Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Создание органоидов сетчатки, полученных из ИПСК у пациента, для моделирования пигментного ретинита

2.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/64045

⸱

16 июня 2022 г.

 ,  , 
1Beijing Tongren Hospital, Beijing Institute of Ophthalmology, Beijing Ophthalmology & Visual Science Key Laboratory, Beijing Tongren Eye Center, Capital Medical University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В этом протоколе у пациентов с пигментным ретинитом были созданы 3D-органоиды сетчатки, полученные из плюрипотентных стволовых клеток (iPSC). Эти органоиды успешно повторили некоторые клинические фенотипы пигментного ретинита.

Аннотация

Пигментный ретинит (РП) является редким наследственным дегенеративным заболеванием сетчатки с распространенностью около 1/4000 человек во всем мире. У большинства пациентов с РП наблюдается прогрессирующая дегенерация фоторецепторов, приводящая к потере периферического зрения, ночной слепоте и, наконец, полной слепоте. На сегодняшний день сообщалось о тысячах мутаций в более чем 90 генах, связанных с РП. В настоящее время существует несколько животных моделей для всех пораженных генов и различных типов мутаций, что в значительной степени затрудняет расшифровку механизмов, лежащих в основе патологии генов/мутаций, и ограничивает лечение и разработку лекарств. Индуцированные пациентами 3D-органоиды сетчатки (РО), полученные из плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), обеспечили лучшую систему для моделирования раннего начала заболевания человека, чем клетки и животные. Для изучения РП эти полученные от пациента 3D-органоиды сетчатки были использованы для повторения клинических фенотипов РП. В РО РП, полученных от пациентов, отчетливо проявлялась неправильная локализация родопсина. По сравнению с другими животными моделями, модели органоидов сетчатки пациента, полученные из iPSC, более точно повторяют особенности RP и представляют собой идеальный подход к исследованию патогенеза заболевания и разработке лекарств.

Введение

Заболевания сетчатки человека, такие как пигментный ретинит и возрастная макулярная дегенерация, плохо изучены из-за отсутствия соответствующих экспериментальных моделей 1,2. Хотя сетчатка мыши очень похожа на сетчатку человека и является мощным инструментом для изучения этиологии дегенерации сетчатки, существуют огромные видовые различия между мышамии людьми. Например, ядерная архитектура фоторецепторных клеток у мышей и человека отличается, а сетчатка мышей не обладает макулой 5,6. Технология индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) позволяет нам возвращать специализированные клетки организмов в исходное плюрипотентное состояние посредством процессов «перепрограммирования» комбинацией транскрипционных факторов и/или соединений 7,8,9,10. Эти иПСК обладают почти неограниченной способностью к делению и пролиферации и могут развиваться в различные типы клеток. В последнее время были разработаны трехмерные органоиды сетчатки, полученные из ИПСК для моделирования ранних событий развития сетчатки человека и определения патофизиологии заболеваний сетчатки человека 11,12,13,14,15. Органоиды сетчатки имеют много преимуществ: (1) они могут быть использованы для повторения in vivo развития сетчатки и патогенеза заболевания; (2) они могут быть использованы для высокопроизводительного скрининга лекарственных препаратов и доклинических испытаний генной терапии; и (3) они могут быть использованы в качестве доклинической оценки вариантов лечения дегенеративных заболеваний сетчатки16,17.

Одной из целей этого проекта было изучение патогенеза пигментозы сетчатки (РП), заболевания, остающегося неизлечимым из-за своей крайней гетерогенности. На сегодняшний день было идентифицировано более 90 генов, связанных с RP19,20. Ген RPGR, который считается одним из наиболее распространенных генов-возбудителей RP15, составляет примерно 16% всех RP 4,21,22. iPSCs, несущие мутацию сдвига рамки считывания в гене RPGR, были успешно сгенерированы и дифференцированы в организованные и стратифицированные 3D органоиды сетчатки14. При использовании этих органоидов наблюдалась аномальная морфология слоя фоторецепторов и дислокация опсинов в фоторецепторах.

В целом, здесь подробно описан пошаговый и доступный протокол о том, как получить полученные от пациента 3D-органоиды сетчатки23,24. Эти органоиды успешно повторили некоторые клинические фенотипы заболевания. Это обеспечивает обнадеживающую модель для изучения развития сетчатки и механизмов заболевания, для терапевтического скрининга и оценки будущей доклинической генной терапии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Протокол соответствует рекомендациям комитета по этике исследований человека Столичного медицинского университета.

1. Культивирование клеток и генерация ИПСК

  1. Выберите пациентов RPGR для участия в этом исследовании. Здесь были использованы три пациента, один семейный носитель и три здоровых человека из контрольной группы. Пациент 1 обладал мутацией c.1685_1686delAT в экзоне 14 гена RPGR, пациент 2 имел мутацию c.2234_2235delGA в экзоне 15 гена RPGR, а пациент 3 имел c.2403_2404delAG мутации в экзоне 15 гена RPGR. Выберите трех здоровых добровольцев в качестве контрольнойгруппы 14. Соберите образцы периферической цельной крови у пациентов и здоровых контрольных групп с помощью венепункции и поместите их в пробирки для сбора крови (Таблица материалов).
  2. Выделение мононуклеарных клеток периферической крови (ПМЦ) методом центрифугирования с градиентом плотности в среде с градиентом плотности25. Расширяйте CD34+ PBMCs, активированные цитокином, в 8 мл среды для усиления роста (табл. 1) в чашке Петри.
  3. Через 1 неделю электропорируют CD34-положительные мононуклеарные клетки периферической крови с помощью трансфекционной системы (Таблица материалов) и выбирают CD34-положительные клетки и встроенную программу T-01 без каких-либо модификаций. Трансфектировать коктейль перепрограммируемых плазмид (2 мкг), которые могут производить человеческие белки OCT4, SOX2, NANOG, LIN28, c-MYC и KLF4.
  4. Засейте трансфицированные клетки в человеческие шестилуночные планшеты, покрытые рекомбинантным белком, в 2 мл DMEM/F12 с добавлением B-27 (1x), N-2 (1x), PD0325901 (0,5 μM), bFGF (100 нг/мл), CHIR99021 (3 μM), HA-100 (10 μM), A-83-01 (0,5 μM) и hLIF (1000 Ед/мл) для поддержания роста iPSCs.
  5. Через 3 недели после трансдукции вручную отоберите колонии ИПСК вручную, затем перенесите их в шестилуночные планшеты и поддерживайте в реагенте В (Table of Materials) для расширения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шестилуночные планшеты должны быть покрыты человеческим рекомбинантным белком витронектином. Раствор витронектина развести в DPBS до конечной концентрации 10 мкг/мл. Добавьте разведенный витронектин в шестилуночные планшеты, обработанные тканевой культурой. Перемешайте посуду, чтобы раствор витронектина равномерно распределился по поверхности шестилуночных планшетов. Инкубируйте планшеты при температуре 37 °C не менее 1 часа.
  6. Убедитесь, что клетки дезагрегированы с помощью 0,5 мМ ЭДТА, когда iPSCs достигают примерно 80%-90% слияния, и что коэффициент расщепления составляет 1:8 или 1:10. В день пассажа добавьте к реагенту В блеббистатин (2,5 мкМ) (табл. 1).
    Примечание: Блеббистатин использовался для стимулирования адгезии клеток и жизнеспособности стволовых клеток, а также для предотвращения апоптоза стволовых клеток. Через 18 ч среду следует освежить реагентом В.

2. Генерация человеческих RO

ПРИМЕЧАНИЕ: ИПСК должны быть диссоциированы, когда ИПСК достигают примерно 80%-90% слияния.

  1. Диссоциацию колоний iPSC человека (hiPSC) с помощью 0,5 мМ ЭДТА при 37 °C в течение 5 мин.
  2. Разделите скопления ИПСК на отдельные клетки с помощью щадящего пипетирования. Подсчитайте клетки для поддержания и вырастите их в реагенте В (Таблица 1).
  3. В день 0 засейте 12 000 клеток/лунку в 96 V-образных конических лунок для реагрегации клеток в 100 мкл дифференцировочной среды (табл. 1).
  4. На 6-й день тщательно отсасывают среду для культивирования клеток и добавляют 100 мкл среды для дифференцировки, содержащей 20 мкМ Y 27632 и 1,5 нМ (55 нг/мл) hBMP4.
  5. На 9-й день замените половину дифференцировочной среды, чтобы поддерживать концентрацию hBMP4 на уровне около 0,75 нМ.
  6. Отбирайте 60 мкл дифференцировочной среды из каждой лунки и добавляйте 60 мкл свежей дифференцировочной среды, содержащей 20 мкМ Y-27632, в каждую лунку.
  7. На 12-й день замените половину среды для дифференцировки свежей средой для дифференцировки до 0,375 нМ hBMP4.
  8. На 18-й день перенесите агрегаты в новую чашку Петри с наконечниками объемом 10 мл и разрежьте каждый агрегат на 2-4 части микрохирургическим ножом под перевернутым микроскопом, чтобы получить больше органоидов.
  9. Переложите агрегаты из одной группы в одну центрифужную пробирку объемом 15 мл. Когда агрегаты осядут на дно трубок, отсасывайте надосадочную жидкость.
  10. Ресуспендируют агрегаты с 1 мл нервной сетчатки (DMEM/F12, 10% фетальной бычьей сыворотки, 1% добавку N-2, 0,5 мкМ ретиноевой кислоты, 0,1 мМ таурина, 1% пенициллин-стрептомицина) и переносят их в антипригарные чашки Петри с 15 мл нейронной среды сетчатки. Положите 10-15 органоидов сетчатки в одну чашку Петри.
  11. Обновляйте питательную среду каждые 5 дней. Храните культуру в темноте, так как ретиноевая кислота чувствительна к свету (рис. 1) и проверьте формирование самоорганизующейся ткани сетчатки человека с помощью инвертированного микроскопа 26,27,28,29.

3. Анализ органоидов сетчатки

  1. Иммунофлуоресцентное окрашивание 3D-сетчатки, полученной из hiPSC
    1. Зафиксировать 3D сетчатку в 1 мл свежего 4% параформальдегида в DPBS на 20 мин при 4 °C. Затем промойте органоиды 1 мл буфера DPBS.
    2. Отмерьте 0,5 г агарозы (Таблица материалов) и смешайте порошок агарозы со 100 мл DPBS в колбе для микроволновой печи. С помощью микроволновой печи растворите агарозу в течение 1-3 минут до полного ее растворения. Дайте агарозному раствору остыть примерно до 40 °C.
    3. Встраиваем их в 2% в DPBS.
    4. Нарежьте образцы на участки толщиной 50 мкм с помощью вибратома. Поместите срезанные срезы на предметные стекла адгезионного микроскопа (Таблица материалов) и храните их при температуре −80 °C.
    5. Разморозьте ломтики в течение 15 минут при комнатной температуре (RT).
    6. Промойте ломтики с помощью DPBS в течение 5 минут и повторите 3 раза.
    7. Используйте 0,5% Triton X-100 в растворе DPBS для пропитывания ломтиков в течение 15 минут при RT.
    8. Удалите раствор для пермеабилизации, промойте ломтики с помощью DPBS в течение 5 минут и повторите 3 раза.
    9. Инкубируйте ломтики с 1% BSA и 0,5% Triton X-100 в DPBS в течение 30 минут при RT.
    10. Инкубируют срезы с антителом против родопсина (1:1000) и антителом против L/M опсина (1:1000), разведенными в 1% BSA и 0,1% Triton X-100 в течение 16 часов при 4 °C.
    11. Промойте ломтики с помощью DPBS в течение 5 минут и повторите 3 раза.
    12. Инкубируйте срезы с ослиным антителом против мышей и кролика (1:500), разведенным в 1% BSA и 0,1% Triton X-100, в течение 1 ч в режиме RT.
    13. Добавьте 30 нМ 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) в DPBS на 15 мин в RT для ядерного окрашивания.
    14. Промойте ломтики с помощью DPBS в течение 5 минут и повторите 5 раз.
    15. Смонтируйте срезы с помощью закладного материала (Table of Materials) и закройте слайды (Table of Materials). Хранить в темной коробке при температуре 4 °C до 4 недель.
  2. Экстракция РНК и секвенирование РНК
    1. Соберите 1-3 (в зависимости от размеров) 3D сетчатки, полученную от каждого контрольного человека и пациента в одни и те же моменты времени дифференцировки (день 0, день 47, день 91, день 121 и день 151) в 1 мл реагента для экстракции РНК (Таблица материалов) на льду.
    2. Используйте гомогенизатор (Таблица материалов) для разрушения образцов, 1 мин ВКЛ, 30 с ВЫКЛ в течение трех циклов, и проверьте образец на разрушение.
    3. Остановите гомогенизацию, когда образцы будут полностью гомогенизированы, и энергично поворачивайте пробирку в течение 30 с.
    4. Инкубируйте образцы на льду в течение 15 минут.
    5. Центрифугируйте образцы при давлении 13 800 x g в течение 15 мин при 4 °C и перенесите надосадочную жидкость в новую пробирку объемом 2 мл без РНКазы.
    6. Добавьте 0,4 мл хлороформа в пробирку, вихревую и центрифугу при 13 800 x g в течение 10 минут при 4 °C.
    7. Осторожно перенесите часть (около 2/3) бесцветной верхней фазы в новую пробирку, не содержащую РНКазы. Не аспирируйте и не тревожьте белую границу, содержащую ДНК.
    8. Добавьте 0,5 мл холодного изопропанола, вортекс в течение 30 с и центрифугируйте при 13 800 x g в течение 15 минут при 4 °C. Сбоку от дна трубки образуется гранула.
    9. Осторожно аспирируйте надосадочную жидкость с помощью наконечника пипетки и удерживайте гранулу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гранула РНК имеет желеобразную форму и прозрачна при очень высокой чистоте.
    10. Добавьте 1 мл холодного 70% этанола, энергично перебейте образцы в течение 30 с и центрифугируйте при 13 800 x g в течение 10 минут при 4 °C.
    11. Осторожно отсадите надосадочную жидкость с помощью наконечника пипетки и высушите гранулу на воздухе в вытяжке при температуре RT в течение 5-10 минут. Не стоит пересушивать гранулы.
    12. Добавьте 20-50 μл воды, не содержащей РНКазы, и осторожно повторно суспендируйте гранулу, пипетируя вверх и вниз.
    13. Нанесите 1 мкл РНК на спектрофотометр (Таблица материалов). В общей сложности около 10 мкг РНК от контрольной группы и пациентов соответственно использовали для подготовки библиотеки Illumina30.
    14. Храните РНК при температуре −80 °C.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

На схематической иллюстрации описаны процедуры дифференцировки для получения здоровых и больных органоидов сетчатки, полученных из ИПСК (Рисунок 1). От iPSC до RO вариации могут быть получены в зависимости от нескольких факторов. Статус iPSC является определяющим этапом генерации RO. Кроме того, настоятельно рекомендуется, чтобы исследователи записывали каждый шаг, каталог и номер партии всех носителей, чтобы можно было отследить весь эксперимент. На рисунке 2А ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Органоиды сетчатки представляют собой трехмерные слоистые структуры, полученные из ИПСК или эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), и представляют собой очень многообещающую модель для имитации пространственных и временных закономерностей развития сетчатки человека31,32. АФ состоят из различных типов клеток сетчатки, включая фоторецепторы, биполярные клетки, ганглиозные клетки, амакриновые клетки, горизонтальные клетки и глию Мюлле...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Все авторы не раскрывают конфликт интересов.

Благодарности

Мы благодарим М.С. Янь-пина Ли и Чжо-линь Лю за их техническую поддержку и полезные комментарии относительно рукописи. Эта работа была частично поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (82171470, 31871497, 81970838, Z20J00122), Пекинским муниципальным фондом естественных наук (Z200014, 82125007) и Национальной ключевой программой исследований и разработок Китая (2017YFA0105300).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
96 конических скважин с V-образным забоемSumitomo BakeliteMS-9096VZ
A-83– 01Исследования и D Systems2939/10
Адгезионный микроскоп слайдыCITOtest188105
AgaroseGene Tech111760
Amaxa Nucleofector 2b DeviceLonzaAAB-1001Трансфекционная система
B-27Thermo Fisher Scientific17504044
bFGFR& D Systems3718-FB
BlebbistatinNuwacell BiotechnologiesRP01008
Пробирка для забора кровиBD Vacutainer EDTA366643
CHIR99021TOCRIS4423/10
Предметные стекла обложкиCITOGLAS10212440C
cTarget hPSC MediumNuwacell BiotechnologiesRP01020
DAPIInvitrogenD-1306
DMEM/Ham' s F12Gibco10565-042
Ослик против мышей 488ИнвитрогенA-21202
Осел против кролика 594ИнвитрогенA-21207
ЭДТАNuwacell БиотехнологииRP01007
СредоточиеFluorSaveTM Реагент345789
EX-CYTE Среда для усиления ростаSigma811292Среда для стимуляции роста
Фетальная бычья сывороткаGibco04-002-1A
FicollSigma-Aldrich26873-85-8Градиентная среда
плотности FLT3LPeprotech300-19
GlutaMAXLife Technologies35050-061L-глутаминовая добавка
HA-100STEMCELL Technologies72482
Ветчина s F12Gibco11765-054
hLIFThermo Fisher ScientificAF-250-NA
ГомогенизаторEDEN labD-130
IL-3Peprotech213-13
IL-6Peprotech200-06
Iscove' s Модифицированный Dulbecco MediumGibco12440053
KnockOut Замена сыворотки - многовидоваясреда для замены сывороткиGibcoA3181502
/M-опсинMilliporeab5405
МонотиоглицеринSigmaM6145
N-2 добавкаThermo Fisher Scientific17502048
Nanodrop СпектрофотометрThermo Fisher ScientificND2000Спектрофотометр
ncEpic 125x ДополнениеNuwacell BiotechnologiesRP01001-02125x Дополнение
ncEpic Basal MediumNuwacellBiotechnologies RP01001-01Базальная среда hpsc
ncLaminin511 человеческий рекомбинантный белокNuwacell Biotechnologies
PD0325901STEMCELL Technologies72182
Пенициллин-стрептомицинGibco15140-122
Рекомбинантный человеческий BMP4R& D Systems314-BP
Ретиноевая кислотаSigmaR2625
РодопсинSigmaO4886
RNeasy Mini KitQiagen74104
RNeasy Mini KitQiagen74104
sIL6-RThermo Fisher ScientificRP-75602
StemSpan SFEM mediumSTEMCELL Technologies09600
Taurine SigmaT8691
РеагентТризол Инвитроген15596026
ВитронектинNuwacell BiotechnologiesRP01002
нож V-Lance AlconSurgical 8065912001
L RP01025

Ссылки

  1. Jin, Z. B., et al. Stemming retinal regeneration with pluripotent stem cells. Progress in Retinal and Eye Research. 69, 38-56 (2019).
  2. Lin, Q., et al. Generation of nonhuman primate model of cone dysfunction through in situ AAV-mediated CNGB3 ablation. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 18, 869-879 (2020).
  3. Zhou, M., Liu, Y., Ma, C. Distinct nuclear architecture of photoreceptors and light-induced behaviors in different strains of mice. Translational Vision Science & Technology. 10 (2), 37(2021).
  4. Zito, I., et al. RPGR mutation associated with retinitis pigmentosa, impaired hearing, and sinorespiratory infections. Journal of Medical Genetics. 40 (8), 609-615 (2003).
  5. Solovei, I., et al. Nuclear architecture of rod photoreceptor cells adapts to vision in mammalian evolution. Cell. 137 (2), 356-368 (2009).
  6. Volland, S., Esteve-Rudd, J., Hoo, J., Yee, C., Williams, D. S. A Comparison of some organizational characteristics of the mouse central retina and the human macula. PLoS One. 10 (4), 0125631(2015).
  7. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  8. Han, J. W., Yoon, Y. S. Induced pluripotent stem cells: Emerging techniques for nuclear reprogramming. Antioxidants & Redox Signaling. 15 (7), 1799-1820 (2011).
  9. Kim, J. S., Choi, H. W., Choi, S., Do, J. T. Reprogrammed pluripotent stem cells from somatic cells. International Journal of Stem Cells. 4 (1), 1-8 (2011).
  10. Li, Y. P., Liu, H., Jin, Z. B. Generation of three human iPSC lines from a retinitis pigmentosa family with SLC7A14 mutation. Stem Cell Research. 49, 102075(2020).
  11. Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), 171686(2019).
  12. Pan, D., et al. COCO enhances the efficiency of photoreceptor precursor differentiation in early human embryonic stem cell-derived retinal organoids. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 366(2020).
  13. Liu, H., et al. Human embryonic stem cell-derived organoid retinoblastoma reveals a cancerous origin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (52), 33628-33638 (2020).
  14. Deng, W. L., et al. Gene correction reverses ciliopathy and photoreceptor loss in iPSC-derived retinal organoids from retinitis pigmentosa patients. Stem Cell Reports. 10 (4), 1267-1281 (2018).
  15. Gao, M. L., et al. Patient-specific retinal organoids recapitulate disease features of late-onset retinitis pigmentosa. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 128(2020).
  16. Del Amo, E. M., et al. Pharmacokinetic aspects of retinal drug delivery. Progress in Retinal and Eye Research. 57, 134-185 (2017).
  17. Aasen, D. M., Vergara, M. N. New drug discovery paradigms for retinal diseases: A focus on retinal organoids. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 36 (1), 18-24 (2020).
  18. Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368 (9549), 1795-1809 (2006).
  19. Anasagasti, A., Irigoyen, C., Barandika, O., Lopez de Munain, A., Ruiz-Ederra, J. Current mutation discovery approaches in Retinitis Pigmentosa. Vision Research. 75, 117-129 (2012).
  20. Daiger, S. P., Bowne, S. J., Sullivan, L. S. Genes and mutations causing autosomal dominant retinitis pigmentosa. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 5 (10), 017129(2014).
  21. Kortum, F., et al. X-linked retinitis pigmentosa caused by non-canonical splice site variants in RPGR. International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 850(2021).
  22. Megaw, R. D., Soares, D. C., Wright, A. F. RPGR: Its role in photoreceptor physiology, human disease, and future therapies. Experimental Eye Research. 138, 32-41 (2015).
  23. Li, Y. P., Deng, W. L., Jin, Z. B. Modeling retinitis pigmentosa through patient-derived retinal organoids. STAR Protocols. 2 (2), 100438(2021).
  24. Liu, H., Hua, Z. Q., Jin, Z. B. Modeling human retinoblastoma using embryonic stem cell-derived retinal organoids. STAR Protocols. 2 (2), 100444(2021).
  25. Zhang, X. H., Xie, Y., Xu, K., Li, Y. Generation of an induced pluripotent stem cell line BIOi002-A from a patient with autosomal dominant optic atrophy. Stem Cell Research. 53, 102278(2021).
  26. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
  27. Kuwahara, A., et al. Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nature Communication. 6, 6286(2015).
  28. Cowan, C. S., et al. Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).
  29. Eldred, K. C., et al. Thyroid hormone signaling specifies cone subtypes in human retinal organoids. Science. 362 (6411), (2018).
  30. Kumar, R., et al. A high-throughput method for illumina RNA-seq library preparation. Frontiers in Plant Science. 3, 202(2012).
  31. Fligor, C. M., et al. Three-dimensional retinal organoids facilitate the investigation of retinal ganglion cell development, organization and neurite outgrowth from human pluripotent stem cells. Scientific Reports. 8 (1), 14520(2018).
  32. Morizur, L., Herardot, E., Monville, C., Ben M'Barek, K. Human pluripotent stem cells: A toolbox to understand and treat retinal degeneration. Molecular and Cellular Neurosciences. 107, 103523(2020).
  33. Bhatt, L., Groeger, G., McDermott, K., Cotter, T. G. Rod and cone photoreceptor cells produce ROS in response to stress in a live retinal explant system. Molecular Vision. 16, 283-293 (2010).
  34. O'Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: A window into human retinal development. Development. 147 (24), (2020).
  35. Xue, Y., et al. Retinal organoids long-term functional characterization using two-photon fluorescence lifetime and hyperspectral microscopy. Frontiers in Cellular Neurosciences. 15, 796903(2021).
  36. Colombo, L., et al. Comparison of 5-year progression of retinitis pigmentosa involving the posterior pole among siblings by means of SD-OCT: A retrospective study. BMC Ophthalmology. 18 (1), 153(2018).
  37. Ferrari, S., et al. Retinitis pigmentosa: Genes and disease mechanisms. Current Genomics. 12 (4), 238-249 (2011).
  38. Shintani, K., Shechtman, D. L., Gurwood, A. S. Review and update: Current treatment trends for patients with retinitis pigmentosa. Optometry. 80 (7), 384-401 (2009).
  39. Wang, A. L., Knight, D. K., Vu, T. T., Mehta, M. C. Retinitis pigmentosa: Review of current treatment. International Ophthalmology Clinics. 59 (1), 263-280 (2019).
  40. Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne, S. J. Genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Clinical Genetics. 84 (2), 132-141 (2013).
  41. Parfitt, D. A., et al. Identification and correction of mechanisms underlying inherited blindness in human iPSC-derived optic cups. Cell Stem Cell. 18 (6), 769-781 (2016).
  42. Shimada, H., et al. In vitro modeling using ciliopathy-patient-derived cells reveals distinct cilia dysfunctions caused by CEP290 mutations. Cell Reports. 20 (2), 384-396 (2017).
  43. Deretic, D., Wang, J. Molecular assemblies that control rhodopsin transport to the cilia. Vision Research. 75, 5-10 (2012).
  44. Rao, K. N., Li, L., Anand, M., Khanna, H. Ablation of retinal ciliopathy protein RPGR results in altered photoreceptor ciliary composition. Scientific Reports. 5, 11137(2015).
  45. Zhang, X., Wang, W., Jin, Z. B. Retinal organoids as models for development and diseases. Cell Regeneration. 10 (1), 33(2021).
  46. Zhang, X. H., Jin, Z. B. Patient iPSC-derived retinal organoids: Observable retinal diseases in-a-dish. Histology and Histopathology. 36 (7), 705-710 (2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.