Анализ сердечной сократительной дисфункции и транзиторов Ca²⁺ в миоцитах грызунов

Анализ функции сердечного насоса часто требует ряда подходов для получения адекватного понимания, особенно для животных моделей сердечной недостаточности (HF). Эхокардиография или гемодинамические измерения дают представление о сердечной дисфункции in vivo ¹, в то время как подходы in vitro часто используются для определения того, возникает ли дисфункция из-за изменений в миофиламенте и / или транзиторе Ca²⁺ , ответственном за возбуждение связи, или потенциале действия со сократительной функцией (например, связь возбуждение-сокращение [E-C]). Подходы in vitro также дают возможность скрининга функционального ответа на нейрогормоны, векторно-индуцированные генетические изменения, а также потенциальные терапевтические агенты² до проведения дорогостоящих и/или трудоемких стратегий лечения in vivo .

Существует несколько подходов к исследованию сократительной функции in vitro, включая измерения силы в интактных трабекулах³ или пермеабилизированных миоцитах⁴, а также ненагруженное укорочение и транзиторы Ca²⁺ в интактных миоцитах в присутствии и отсутствии HF ^5,6. Каждый из этих подходов фокусируется на сократительной функции сердечных миоцитов, которая непосредственно отвечает за функцию сердечного насоса ^2,7. Тем не менее, анализ как сокращения, так и связи E-C вместе чаще всего выполняется путем измерения укорочения длины мышцы и переходных процессов Ca²⁺ в изолированных, устойчивых к Ca²⁺ взрослых миоцитах. Лаборатория использует подробный опубликованный протокол для выделения миоцитов из сердец крыс для этого шага⁸.

Как транзитор Ca²⁺, так и миофиламенты способствуют укорочению и повторному удлинению в интактных миоцитах и могут способствовать сократительной дисфункции ^2,7. Таким образом, этот подход рекомендуется, когда функциональный анализ in vitro требует интактного миоцита, содержащего велосипедный механизм Ca^{2 +} плюс миофиламенты. Например, интактные изолированные миоциты желательны для изучения сократительной функции после модификации миофиламента или циклической функции Ca²⁺ посредством переноса генов⁹. Кроме того, интактный миоцитарный подход предлагается для анализа функционального воздействия нейрогормонов при изучении влияния нисходящих вторичных сигнальных путей мессенджера и/или ответа на терапевтические агенты². Альтернативное измерение нагрузочно-зависимой силы в отдельных миоцитах чаще всего выполняется после мембранной пермеабилизации (или снятия кожи) при низких температурах (≤15 °C) для удаления переходного вклада Ca²⁺ и фокусировки на функции миофиламента¹⁰. Измерение зависящей от нагрузки силы плюс переходные процессы Ca²⁺ в интактных миоцитах встречается редко из-за сложной и технической проблемы подхода¹¹, особенно когда требуется более высокая пропускная способность, например, для измерения реакций на передачу сигналов нейрогормона или в качестве экрана для терапевтических агентов. Анализ сердечных трабекул преодолевает эти технические проблемы, но также может зависеть от немиоцитов, фиброза и / или ремоделирования внеклеточного матрикса². Каждый из описанных выше подходов требует препарата, содержащего взрослые миоциты, поскольку неонатальные миоциты и миоциты, полученные из индуцируемых плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), еще не экспрессируют полный комплемент взрослых белков миофиламента и обычно не имеют уровня организации миофиламента, присутствующего во взрослом палочковидном миоците². На сегодняшний день данные в иПСК указывают на то, что полный переход к взрослым изоформам превышает более 134 дней в культуре¹².

Учитывая акцент этой коллекции на HF, протоколы включают подходы и анализ для дифференциации сократительной функции в неисправных и недееспособных интактных миоцитах. Репрезентативные примеры приведены из крысиных миоцитов, изученных через 18-20 недель после надпочечниковой коарктации, описанной ранее ^5,13. Затем проводятся сравнения с миоцитами у крыс, обработанных фикцией.

Протокол и платформа визуализации, описанные здесь, используются для анализа и мониторинга изменений укорочения и транзиторов Ca²⁺ в палочковидных сердечных миоцитах во время развития HF. Для этого анализа 2 x 10⁴ Ca²⁺ -толерантные, палочковидные миоциты покрыты 22 мм² стеклянными крышками (CSs) с покрытием ламинин и культивируются в течение ночи, как описано ранее⁸. Компоненты, собранные для этой платформы визуализации, наряду с носителями и буферами, используемыми для оптимальной визуализации, представлены в Таблице материалов. Руководство по анализу данных с использованием программного обеспечения и репрезентативные результаты также представлены здесь. Общий протокол разбит на отдельные подразделы, причем первые три раздела посвящены изолированным миоцитам крыс и анализу данных, за которыми следуют клеточные эксперименты Ca^{2 +} и анализ данных в миоцитах.

Исследования, проведенные на грызунах, проводились в соответствии с Политикой службы общественного здравоохранения в отношении гуманного ухода и использования лабораторных животных и были одобрены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Мичиганского университета. Для этого исследования миоциты были выделены у 3-34-месячных крыс Sprague-Dawley и F344BN весом ≥ 200 г⁵. Использовались как мужские, так и женские показатели.

1. Стимуляция миоцитов для исследования сократительной функции

1. Сделайте свежие среды на основе M199 для каждого набора изолированных миоцитов (Таблица материалов). За 1 день до стимуляции, пластина 2 x 10⁴ Ca²⁺-толерантные, палочковидные миоциты на 22 мм² покрытых ламинином стеклянных покровах (CSs), как описано ранее⁸.
2. Для подготовки камер замочите каждую камеру в 10% отбеливателе в течение 1 ч. Затем промывайте камеры проточной водопроводной водой в течение 30-45 мин, затем дистиллированную воду заменяют каждые 5 мин в течение 30 мин, затем деионизированную воду заменяют каждые 5 мин в течение 30 мин, и заключительную промывку в деионизированной воде.
3. Высушите камеры на чистой поверхности в течение 20-30 мин (дополнительный рисунок 1А-С). Далее УФ обрабатывают камеры в шкафу биобезопасности в течение 5 мин в каждом направлении (итого = 20 мин). Этот шаг не нужен для предварительно стерилизованных камер.
   ВНИМАНИЕ: Покиньте область, чтобы свести к минимуму воздействие ультрафиолета.
4. Снимите крышку с камеры, добавьте 3 мл среды на основе M199 (см. Таблицу материалов) в каждую скважину (дополнительный рисунок 1B), замените крышку и предварительно разогрейте камеру в инкубаторе с температурой 37 °C с 5% CO₂ и 20% O₂.
5. Стерилизуйте щипцы в горячем стерилизаторе при 250 °C в течение 20-25 с. Перенесите предварительно нагретую стимулирующую камеру из инкубатора в шкаф биобезопасности.
6. Перенесите каждый покров (CS), содержащий сердечные миоциты, в отдельные колодцы в камере стимуляции с помощью стерильных щипцов. Передавайте КС по четыре за раз, с последующим нагревом в течение 10 мин перед передачей оставшихся четырех КС для поддержания температуры среды.
7. Прикрепите банановые домкраты к камере стимуляции на одном конце (дополнительный рисунок 1C) и к стимулятору на другом конце (дополнительный рисунок 1D).
8. Установите частоту стимулятора на 0,2 Гц и установите напряжение (~12 В) для достижения сокращения в ~10%-20% всех палочковидных сердечных миоцитов внутри лунки. Чтобы определить количество сокращающихся миоцитов, поместите камеру под инвертированный микроскоп с увеличением от 4 до 10 раз.
9. Поместите камеру стимуляции в инкубатор при 37 °C в 5% CO₂ (дополнительный рисунок 1E). Меняйте среду каждые 12 ч с помощью среды, предварительно нагретой в инкубаторе 37 °C, 5% CO₂ в течение 20-25 мин. Продолжайте электростимуляцию до 3 дней с изменением среды каждые 12 ч.

2. Анализ сократительной функции сердечных миоцитов взрослых крыс

1. Разогрейте гелевую упаковку и среду в инкубаторе при температуре 37 °C в течение 30 мин перед экспериментом.
2. Включите компоненты платформы с контрактильной функцией, перечисленные в таблице материалов и показанные на дополнительном рисунке 2, с особым вниманием к ключевым компонентам, которые включают антивибрационную таблицу (дополнительный рисунок 2A-1) с инвертированным микроскопом с темно-красным (590 нм) фильтром (дополнительный рисунок 2A-2,3) и ПЗС-камеру (дополнительный рисунок 2A-4), подключенную к контроллеру CCD (дополнительный рисунок 2A-5 и Дополнительный рисунок 2C-5) и интегрированный с ПК-компьютером (Дополнительный рисунок 2В-14).
3. Вмонтируйте трубку в перистальтический насос (дополнительный рисунок 2А-8; Дополнительный рисунок 2А-8), перенесите предварительно нагретую гелевую упаковку в держатель трубки (дополнительный рисунок 2А-9) и включите вакуум (дополнительный рисунок 2А-11) и питание на клеточный стимулятор (дополнительный рисунок 2В-13).
4. Поместите трубку объемом 50 мл со средой в изолированный держатель трубки (дополнительный рисунок 2А-9) и начните перфузию со скоростью ~0,5 мл/мин через трубку перистальтического насоса (дополнительный рисунок 2E-8).
5. Добавьте небольшое количество предварительно нагретой среды в небольшую весовую лодку (~ 2 мл). Перенесите один КС, содержащий миоциты, из стимулирующей камеры в весовую лодку. Верните камеру стимуляции к 37 °C в инкубаторе с 5% CO₂ .
6. Снимите CS с весовой лодки и аккуратно протрите нижнюю часть. Переложите CS в свежесмазанную камеру CS (дополнительный рисунок 2A, F-10; черная стрелка) и осторожно добавьте каплю среды (~200 мкл) на CS.
7. Поместите платиновый электрод поверх CS (дополнительный рисунок 2F; серая стрелка) и положите новый CS сверху с помощью щипцов. Поместите верхнее крепление (дополнительный рисунок 2F; белая стрелка) над сэндвичем CS, а затем установите два или четыре винта #0, чтобы закончить сборку камеры.
8. Как только среда появится во всей трубке насоса, прикрепите трубку к предпусковому подогревателю, а затем подключите предпусковой подогреватель к камере CS, собранной на этапе 2.7. Начните перфузию со скоростью 0,5 мл / мин и поместите салфетку под камеру, чтобы убедиться в отсутствии утечек.
9. Поместите камеру CS в адаптер сцены. Перфузированная среда собирается на противоположном конце камеры с трубкой, подключенной к вакуумной системе. Включите систему отопления (дополнительный рисунок 2A, D-7) и уравновешивайте камеру, объектив и подогреватель в течение ~ 5-10 мин для достижения постоянной температуры среды 37 °C. Визуализируйте миоциты с помощью 40-кратного объекта погружения в воду на микроскопе в течение этого времени равновесия.
10. Активируйте стимулятор кардиостимулятора (дополнительный рисунок 2B-13), установив напряжение в 1,5 раза больше, чем необходимо для сокращения 80% палочковидных клеток, что обычно составляет 35-40 В. Установите частоту стимуляции на 0,2 Гц для оптимизации сократительной функции и выживаемости миоцитов.
11. Соберите сократительные укороченные и удлиняющие следы от непрерывно перфузированных и ускоренных миоцитов. Для сбора измерений сокращения используйте ПЗС-камеру (дополнительный рисунок 2A-4), подключенную к контроллеру CCD (дополнительный рисунок 2B-5, C), и специальный компьютер с платой контроллера ввода/вывода (дополнительный рисунок 2B-14; см. Таблицу материалов). Платформа измеряет укорочение саркомера в миоцитах крыс, хотя аналогичные результаты получены из измерений миоцитов, собранных из продольных краев миоцитов (см. Ecklerle et ^al.14).
12. Чтобы собрать следы сокращения саркомера, откройте программное обеспечение на компьютере, нажмите кнопку ОК, а затем Файл > Создать. Подготовьте шаблон экрана, выбрав Трассировки > Изменить ограничения пользователя > Длину саркомера , а затем установив максимальное и минимальное значения, которые обычно составляют от 2,0 мкм до 1,5 мкм. Откалибруйте ПЗС-камеру с помощью гратикулы 0,01 мм перед проведением измерений в миоцитах (рисунок 1D).
13. Чтобы записать трассировки длины саркомера, выберите Файл > Создать. Определите сокращающийся миоцит и расположите миоцит вдоль продольной оси камеры, чтобы рисунок полосы был вертикальным (рисунок 1B).
14. Используйте компьютерную мышь, чтобы поместить область интереса (ROI) (розовая коробка) над миоцитом (рисунок 1C). Выберите Собрать и Начать , чтобы записать сократительную функцию. Запись укорочения в течение 60 с с каждого миоцита на низких частотах стимуляции (≤0,5 Гц).
15. Регистрируйте укорочение саркомера от 5-10 клеток на КС. Выполняйте измерения при 1 клетке/КС, если исследования включают лечение агонистами/антагонистами. Подготовьте отдельные предварительно нагретые среды и другой специальный кусок перфузионной трубки, загруженный в многоканальный перистальтический насос, и выполните шаги 2.9.-2.14. для измерения влияния доставки препарата или нейрогормона на сократительную функцию миоцитов.
16. Чтобы измерить укорочение в диапазоне частот, разместите миоциты на каждой частоте, чтобы получить устойчивое укорочение до записи⁵. Для этих исследований удваивают скорость перфузии и начинают запись через 15-20 с после стимуляции на новой частоте для получения последовательных стационарных сократительных откликов для частот в диапазоне 0,2 Гц и 2 Гц. Как правило, регистрируют не более 2 миоцитов/КС для укорочения в заданном диапазоне частот стимуляции.
17. Запишите не менее 7 сокращений на клетку для получения надежных усредненных по сигналу данных при анализе записей (см. шаг 3.).

3. Анализ данных сократительной функции в изолированных миоцитах

1. Для начала выберите Файл, выберите записанную трассировку и нажмите кнопку Открыть. Выберите вкладку 1 (левая сторона) базовой трассировки, а затем установите для желтой панели в верхней части трассировки значение Sarc-Length. Выберите Трассировки и шаблон экрана, подготовленный на шаге 2.12.
2. Чтобы подготовить шаблон анализа, выберите Операции, Параметры монотонного анализа переходных процессов, Отметка события TTL в поле Определение t0, а также следующие опции в меню: Базовая линия (длина саркомера покоя), Скорость вылета относительно t0 (dep v), Пик (пиковая высота и %пиковая высота/базовая линия или bl%пик h), Обратная скорость относительно tPeak (ret v), Время достижения пика 50% (TTP_50%) с использованием t0 и время до базового уровня 50% (TTR_50%)) с помощью tPeak. Сохраните эти параметры анализа, выбрав Шаблоны > Сохранить шаблон анализа с идентификатором. Загрузите этот шаблон анализа перед анализом каждой трассировки.
3. Чтобы начать анализ данных, выберите Marks > Gate > Add Transient > Convert from Event Mark > Analysis Range. Теперь установите временной диапазон от -0,01 с до 1,20 с для миоцитов с частотой 0,2 Гц (рисунок 2А, красные отметки на нижней части сырого следа). Выберите более короткий временной диапазон для миоцитов, стимулируемых на более высоких частотах.
4. Создайте трассировку с усредненным сигналом, выбрав Операции > Средние события. Усредненная по сигналу запись отображается ниже исходного базового следа.
5. Выберите вкладку 1 трассировки усредненного сигнала (левая часть экрана), а затем выберите Метки в верхнем меню, а затем Добавить переходный. Выберите «Операции» в верхнем меню и «Монотонный анализ переходных процессов », чтобы отобразить усредненные по сигналу значения базовой длины саркомера, высоты пика, bl%peak h, dep v, ret v, TTP_50% и TTR_50% на панели отображения усредненного сигнала.
6. Перенесите каждый анализ переходных процессов саркомера в электронную таблицу для композитного анализа нескольких миоцитов, выбрав Экспорт > Монотонный переходный анализ > Ток буфера обмена. Вставьте эти данные в электронную таблицу для каждой трассировки.
7. Чтобы скопировать трассировку, усредненную по сигналу, выберите «Экспортировать > «Текущую трассировку» > > «Параметры буфера обмена» и установите для десятичных знаков значение 5, затем выберите «Разделитель табуляции» и нажмите кнопки «ОК» и «ОК». Вставьте усредненные по сигналу следы для каждой записи миоцитов во вторую электронную таблицу.

4. Запись транзиторов Ca²⁺ в миоцитах сердца взрослых крыс

1. Перед измерением переходных процессов Ca²⁺ включите компоненты платформы, описанные на шаге 2.2., вместе с дополнительными компонентами флуоресцентной визуализации (см. Дополнительные компоненты для анализа изображений Ca²⁺ в Таблице материалов; Дополнительный рисунок 2А-5,6; 2В-12).
2. Готовят Фура-2АМ стоковый раствор, содержащий 1 мМ Фура-2АМ плюс 0,5 М пробенецида в диметилсульфоксиде (ДМСО). Probenecid минимизирует утечку Fura-2AM¹⁵.
3. Разбавляют исходный раствор до 5 мкМ Фура-2АМ и 2,5 мМ пробенецида в 2,5 мл среды (см. Таблицу материалов) в одной скважине 6-луночной пластины. Добавьте только 2,5 мл среды (без Fura-2AM) в три дополнительные скважины в пластине, покройте пластину алюминиевой фольгой и предварительно нагрейте среду до 37 °C.
4. Перенесите CS, содержащий миоциты, из камеры кардиостимуляции в колодец, содержащий Fura-2AM, накройте крышкой и верните пластину в инкубатор 37 °C с 5% CO₂ в течение 4 мин. Установите трубку в перфузионный насос и перфьюируйте со средой в течение периода загрузки Fura-2AM, как описано в шаге 2.4.
5. Выключите или сведите к минимуму освещение помещения, чтобы уменьшить флуоресцентное фотоотбеливание и оптимизировать флуоресцентный сигнал. Извлеките 6-луночную пластину из инкубатора, а затем промывайте CS в течение 10 с в каждой из трех скважин, содержащих только среду. Переложите CS на небольшую весовую лодку, содержащую предварительно обработанные носители (без добавления Fura-2AM).
6. Установите CS в свежесмазанную камеру CS после осторожного протирания нижней стороны CS. Аккуратно добавьте каплю среды в CS, а затем соберите крепление электрода над CS, а затем второе CS и верхнее крепление. Используйте винты No0 для завершения сборки камеры ячейки, как описано в шагах 2.6.-2.7.
7. Подключите насосную трубку, заполненную средой, к предпусковому подогревателю, подключите предпусковой подогреватель к камере CS и поместите в каскадный адаптер, как описано в шаге 2.8. Соберите среду с помощью системы вакуумных трубок и включите систему отопления (дополнительный рисунок 2A, D-7), чтобы уравновесить камеру до 37°C, как описано в шагах 2.8.-2.9.
8. Активируйте стимулятор темпа (дополнительный рисунок 2B-13), установленный на 35-40 В и 0,2 Гц, как описано в шаге 2.10.
9. Перед записью переходного ca²⁺ включите небольшой фонарик или книжный фонарик, установленный рядом с клавиатурой компьютера, чтобы помочь увидеть клавиатуру. Кроме того, регистрируют фон флуоресценции в области без сердечных миоцитов. Для начала выберите Файл > Запустить > Создать, как описано в шаге 2.12.
10. Выберите рентабельность инвестиций и установите одну вкладку (или панель трассировки, слева) для необработанного числителя и вторую вкладку для необработанного знаменателя, определенного в верхнем центре каждой вкладки. Записывайте фон в течение 10-20 с. Щелкните правой кнопкой мыши и перетащите указатель мыши на одну панель трассировки, чтобы получить необработанные значения усредненного по сигналу числителя и знаменателя. Введите эти значения, выбрав Операции > Константы, и введите необработанные значения.
11. Подготовьте новый шаблон экрана, чтобы собрать как укорочение, так и переходные процессы Ca²⁺ . Для длины саркомера выберите Tab 1 и используйте тот же процесс, что описан в шаге 2.13. Для изображения Ca²⁺ выберите Tab 2 > Ratio (верхний центр вкладки) > Traces > Edit User Limits (Изменить пользовательские ограничения ), чтобы установить минимальный и максимальный уровни для соотношения, которые обычно устанавливаются между 1 и 5. Используйте тот же процесс для определения диапазонов числителя и знаменателя для вкладок 3 и 4 (левая сторона).
12. Поместите коробку ROI над изображением миоцитов, как описано в шаге 2.14. Выберите Файл > Новый сбор >. Теперь выберите Пуск , чтобы собрать укороченные и ратиометрические данные Ca²⁺ . Запись ≥7 сокращений на клетку для усредненного анализа сигнала.
13. Повторите запись фоновой трассировки, описанную в шаге 4.10. после записи 2-4 миоцитов. Как правило, регистрируют 4-5 миоцитов / CS или меньше миоцитов, если есть значительные изменения в фоновом чтении.

5. Анализ данных переходных процессов Ca²⁺ в изолированных миоцитах.

1. Откройте нужный файл для анализа и выберите Шаблоны > Шаблон экрана для сокращения плюс Ca²⁺ переходные процессы. Затем выберите вкладки 1 и 2 (слева), чтобы показать длину саркомера и соотношение Ca²⁺ соответственно. Выберите Операции > Константы и введите значения числителя и знаменателя из фоновой трассировки Ca²⁺ .
2. Подготовьте шаблоны анализа для сокращения плюс ca²⁺ переходные данные. Выберите вкладку 1 (левая сторона) и используйте тот же процесс, что описан в шаге 3.2. , чтобы задать шаблон анализа длины саркомера.
3. Выберите вкладку 2 (слева) и выберите Операции, Параметры монотонного анализа переходных процессов, Отметку события TTL в поле Определение t0 и следующие параметры в меню: Базовая линия (базальное отношение), Скорость вылета относительно t0 (dep v), Пик (пиковая высота и %пиковая высота/базовая линия или bl%пик h), Скорость распада относительно tPeak (ret v), Время достижения пика 50% (TTP_50%) с использованием t0 и время до базового уровня 50% (TTR_50%)) с помощью tPeak. Сохраните эти параметры анализа, выбрав Шаблоны и Сохранить шаблон анализа , используя новое имя идентификатора. Загрузите этот шаблон анализа перед анализом каждой трассировки.
4. Используйте тот же процесс, что описан в шагах 3.3.-3.6. , чтобы усреднить сигнал, а затем проанализировать длину саркомера, после чего следуют те же шаги для переходных процессов Ca²⁺ . Установите отдельные отметки для длины саркомера и для трассировки переходного соотношения Ca²⁺ .

Исследования сократительной функции проводятся на миоцитах крыс, начиная со дня после выделения (день 2) до 4 дней после изоляции. Хотя миоциты могут быть зарегистрированы на следующий день после выделения (т. Е. День 2), часто требуется более длительное время культивирования после переноса генов или лечения для изменения сократительной функции8. Для миоцитов, культивируемых в течение более 18 ч после выделения, протокол кардиостимуляции, описанный в разделе 1, помогает поддерживать Т-канальцы и последовательные результаты укорочения и повторного удлинения.

Репрезентативная часть CS, содержащая миоциты для укороченных исследований, показана на рисунке 1A вместе с соответствующим расположением миоцита до установки ROI (рисунок 1B). Как только ROI идентифицирован (рисунок 1C; розовая коробка), информация алгоритма, показанная ниже миоцита, также помогает оптимизировать позиционирование миоцитов до записи. В частности, линейная оптическая плотность (LOD; черная линия) является индикатором количества и интервала саркомеров, а резкий спектр мощности в быстрой трассе преобразования Фурье (FFT, красная линия) помогает достичь оптимального выравнивания для записи укорочения и повторного удлинения. Рисунок гратикул, используемый для калибровки длины саркомера (и обнаружения краев), показан на рисунке 1D. Типичная выровненная запись сокращения длины саркомера показана на рисунке 2A (верхняя панель) вместе с усредненным по сигналу анализом, описанным в разделе 3 (нижняя панель).

Дисфункция часто обнаруживается в миоцитах, когда есть дисфункция in vivo на животных моделях. Например, систолическая дисфункция, наблюдаемая эхокардиографией в ответ на перегрузку давлением (PO)13 , также обнаруживается в исследованиях укорочения миоцитов5. Чтобы проиллюстрировать следы данных, репрезентативные необработанные (рисунок 2; верхняя панель) и усредненные по сигналу (рисунок 2; нижняя панель) следы, полученные при 0,2 Гц, показаны для миоцитов фиктивных (рисунок 2A) и обработанных PO (рисунок 2B) крыс. Чтобы проверить, может ли функция миоцитов быть спасена после PO, вирусно-опосредованный перенос генов во время выделения миоцитов также использовался для замены эндогенного сердечного тропонина I (cTnI) фосфо-миметической заменой cTnI T144D (T144D) в саркомере16. Первоначальный анализ показывает, что ВЫЗВАННОЕ PO снижение сократительной функции (таблица 1, верхняя панель) вернулось к фиктивным уровням в миоцитах PO через 4 дня после переноса генов cTnIT144D (таблица 1; нижняя панель).

Эта платформа также может быть использована для измерения транзитиентов Ca2+ , наряду с укорочением в изолированных миоцитах. Укорочение и Ca2+ не были зарегистрированы после PO, потому что PO снижает прилипание миоцитов крыс к ламинину13, а сопоставимая модель, ранее показывавшая, что измененная обработка Ca2+ развивается в аналогичной точкевремени 17. Вместо этого были проведены репрезентативные эксперименты на миоцитах, загруженных Fura-2AM, выделенных у 2-3-месячных крыс. Репрезентативная запись и усредненные по сигналу следы показаны на рисунке 3 вместе с анализом данных в таблице 2. Для этого набора экспериментов миоциты, выделенные у взрослых крыс, изучали через 4 дня после аденовирусно-опосредованного переноса генов (кратность инфекции = 100) cTnIT144D или cTnI дикого типа. Как укорочение саркомера, так и транзиторы Ca2+ были измерены после загрузки миоцитов Fura-2AM. Перенос генов cTnIT144D усиливал пиковое укорочение и повышенные диастолические уровни Ca2+ по сравнению с cTnI в этих первоначальных исследованиях (таблица 2). Хотя необходим более обширный анализ, первоначальные результаты показывают, что замена in vivo cTnIT144D может привести к сложному сердечному фенотипу из-за изменений как в сократительной функции, так и вобработке Ca 2 + с течением времени.

Рисунок 1: Сердечные миоциты взрослых крыс, используемые для функциональных исследований. (А) Репрезентативный изолированный сердечный миоцит от взрослой крысы (шкала бар = 50 мкм). Стрелка указывает на репрезентативный миоцит, изображенный для анализа сократительной функции. (B) Репрезентативный миоцит с ROI (розовый), расположенный сбоку (шкала = 20 мкм). (C) Репрезентативный миоцит с ROI (верхняя панель), саркомерным рисунком для этого миоцита (нижняя панель, синий; шкала = 20 мкм) и резким пиком спектра мощности (нижняя панель, красная). (D) Захват экрана 0,01 мм гратикулы для калибровки измерений укорочения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Репрезентативные записи из миоцитов крыс. Необработанный регистрирующий (верхняя панель) и усредненный по сигналу (нижняя панель) след, зарегистрированный при 0,2 Гц в миоцитах крыс, обработанных (A) фиктивной и (B) перегрузкой давления (PO). Миоциты были выделены через 18-20 недель после операции, причем PO продуцировали путем надпочечниковой коарктации13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Репрезентативная регистрация и анализ длины саркомера (SL) и переходных процессов Ca2+ из взрослых сердечных миоцитов, нагруженных Fura-2AM. (A) Необработанные следы для SL, переходное отношение Ca2 + (ratio), а также следы числителя и знаменателя, используемые для получения переходного отношения Ca2 + . (B) Пример усредненных по сигналу следов для SL (верхний след) и переходного отношения Ca2+ (нижний след). (C) Следы анализируются на длину саркомера (SL) и переходное отношение Ca2+ с использованием алгоритма монотонной трассировки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Сравнение сократительной функции в сердечных миоцитах в ответ на перегрузку давлением (PO) и перенос генов. Результаты укорочения миоцитов получены из фиктивных и PO-крысиных сердец через 18-20 недель после операции (верхняя панель)5,13 и миоцитов от фиктивных и PO крыс через 4 дня после переноса генов cTnIT144D (нижняя панель). Сократительная функция измеряется через 4 дня после выделения миоцитов/переноса генов во всех группах. Результаты выражаются как среднее ± SEM (n = количество миоцитов). Каждый набор фиктивных и PO данных сравнивается t-тестом студента, при этом *p < 0,05 считается статистически значимым. Результаты пиковой амплитуды только для миоцитов sham и PO были опубликованы ранее в Ravichandran et al.5.

Таблица 2: Сократительная функция и транзиторы Ca2+ в миоцитах взрослых крыс через 4 дня после переноса гена cTnIT144D. Показан анализ сократительной функции (верхняя панель) и переходных процессов Ca2+ (нижняя панель) в миоцитах после переноса генов cTnIT144D по сравнению с cTnI дикого типа. Миоциты выделяют у 2-3-месячных взрослых крыс, а данные представлены как среднее ± SEM (n = количество миоцитов). Статистические сравнения сократительной функции (слева) и переходных процессов Ca2+ (справа) выполняются с использованием непарного t-теста Стьюдента со значимостью, установленной *p < 0,05.

Дополнительный рисунок 1: Компоненты системы кардиостимуляции для миоцитов, покрытых КС, покрытыми ламинином. (A) Специальная камера, содержащая платиновые электроды в каждой камере. (B) Камера для темпа с первыми четырьмя камерами, заполненными средствами массовой информации. (C) Кардиостимулятор, прикрепленный к банановым кабелям, которые соединены с камерой и (D) стимулятором. (E) Соединение между стимулятором (справа) и инкубатором 37 °C (слева). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Компоненты, необходимые для сократительной функции миоцитов и/или переходных измерений Ca2+. (A) Платформа контрактильной функции, показывающая каждый компонент, с пронумерованными элементами, более подробно объясненными в Таблице материалов. Компоненты платформы включают в себя антивибрационный стол (No 1), инвертированный микроскоп brightfield (No 2,3), ПЗС-камеру (No 4), ПЗС-контроллер и ксеноновый источник питания (No 5), источник света с двойным излучением (No 6), регулятор температуры (No 7), перистальтический насос (No 8), держатель изолированной трубки (No 9), перфузионную камеру с крышкой (No 10) и вакуумную систему (No 11). (B) Дополнительные компоненты включают флуоресцентный интерфейс (#12), камерный стимулятор (#13) и компьютер ПК (#14), которые более подробно описаны в Таблице материалов. Виды нумерованных элементов на панели A крупным планом показаны в C-F. (C) Вид ксенонового блока питания (слева) и ПЗС-контроллера (справа). (D) Регулятор температуры. (E) Перистальтический насос. (F) Вид основания для перфузионной камеры CS (черная стрелка), платинового электродного крепления (серая стрелка) и верхнего крепления (белая стрелка) с винтами No0 с панорамной головкой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Авторы не имеют конкурирующих финансовых интересов или других конфликтов интересов.