdV-7 на 5'-конце, нерестрикционный ферментный сайт для генома HAdV-7 в середине и специфичную для ПЦР последовательность для ПЦР-прайминга на 3'-конце. Во-вторых, была использована промежуточная стратегия на основе плазмид для замены области Е3 на трансген-экспрессирующие элементы в инфицированном клоне для создания аденовирусного вектора. Вкратце, pKan-Ad7 расщепляли с помощью фермента рестрикции Hpa I, и фрагмент, содержащий область E3, лигировали к другому продукту ПЦР плазмидного каркаса с помощью сборки Gibson для создания промежуточной плазмиды pKan-Ad7HpaI. Для удобства использования рестрикционной сборки для обозначения метода клонирования плазмид комбинированного рестрикционного разложения и сборки. С помощью рестрикционной сборки гены E3 в pKan-Ad7HpaI были заменены на кассету для экспрессии зеленого флуоресцентного белка (GFP), а модифицированная область E3 была высвобождена из промежуточной плазмиды и восстановлена в инфицированном клоне для генерации аденовирусной плазмиды pKAd7-E3GFP. Наконец, pKAd7-E3GFP линеаризовали с помощью расщепления Pme I и использовали для трансфекции упаковочных клеток HEK293 для спасения рекомбинантного вируса HAdV-7. В заключение следует отметить, что здесь была представлена стратегия, основанная на сборке ДНК, для конструирования аденовирусных векторов в общих лабораториях молекулярной биологии без необходимости использования специализированных материалов и инструментов.

Введение

За последние три десятилетия рекомбинантные аденовирусные векторы широко использовались в разработке вакцин и генной терапии 1,2,3,4, а также в фундаментальных исследованиях благодаря своим выдающимся биологическим свойствам, таким как высокая эффективность генной трансдукции, неинтеграция с геномом хозяина, манипулятивный вирусный геном и простота широкомасштабного производства.

В настоящее время наиболее часто используемые аденовирусные векторы конструируются на основе аденовируса человека 5 (HAdV-5)5,6. Несмотря на то, что вектор-опосредованная трансдукция HAdV-5 дает обнадеживающие результаты, доклинические и клинические применения выявили ряд недостатков (например, высокий уровень ранее существовавшего антивекторного иммунитета в человеческой популяции и низкую эффективность трансдукции в клетках, лишенных вируса Коксаки и аденовирусного рецептора (CAR)). Чтобы обойти эти проблемы, существует большой интерес к созданию векторов на основе других типов аденовирусов человека или млекопитающих 3,7,8.

До сих пор самым популярным методом построения аденовирусного вектора является гомологичная рекомбинация у бактерий5. Такие штаммы бактерий должны экспрессировать рекомбиназы, которые могут влиять на стабильность или амплификацию плазмид, которые они несут. Некоторые сорта даже коммерчески недоступны. В последнее время методы, основанные на других принципах, включая бактериальные искусственные хромосомы, прямое клонирование или прямую сборку ДНК, были использованы для получения инфицированных клонов аденовируса или рекомбинантных аденовирусных векторов 9,10,11,12. Однако эти методы несколько недружелюбны к исследователям с небольшим опытом работы в этой области.

В 2018 году процесс конструирования инфекционного клона аденовируса упрощается в лабораторных условиях за счет прямого лигирования генома вируса с продуктом ПЦР, несущим плазмидный каркас, через сборкуГибсона 13. После этого методы рестрикционного расщепления и сборки Гибсона объединяют для загрузки трансгенов в существующие аденовирусные плазмиды 14,15,16,17,18. Для удобства термин «рестрикционная сборка» используется в дальнейшем для обозначения способа комбинированного расщепления фермента рестрикции и сборки Гибсона. Были дополнительно разработаны стратегии конструирования аденовирусных векторов из инфицированных клонов с использованием рестрикционной сборки19. Суть рестрикции-сборки заключается в том, чтобы включить в реакцию сборки ДНК как можно больше фрагментов, вырезанных из плазмид, в то время как короткие продукты ПЦР служат линкерами или патчами для модификации плазмид. При этом количество включаемых фрагментов держится на минимальном уровне. Такие усилия отражают отдачу; возможность нежелательных мутаций, вызванных ПЦР или сборкой ДНК, может быть сведена к минимуму, а вероятность успеха может быть повышена. В заключение можно сказать, что в лаборатории налажен конвейер от аденовируса дикого типа к аденовирусному вектору 13,14,15,16,17,18,19.

В данной статье мы попытаемся представить эти методы, приведя примеры конструирования инфекционного клона HAdV-7 и вектора HAdV-7, удаленного с помощью E3-удаленной репликации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Аденовирусы классифицируются как уровень биобезопасности 2 (BSL-2); Все шаги по использованию вирусов проводились в лаборатории уровня биобезопасности 2. HAdV-7 дикого типа был выделен в 2017 году из образца насоглотки 10-месячного младенца, который был госпитализирован с инфекцией острых дыхательных путей в Пекинскую детскую больницуNo 20. Запасы вируса хранились при температуре -80 °С.

1. Экстракция геномной ДНК HAdV-7

  1. Семена 2,0 x 106 клеток HEK293 в одной колбе Т-25, содержащей 5 мл модифицированной среды Eagle's Medium (DMEM) от Dulbecco, плюс 10% фетальная бычья сыворотка (FBS) и культуре при 37 °C во влажной атмосфере с добавлением 5%CO2. Клетки должны быть на 80-90% слитыми и готовыми к инфекции через 18-24 ч.
  2. Инокулируйте клетки HAdV-7 дикого типа в течение 2 ч. Удалите вируссодержащую среду путем аспирации и добавьте в клетки 5 мл свежего DMEM, содержащего 2% FBS.
  3. Извлечение вирусной геномной ДНК с помощью модифицированного метода Хирта21
    1. Через 2-3 дня после заражения, когда цитопатический эффект (ЦПЭ) наблюдается на 50-90% клеток, откажитесь от надосадочной жидкости культуры и прополощите клетки фосфатно-солевым буфером (PBS).
      Цитопатический эффект (CPE) определяется как явление, при котором инфицированные вирусом клетки округляются, набухают и свободно прикрепляются или отделяются от колбы с культурой в виноградообразные кластеры22.
    2. Лизируйте клетки в колбе в 1,0 мл лизисного буфера, содержащего 25 мМ Tris-HCl, 0,5 мМ ЭДТА, 50 мкг/мл протеазы K и 0,8% SDS (pH7,6) в течение 5 мин на льду. Переложите лизат в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и инкубируйте пробирку на водяной бане при температуре 50 °C в течение 30 минут.
    3. Добавьте в пробирку 120 мкл буфера для осаждения. Поместите тюбик на лед еще на 30 минут после осторожного перемешивания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер осадков состоит из 3 М CsCl, 1 М ацетата калия и 0,67 М уксусной кислоты. Он поможет осаждать клеточный мусор и клеточную хромосомную ДНК после центрифугирования, сохраняя при этом геном вируса в надосадочной жидкости.
    4. Центрифугируйте пробирку в течение 25 мин при 15 000 x g при 4 °C, а затем перенесите надосадочную жидкость (около 1,1 мл) в полипропиленовую пробирку объемом 15 мл.
    5. Добавьте в пробирку 2,2 мл ледяного абсолютного этанола. Аккуратно перемешайте и дайте тюбику постоять на льду в течение 15 минут. Центрифуга в течение 5 мин при 2000 х г при комнатной температуре.
    6. Тщательно отасканируйте надосадочную жидкость и промойте осадок (геномную ДНК вируса) один раз 800 мкл 70% этанола. Центрифугируйте пробирку в течение 6 мин при 15 000 x g при комнатной температуре. Выбросьте надосадочную жидкость и высушите на воздухе гранулу ДНК на дне. Не пересушивайте гранулу ДНК, так как это может затруднить повторное растворение.
    7. Растворите гранулу в 200 мкл TE буфера (10 мМ Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 мМ ЭДТА), добавьте 1 мкл РНКазы А (10 мг/мл) и инкубируйте пробирку при 37 °C в течение 15 минут. Очистите растворенную ДНК с помощью коммерческого набора для очистки и концентратора геномной ДНК (см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количественно оцените вирусную геномную ДНК с помощью широко используемого метода в лаборатории. Как правило, 1-5 г геномной ДНК может быть получено в колбе Т-25 с клетками HEK293, инфицированными аденовирусом.

2. Конструирование инфекционного клона HAdV-7 методом сборки ДНК

  1. Разработайте праймеры для ПЦР для амплификации плазмидного остова (Рисунок 1). Добавьте перекрывающиеся последовательности, необходимые для сборки ДНК, к 5'-концам ПЦР-праймеров. Кроме того, включите сайты рестрикции, не относящиеся к каттеру (например, сайт Pme I) на обоих концах генома HAdV-7, чтобы помочь высвободить вирусный геном из инфицированного клона.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Плазмидный каркас, содержащий устойчивый к антибиотикам ген и источник репликации, амплифицируется с помощью ПЦР и сливается с геномом HAdV-7. Аденовирусы могут быть спасены от упаковки клеток с более высокой эффективностью, если вместо кольцевой аденовирусной плазмиды используется линеаризованный геном вируса. После рассмотрения вышеупомянутых факторов праймеры проектируются, как показано на рисунке 1.
  2. Проводят ПЦР для амплификации фрагмента (Kan-Ori), содержащего ген устойчивости к канамицину (Kan) и происхождение pBR322 (Ori), используя pShuttle-CMV в качестве матрицы с праймерами Ad7KanF1 и Ad7KanR1 (таблица S1). Реакцию ПЦР установите следующим образом: один цикл при 98 °C в течение 30 с, затем пять циклов денатурации при 98 °C в течение 8 с, отжиг при 68 °C в течение 30 с, удлинение при 72 °C в течение 90 с и, наконец, 25 циклов денатурации при 98 °C в течение 8 с, отжиг и удлинение при 72 °C в течение 2 мин.
  3. Запустите продукт ПЦР в 1% агарозном геле с помощью электрофореза и очистите фрагмент с помощью коммерческого набора для восстановления геля ДНК.
  4. Добавьте восстановленную Кан-Ори и вирусную геномную ДНК HAdV-7 в коммерческую смесь DNA Assembly Master Mix. Настроена реакция сборки в общем объеме 20 мкл и молярном соотношении вектора к вирусной геномной ДНК 1:2. Выдерживать при температуре 50 °C в течение 1 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Установите реакцию в общем объеме 20 мкл с 1-3 μл вектора, 7-9 μл вирусной геномной ДНК и 10 μл ДНК Assembly Master Mix.
  5. Преобразуйте химически компетентные клетки TOP10 штамма E. coli с 10 мкл сборочного продукта с помощью теплового шока. Распределите смесь для трансформации на содержащие канамицин (50 мкг/мл) пластины Лурии-Бертани (LB-Kan). Инкубируйте планшеты при температуре 37 °C не менее 12 часов.
  6. Инокулируйте не менее трех клонов каждый в 5 мл среды LB-Kan при 37 °C в течение 12 ч с легким встряхиванием (200-250 об/мин). Извлеките плазмидную ДНК с помощью коммерческого набора Plasmid Miniprep Kit.
  7. Расщепляют плазмиду с помощью эндонуклеазы рестрикции, а затем проверяют размер фрагментов ДНК с помощью электрофореза в агарозном геле (рис. 2А). Более того, подтвердите сайты слияния с помощью секвенирования. Правильная сборочная плазмида называется pKan-Ad7.
  8. Вырастите культуру бактерий объемом 100 мл из правильного клона. Извлеките препарат макси-плазмиды с помощью коммерческого набора Plasmid Maxprep Kit.

3. Построение и модификация промежуточной плазмиды in silico

ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, промежуточная плазмида должна быть сконструирована, и ключевым шагом является то, как построить идеальную промежуточную плазмиду. Программное обеспечение для анализа ДНК с модулем фермента рестрикции, такое как pDRAW32 (бесплатное программное обеспечение, доступное по адресу www.acaclone.com), необходимо для создания промежуточной плазмиды.

  1. Импортируйте последовательность ДНК pKan-Ad7 в pDRAW32, чтобы нарисовать плазмидную карту. Аннотируйте интересующие регионы на карте. Для областей pKan-Ad7 были аннотированы регионы E1, E3 и плазмидный остов (Kan-Ori).
  2. Работа с программой pDRAW32. Сначала нажмите «Настройки» > «Выбор ферментов », а затем нажмите «Минимальные/максимальные разрезы». Введите 1 в поле Min и введите 2 в поле Max, и поставьте галочку перед всем последовательностью. Наконец, нажмите OK , чтобы отобразить на карте уникальные участки ферментов рестрикции с двойным резаком.
    Примечание: Как правило, выбираются только ферменты рестрикции, которые распознают последовательность в 6.о. или более. Как показано на рисунке 3А, 17 ферментов соответствуют критериям выбора ферментов.
  3. Рассмотрим первый участок ограничения, который находится по бокам от региона E3, поскольку E3 планируется изменить. Hpa I, Sal I, Avr II-Mlu I и Spe I удовлетворяли требованию.
    Примечание: Для этого эксперимента был выбран Hpa I, потому что расщепление pKan-Ad7 с его помощью позволило бы получить самый короткий фрагмент, несущий область E3, а меньшая промежуточная плазмида облегчила бы будущую модификацию. Выбор сайтов Sal I также имеет преимущества – такая промежуточная плазмида подходит для модификации как Е1, так и Е3 областей (рисунок S1).
  4. Создайте окончательный файл последовательности, отображающий обе нити ДНК промежуточной плазмиды pKan-Ad7HpaI. Эту виртуальную последовательность можно использовать в качестве шаблона для проектирования перекрывающихся грунтовок.
    1. Скопируйте последовательность между двумя сайтами ограничения Hpa I, включая область E3. Для последующей сборки необходимо скопировать каждую последовательность ~20.о. (Tm, равную или превышающую 48°C) за пределы сайта ограничения Hpa I (рисунок 3C, перекрытие-Final 1 и перекрытие-Final2).
    2. Добавьте последовательность распознавания Pme I (рис. 3C, gtttaaac) на обоих концах вышеуказанной последовательности.
    3. Добавьте последовательность основной плазмиды, содержащей устойчивый к антибиотикам ген, и источник репликации (рисунок 3C, Кан-Ори) за пределами сайта рестрикции Pme I.
    4. Импортируйте окончательную последовательность в pDRAW32, чтобы нарисовать карту плазмид. Аннотируйте регион E3 на карте.
    5. Работа с программой pDRAW32. Сначала нажмите «Настройки» > «Выбор ферментов », а затем нажмите «Минимальные/максимальные разрезы». Введите 1 в поля Мин и Макс и поставьте галочку перед всем полем. В последний раз нажмите OK , чтобы отобразить на карте уникальные сайты ферментов рестрикции. Видно, что для модификации Е3 доступно множество уникальных резцов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого эксперимента BstZ17 I и Mlu I выбраны для замены частичного E3. Двойной резак также может быть полезен. Например, двойной резак Ssp I вместе с уникальным резаком BssH II может быть выбран для замены всего региона E3 с помощью ПЦР с расширением перекрытия.
  5. Проектирование грунтовок с использованием виртуальной последовательности в качестве шаблона для построения промежуточной плазмиды (рисунок 3C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для сокращения длины каждой грунтовки были разработаны четыре грунтовки. Продукт ПЦР, который амплифицируют праймерами Ad7HpaIF1 и Ad7HpaIR1, будет использован в качестве матрицы для получения конечного фрагмента ПЦР с праймерами Ad7HpaIF2 и Ad7HpaIR2 (рисунок 3C).

4. Спасение инфекционного рекомбинантного аденовируса в клетках HEK293

ПРИМЕЧАНИЕ: Все три аденовируса, сгенерированные в этой статье, спасены в соответствии со следующим протоколом.

  1. Расщепляют 10 мкг рекомбинантной аденовирусной плазмиды с 2 мкл Pme I в течение 5 ч при 37 °C в общем объеме 100 мкл для линеаризации плазмиды. Проверьте 1 мкл расщепленной ДНК на 0,8% агарозном геле. В результате расщепления должен быть получен фрагмент аденовирусного генома размером ~34 кб и плазмидный остов Кан-Ори размером ~2,5 кб.
  2. Очистите остаточную линеаризованную аденовирусную плазмиду с помощью набора для очистки и концентратора геномной ДНК.
  3. Культивировать клетки HEK293 в DMEM плюс 10% FBS. Посейте клетки HEK293 (2 x 106 клеток) в колбу Т-25 за 1 день до трансфекции так, чтобы на следующий день они достигли 70%-80% конфекции. Используйте 5 г адденовирусной плазмиды Pme I для трансфекции клеток HEK293 с использованием коммерчески доступных реагентов для трансфекции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Среду трансфицированных клеток следует заменять каждые 3 дня.
  4. Проверяйте клетки каждый день, собирайте клетки и культивируйте среду в полипропиленовую пробирку объемом 15 мл при образовании кометных очагов (рисунок 2B, указывающий на репликацию вируса).
  5. Лизируйте клетки с помощью трех циклов замораживания-размораживания. После центрифугирования в течение 12 мин при 1200 x g при комнатной температуре соберите надосадочную жидкость и храните ее при температуре -80 °C для последующего распространения вируса.
    Примечание: Когда рекомбинантный аденовирус экспрессирует GFP или другие флуоресцентные белки, легче определить, удалось ли спасти вирус, поскольку очаги, образованные флуоресцентными белок-положительными клетками, можно интуитивно наблюдать под флуоресцентным микроскопом.

5. Построение E3-удаленной плазмиды генома HAdV-7

Примечание: Длина генома HAdV-7 составляет 35 239.н., а область E3 расположена между 27 354.о. и 31 057.н. генома. Чтобы сконструировать промежуточную плазмиду, найдите эндонуклеазу с двумя участками разреза на инфекционном клоне плазмиды или две эндонуклеазы с одним участком разреза на плазмиде. Существуют Hpa I, Sal I или Avr II и Mlu I. Последовательность между BstZ17 I (28 312.о.) и Mlu I (30 757.н.) должна быть удалена и заменена кассетой CMV-GFP-PA или кассетой CMV-mCherry-PA.

  1. Расщепите 600 нг pKan-Ad7 с Hpa I. Очистите большой фрагмент pKAd7-HpaI-FL (~30 kb) и малый фрагмент pKAd7-HpaI-FS (~7 kb) соответственно, используя набор для восстановления геля ДНК после электрофореза геля. Храните pKAd7-HpaI-FL при температуре -20 °C.
  2. Амплифицируйте фрагмент, содержащий Kan и Ori, используя pShuttle-CMV в качестве матрицы с праймерами Ad7HpaIF1 и Ad7HpaIR1 (табл. S1) методом ПЦР. Восстановите и разбавьте продукт ПЦР (2541.н.), который будет использоваться в качестве матрицы для второго раунда ПЦР-реакции с целью амплификации Kan-Ori2 праймерами Ad7HpaIF2 и Ad7HpaIR2.
    1. Очистите продукт ПЦР (2584.н.) после растворения в 1% агарозном геле методом электрофореза. Реакцию ПЦР установить следующим образом: один цикл при 98 °C в течение 30 с, затем 30 циклов денатурации при 98 °C в течение 8 с, отжиг и удлинение при 72 °C в течение 2 мин.
      Примечание: Центральной частью Kan-Ori2 является фрагмент, содержащий Kan и Ori, за которым следуют последовательности уникальной эндонуклеазы рестрикции, которая отсутствует в малом фрагменте pKAd7-HpaI-FS (например, Pme I), и перекрывающаяся область с большим фрагментом pKAd7-HpaI-FL; самая внешняя последовательность представляет собой перекрывающуюся область с небольшим фрагментом pKAd7-HpaI-FS.
  3. Добавьте продукт ПЦР Kan-Ori2 и восстановленный pKAd7-HpaI-FS на шаге 5.1 в DNA Assembly Master Mix. Выдерживать при температуре 50 °C в течение 1 ч. Выполните шаги 2.4-2.6. Правильная плазмида называется pKan-Ad7HpaI (~10 kb).
  4. Амплифицируйте фрагмент CMV-GFP-PA (~1,7 kb), содержащий промотор CMV, GFP CDS и полиA сигнал (PA) SV40, используя pShuttle-GFP23 в качестве матрицы с праймерами Ad7E3GFPF1 и Ad7E3GFPR1 (таблица S1). Очистите продукт ПЦР (1650.н.) после растворения в 1% агарозном геле методом электрофореза.
    Примечание: Перекрывающиеся области, которые могут быть собраны с помощью BstZ17 I и Mlu I расщепленного pKan-Ad7HpaI, должны быть включены в праймеры, а уникальный сайт рестрикции (например, Sbf I), который отсутствует в плазмиде pKan-Ad7, должен быть добавлен в праймеры для дальнейшей сборки рестрикции.
  5. Расщепите 300 нг pKan-Ad7HpaI с BstZ17 I и Mlu I. Очистите фрагмент 7,3 kb (большая часть областей E3 удаляется) после растворения в 1% агарозном геле с помощью электрофореза. Добавьте восстановленный фрагмент размером 7,3 кб и восстановленный фрагмент CMV-GFP-PA (~1,6 кб) в мастер-микс для сборки ДНК. Выполните шаги 2.4-2.6. Правильная плазмида называется pKAd7-E3GFP (~9 kb).
    Примечание: Все последовательности между BstZ17 I и Mlu I относятся к области E3.
  6. Расщепите 300 нг pKAd7-HE3GFP с Pme I. Очистите большой фрагмент (~6,4 kb) с помощью набора для восстановления геля ДНК после гель-электрофореза. Добавьте очищенный фрагмент и восстановленный на шаге 5.1 pKAd7-HpaI-FL в мастер-смесь для сборки ДНК. Выдерживать при температуре 50 °C в течение 1 ч. Выполните шаги 2.4-2.6. Правильная плазмида называется pKAd7-E3GFP.
  7. Трансфектируйте клетки HEK293 с линеаризованными pKAd7-E3GFP Pme I, как описано в разделе 3. Спасенный аденовирус получил название Ad7-E3GFP.
  8. Амплифицируйте фрагмент CMV-mCherry-PA (~1,6 kb), содержащий промотор CMV, mCherry CDS и сигнал SV40 polyA, используя pKFAV4-CX19A в качестве матрицы с праймерами Ad7E3CHEF1 и Ad7E3CHER1. Очистите продукт ПЦР после растворения в 1% агарозном геле методом электрофореза.
  9. Переварить 600 нг pKAd7-E3GFP с Sbf I, и очистить фрагмент от ~35 кб. Добавьте фрагмент размером 35 кб и восстановленный фрагмент CMV-mCherry-PA в DNA Assembly Master Mix. Выдерживать при температуре 50 °C в течение 1 ч. Выполните шаги 2.4-2.6. Правильная плазмида называется pKAd7-E3CHE.
  10. Трансфектируйте клетки HEK293 с линеаризованными pME I-линеаризованными pKAd7-E3CHE, как описано в разделе 3. Спасенный аденовирус получил название Ad7-E3CHE.

6. Амплификация и очистка рекомбинантного аденовируса в клетках HEK293

  1. Инокулируйте 80%-90% сливающийся монослой клеток HEK293, выращенных в восьми чашках для культур диаметром 150 мм, обработанных ТС, аденовирусом. Инкубировать при 37 °C в течение 2 ч при слабом перемешивании. Замените надосадочную жидкость 25 мл DMEM, содержащей 2% FBS.
  2. Инкубируйте клетки при температуре 37 °C в течение 2-3 дней.
    1. Откажитесь от большей части надосадочной жидкости из восьми чашек диаметром 150 мм, когда CPE поражает большинство клеток. Соберите инфицированные клетки с помощью клеточных лифтеров с конечным объемом элюирования ~6,0 мл в полипропиленовые пробирки объемом 15 мл.
    2. Нарушьте работу клеток с помощью трех циклов замораживания-оттаивания, чтобы выпустить вирус. Очистите лизат центрифугированием в течение 12 минут при 1200 x g при комнатной температуре. Соберите вируссодержащую надосадочную жидкость.
  3. Добавьте в надосадочную жидкость MgCl2 (0,1 мМ) и бензоназную нуклеазу (50 ЕД/мл). Осторожно перемешайте в течение 40 минут при температуре 37 °C. Добавьте NaCl (600 мМ) в надосадочную жидкость и осторожно делайте вихрь еще 40 минут при температуре 37 °C. Центрифуга в течение 12 мин при 1200 х г при комнатной температуре. Соберите вирусосодержащий надосадочный слой для очищения.
  4. Приготовьте хлорид цезия (CsCl) с различными концентрациями 1,35 г/мл, 1,30 г/мл и 1,25 г/мл с 10 мМ Tris-HCl.
    1. Добавьте 0,8 мл раствора CsCl 1,35 г/мл на дно пробирки Ultra-Clear объемом 5,1 мл с помощью пипетки, а затем медленно добавьте 0,8 мл раствора CsCl 1,30 г/мл и 0,8 мл раствора CsCl 1,25 г/мл поверх первого раствора последовательно.
    2. Наконец, осторожно нанесите ~2,5 мл надосадочной жидкости, собранной на шаге 6.3, поверх 1,25 г/мл раствора CsCl и заполните пробирку на расстоянии 2-3 мм от верха, используя 10 мМ Tris-HCl.
  5. Центрифуга в течение 2 ч при 200 000 x g и 8 °C в роторе с качающимся ковшом с медленным ускорением и замедлением для отделения неповрежденных вирусных частиц от дефектных.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После центрифугирования в растворе CsCl можно четко увидеть несколько белых полос.
  6. Осторожно удалите полосы пустых частиц и слой клеточного мусора с помощью пипетки, а самую нижнюю полосу, содержащую зрелый вирус, соберите с помощью шприца объемом 2 мл.
  7. Собранную вирусную суспензию перенесите в диализную кассету 20 K MWCO и диализируйте в диализном буфере, содержащем 10 мМ Tris-HCl, 150 мМ NaCl, 1 мМ MgCl2 и 2% глицерина (pH 8,0) в течение ночи при 4 °C.
    1. На следующий день замените диализный буфер, содержащий 10 мМ Tris-Cl, 150 мМ NaCl, 1 мМ MgCl2 и 5% глицерина (pH 8,0), и диализируйте 5 ч при 4 °C.
    2. Соберите диализованные частицы вируса с помощью шприца объемом 2 мл. Приготовьте несколько аликвот желаемых небольших объемов (20-200 мкл) и храните очищенный вирус при температуре -80 °C.
      Титр частиц очищенного вируса может быть определен путем измерения содержания геномной ДНК, а титр инфекционности может быть определен на клетках HEK293 путем подсчета GFP-положительных клеток с помощью анализа на предельное разбавление.

7. Идентификация генома рекомбинантного аденовируса методом расщепления фермента рестрикции

  1. Инфицируйте 80%-90% сливающийся монослой клеток HEK293, выращенных в одной колбе T-25, рекомбинантным аденовирусом. Выдерживать в течение 2 ч при температуре 37 °C. Замените питательную среду свежей DMEM, содержащей 2% FBS.
  2. Удалите надосадочную жидкость культуры и экстрагируйте вирусную геномную ДНК модифицированным методом Хирта, описанным в шаге 1.3, когда ЦПЭ возникает в течение 2-3 дней.
  3. Расщепляют геномную ДНК рекомбинантного аденовируса указанными ферментами, а анализ проводят на электрофорезе в агарозном геле. В качестве контроля использовалась рекомбинантная аденовирусная плазмида.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Стратегия построения инфекционного клона HAdV-7 показана на рисунках 1 и 2. Два инфекционных клона-плазмиды были выбраны случайным образом и идентифицированы с помощью BstZ17 I, BamH I и EcoR V соответственно. Результаты показали, что фрагменты соответствовали ожидаемому размеру (рис. 2A), что указывает на то, что плазмиды были сконструированы правильно. Кометные очаги можно было увидеть в клетках через 12 дней после того, как линеа...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Различные аденовирусы имеют различный тканевой тропизм, и распространенность ранее существовавшего иммунитета хозяина против различных аденовирусов может интенсивно колебаться улюдей24, что привлекает интерес к созданию новых аденовирусных векторов для генной терапии или разработки вакцин. Тем не менее, создание новой системы аденовирусных векторов остается обременительным для генерических лабораторий молекулярной биологии.

Здесь мы пре...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Это исследование финансировалось Пекинским фондом естественных наук (7204258), Национальным фондом естественных наук Китая (82161138001, 82072266), Инновационным фондом медицинских наук CAMS (2019-I2M-5-026), а также исследованиями и приложениями по молекулярному отслеживанию основных респираторных патогенов в Пекине Специальным фондом развития и исследований в области здравоохранения (2021-1G-3012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1,5 мл полипропиленовая микроцентрифуга ПробиркаAxygenMCT-150-CХранение вируса
15 мл полипропиленовая центрифуга ПробиркиCorning430790Хранение вируса
150 мм Чашки для культур, обработанных TCCorning430599Рост клеток HEK29E
20 K Кассета для диализа MWCOThermoFisher Scientific66005Диализ вируса
Уксусная кислотаAmresco714Экстракция ДНК
Afl IINEBR0520Расщепление
АгарозаTakara5260Электрофорез
Возраст INEBR0552Разложение
Asc INEBR0558Разложение
BamH INEBR0136Разложение
Бензоназа НуклеазаSigmaE8263-25KUОчистка от вируса
BsrG INEBR0575Digestion
Cell lifterCorning3008Соскребите клетки 
CsClSigmaC3032Набор
для восстановления гелемвируса ZymoD4045Восстановление ДНК
Dulbecco' s модифицированный Eagle' s среда (DMEM)CytivaSH30022.01HEK293 клетки среда
E.coli ТОП10 компетентных клетокTIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD.CB-104Трансформация сборочного продукта
EcoR VNEBR3195Разложение
EDTAThermo Fisher ScientificR3104Экстракция ДНК
Фетальная бычья сыворотка (FBS)ЦитиваSV30208.02HEK293 Культура клеток
Геномная ДНК Очистка и концентраторZymoD4065Очистка ДНК
Shanghai Macklin Biochemical Co., LtdG810575Диализ клеток вируса
HEK293ATCCCRL-1573Амплификация
вируса Высокоточная ДНК-полимеразаNEBM0491ПЦР
Hind IIINEBR3104Расщепление
Канамицина сульфатаAmresco408Селекция плазмиды
Kpn INEBR3142Пищеварение
Лямбда/HindIII ДНК-маркерTakara3403Электрофорез
LB бульонBD240230LB тарелка для бактерий
LB средаSolarbio Life ScienceL1010Среда для бактерий
MgCl2Sigma63068Диализ вируса
МикроцентрифугаThermo Fisher ScientificSorvall Legend Micro 21RЭкстракция ДНК
NaClSigmaS5886Диализ вируса
Nde INEBR0111Разложение
NEBuilder HiFi Сборка ДНК Мастер-миксNEBE2621Сборка ДНК
Nhe INEBR0131Разложение
Фосфат Буферизованный Физиологический растворЦитиваSH30256.01Промывка клеток
ПипеткаThermo Fisher ScientificMatrixс аспирацией среды
Plasmid Maxprep KitVigorous Biotechnology Beijing Co., Ltd.N001Набор для экстракции
плазмидДНК TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD.DP103Экстракция ДНК
Pme INEBR0560Расщепление
ацетата калияAmresco698Экстракция ДНК
протеазыK Thermo Fisher ScientificAM2542Экстракция ДНК
pShuttle-CMVСтратагена240007ПЦР-матрицы
РНКазаBeyotimeD7089Экстракция ДНК
Sal INEBR0138Разложение
Sbf INEBR3642Разложение
SDSAmresco227Экстракция ДНК
Ротор с качающимся ведромHITACHIS52STОчистка вируса
T-25 Клеточная колбаCorning430639Рост клеток HEK29E
Клеточная колба T-75Corning430641Выращивание клеток HEK29E
Трансфекционный реагентPolyplus-transfection114-15Трансфекция
Просвечивающий электронный микроскопFEITECNAI 12Исследование вируса
Tris-HClAmresco234Диализ вируса
УльтрацентрифугаHITACHIHimac CS120GXIIОчистка вируса
для очистки ДНК

Ссылки

  1. Lasaro, M. O., Ertl, H. C. New insights on adenovirus as vaccine vectors. Molecular Therapy. 17 (8), 1333-1339 (2009).
  2. Fuchs, J. D., et al. Safety and immunogenicity of a recombinant adenovirus serotype 35-Vectored HIV-1 vaccine in adenovirus serotype 5 seronegative and seropositive individuals. Journal of AIDS & Clinical Research. 6 (5), (2015).
  3. Milligan, I. D., et al. Safety and immunogenicity of novel adenovirus type 26- and modified vaccinia ankara-vectored ebola vaccines: a randomized clinical trial. JAMA. 315 (15), 1610-1623 (2016).
  4. Zhu, F. C., et al. Safety, tolerability, and immunogenicity of a recombinant adenovirus type-5 vectored COVID-19 vaccine: a dose-escalation, open-label, non-randomised, first-in-human trial. Lancet. 395 (10240), 1845-1854 (2020).
  5. He, T. C., et al. A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2509-2514 (1998).
  6. Danthinne, X., Imperiale, M. J. Production of first generation adenovirus vectors: a review. Gene Therapy. 7 (20), 1707-1714 (2000).
  7. Guo, X., et al. Systemic and mucosal immunity in mice elicited by a single immunization with human adenovirus type 5 or 41 vector-based vaccines carrying the spike protein of Middle East respiratory syndrome coronavirus. Immunology. 145 (4), 476-484 (2015).
  8. Folegatti, P. M., et al. Safety and immunogenicity of the ChAdOx1 nCoV-19 vaccine against SARS-CoV-2: a preliminary report of a phase 1/2, single-blind, randomised controlled trial. Lancet. 396 (10249), 467-478 (2020).
  9. Jang, Y., Bunz, F. AdenoBuilder: A platform for the modular assembly of recombinant adenoviruses. STAR Protocols. 3 (1), 101123(2022).
  10. Zhou, X., Sena-Esteves, M., Gao, G. Construction of recombinant adenovirus genomes by direct cloning. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (5), (2019).
  11. Ruzsics, Z., Lemnitzer, F., Thirion, C. Engineering adenovirus genome by bacterial artificial chromosome (BAC) technology. Methods in Molecular Biology. 1089, 143-158 (2014).
  12. Zhou, D., et al. An efficient method of directly cloning chimpanzee adenovirus as a vaccine vector. Nature Protocols. 5 (11), 1775-1785 (2010).
  13. Zou, X. H., et al. DNA assembly technique simplifies the construction of infectious clone of fowl adenovirus. Journal of Virological Methods. 257, 85-92 (2018).
  14. Guo, X., et al. Site-directed modification of adenoviral vector with combined DNA assembly and restriction-ligation cloning. Journal of Biotechnology. 307, 193-201 (2020).
  15. Liu, H., et al. Single plasmid-based, upgradable, and backward-compatible adenoviral vector systems. Human Gene Therapy. 30 (6), 777-791 (2019).
  16. Yan, B., et al. User-friendly reverse genetics system for modification of the right end of fowl adenovirus 4 genome. Viruses. 12 (3), 301(2020).
  17. Zhang, W., et al. Fiber modifications enable fowl adenovirus 4 vectors to transduce human cells. Journal of Gene Medicine. 23 (10), 3368(2021).
  18. Zou, X., et al. Fiber1, but not fiber2, is the essential fiber gene for fowl adenovirus 4 (FAdV-4). Journal of General Virology. 102 (3), 001559(2021).
  19. Guo, X., et al. Restriction-assembly: a solution to construct novel adenovirus vector. Viruses. 14 (3), 546(2022).
  20. Duan, Y., et al. Genetic analysis of human adenovirus type 7 strains circulating in different parts of China. Virologica Sinica. 36 (3), 382-392 (2021).
  21. Arad, U. Modified Hirt procedure for rapid purification of extrachromosomal DNA from mammalian cells. Biotechniques. 24 (5), 760-762 (1998).
  22. Knipe, D. M. H. P. M. Fields' Virology. 2, 1733(2013).
  23. Liu, H. Y., Han, B. J., Zhong, Y. X., Lu, Z. Z. A three-plasmid system for construction of armed oncolytic adenovirus. Journal of Virological Methods. 162 (1-2), 8-13 (2009).
  24. Mennechet, F. J. D., et al. A review of 65 years of human adenovirus seroprevalence. Expert Review of Vaccines. 18 (6), 597-613 (2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

HAdV 7HEK293
Видео скоро будет доступно
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.