Методическая статья

Измерение Caenorhabditis elegans Чувствительность к агонисту рецепторов ацетилхолина Левамизол

DOI:

10.3791/64056

⸱

7 июня 2022 г.

 , 
1Department of Biological Sciences, University of Delaware

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Настоящий протокол описывает анализ для определения ответа на левамизол, фармакологический агонист одного класса рецепторов Caenorhabditis elegans ацетилхолин. В этом жидком анализе плавания левамизола исследователи визуально наблюдают и количественно оценивают зависящий от времени паралич животных, культивируемых в 24-луночных пластинах.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В нервно-мышечном соединении (NMJ) связывание возбуждающего нейромедиатора ацетилхолина (ACh) с постсинаптическими рецепторами приводит к сокращению мышц. Как и в скелетных мышцах позвоночных, для передвижения требуется холинергическая сигнализация в мышцах стенки тела модельного организма Caenorhabditis elegans . Воздействие левамизола, фармакологического агониста одного класса рецепторов ACh на мышцы стенки тела, вызывает зависимый от времени паралич животных дикого типа. Измененная чувствительность к левамизолу предполагает дефекты передачи сигналов при NMJ или мышечной функции. Здесь представлен протокол анализа жидкого левамизола, выполненного на C. elegans , выращенных в 24-луночных пластинах. Энергичное плавание животных в жидкости позволяет оценить и количественно оценить паралич, вызванный левамизолом, у сотен червей в течение одного часа без необходимости физических манипуляций. Эта процедура может быть использована как с дикими типами, так и с мутантами, которые изменили чувствительность к левамизолу, чтобы продемонстрировать функциональные последствия измененной сигнализации в NMJ.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Активация постсинаптических ацетилхолиновых рецепторов (AChRs) на скелетных мышцах приводит к электрическому сигналу, который приводит к сокращению мышц. Нарушение нервно-мышечной функции приводит к миастеническим синдромам и мышечным дистрофиям у человека 1,2,3,4. Нематода Caenorhabditis elegans широко использовалась для изучения эволюционно сохраненных фундаментальных биологических процессов и механизмов заболевания. Скелетные мышцы позвоночных и мышцы стенки тела C. elegans функционально эквивалентны в контроле локомоции5. Здесь представлен простой анализ, который можно использовать для сравнения C. elegans дикого типа с мутантами, которые изменили нервно-мышечную сигнализацию или мышечную функцию.

Возбуждающие и тормозные входы, полученные от холинергических и ГАМКергических двигательных нейронов, соответственно, заставляют мышцы с одной стороны тела C. elegans сокращаться, в то время как мышцы с другой стороны расслабляются, обеспечивая скоординированное передвижение6. Левамизол, антигельминтное средство, используемое для лечения паразитарных нематодных инфекций, связывается и конститутивно активирует один класс ACHR на мышцах стенки тела, что приводит к параличу, зависящему от времени7. Таким образом, измененная чувствительность к левамизолу может быть использована для выявления C. elegans с дефектами баланса возбуждающей и тормозной сигнализации 7,8,9,10,11,12,13,14,15. Например, мутации в субъединицах левамизол-чувствительного AChR (L-AChR), таких как UNC-63, а также гомолог C. elegans Cubilin, LEV-10, который необходим для кластеризации L-AChR в синапсе, воздействуют возбуждающей сигнализацией и приводят к резистентности левамизола 7,8. Мутации в рецепторе ГАМКА UNC-49 уменьшают ингибирующую передачу сигналов и вызывают повышенную чувствительность к левамизолу12.

Гиперчувствительность или резистентность к левамизолу традиционно оценивалась путем переноса животных на агаровые пластины, содержащие левамизол, а затем регулярно подталкивали червей к определению временной точки, в которой наступает паралич 13,14,15. Мы разработали жидкий анализ плавания левамизола, который устраняет необходимость физических манипуляций с животными и позволяет проводить скрининг сотен животных всего за 1 час. Здесь описано использование этого анализа с животными дикого типа, unc-63(x26),lev-10(x17), unc-49(e407). Тем не менее, этот протокол также может быть выполнен на C. elegans, подвергшихся воздействию RNAi, как это было сделано для проверки нокдаунов, идентифицированных на общегеномном экране RNAi для измененной чувствительности левамизола11.

Для этого фармакологического анализа червей выращивали до зрелого возраста в 24-луночных пластинах, в каждую лунку добавляли 0,4 мМ левамизола в буфере М9, а количество движущихся животных регистрировали каждые 5 мин в течение 1 ч. Паралич, вызванный левамизолом, визуально наблюдался с течением времени, и после завершения анализа данные были количественно определены. Оценка мутантов вместе с дикими C. elegans позволяет студентам сначала делать прогнозы о потенциальных фенотипических эффектах, а затем проводить эксперименты для проверки своих гипотез. В заключение, этот простой, недорогой, жидкий анализ левамизола является идеальным способом продемонстрировать влияние потери конкретных генов на функцию NMJ.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка пластин для анализа левамизола

  1. Приготовьте среду для роста нематод (NGM), объединив 3 г NaCl, 2,5 г пептона и 17 г агара с 1 л деионизированной (DI) воды в колбе с перемешивающим батончиком.
  2. После автоклавирования поставьте носитель на конфорку, установленную на 70 °C, и перемешивайте с умеренной скоростью в течение 1 ч.
  3. Добавьте 1 мл 5 мг/мл холестерина по каплям, чтобы предотвратить осаждение, 1 мл 1M CaCl2, 1 мл 1 M MgSO4 и 25 мл 1 M pH 6,0 калийфосфатного буфера в среду.
  4. Переложите 2 мл среды NGM в каждую лунку 24-луночной пластины со стерильной серологической пипеткой (рисунок 1).
  5. Дайте тарелкам высохнуть на столешнице в течение 2 дней перед посевом бактериями. Для длительного хранения поместите их при температуре 4 °C.
  6. Вытрите OP50 E. coli на пластину лизогенного бульона (LB) и выращивайте в течение ночи при 37 °C.
  7. Выберите одну колонию OP50 в B-бульон (10 г триптона и 5 г NaCl в 1 л DI H2O) и нанесите культуру на 37 °C на ночь.
  8. Используя стерильную пипетку, капните 30 мкл суспензии OP50 на агар в середине каждой лунки (рисунок 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что вы не повредили поверхность агара, так как это приведет к закапыванию червей.
  9. Дайте тарелкам постоять при комнатной температуре в течение не менее 2 дней после посева, чтобы сформировать бактериальный газон.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если бактерии в центре лунок не высохли через 2 дня, оставьте пластины открытыми в вытяжке на 20 мин (рисунок 1). Тарелки следует залить и засеять бактериями за 1-2 недели до анализа.

2. Синхронизация C. elegans (день 1)

  1. Выращивайте дикорастущих, unc-63(x26), lev-10(x17), и unc-49(e407) C. elegans до зрелого возраста на пластинах по 6 см, готовя не менее восьми пластин на сорт. Подтвердите, что на тарелках много неголодных взрослых особей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это в два раза больше пластин, чем необходимо; однако важно иметь резервные пластины на случай, если первая партия яиц будет уничтожена во время отбеливания.
  2. Сделайте 10x M9 буфер, растворив 59,6 г Na2HPO4 (двухосновный), 29,9 г KH2PO4 (моноосновной), 12,8 г NaCl и 2,5 г MgSO4 в 750 мл воды DI с перемешиванием. После растворения доведите объем до 1 л и фильтруйте стерилизуем. Разбавьте 1:10 и автоклав, чтобы получить 1x буфер M9.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер 1x M9 может быть сделан за недели или месяцы.
  3. Приготовьте отбеливающий раствор под капотом в день синхронизации. Смешайте 10 мл отбеливателя (таблица материалов), 2,5 мл 10 N NaOH и 37,5 мл воды DI в конической трубке объемом 50 мл. Носите очки, перчатки и лабораторное пальто при работе с отбеливающим раствором.
  4. Используя пластиковую передаточную пипетку, промойте гравидных взрослых червей по крайней мере с четырех пластин с буфером 1x M9 и переложите их в коническую трубку объемом 15 мл.
  5. Открутите при 716 х г в течение 1 мин при комнатной температуре, а затем удалите супернатант с помощью передаточной пипетки.
  6. Добавить 10 мл отбеливающего раствора. Переверните или осторожно встряхните трубку в течение ~4 мин, пока большинство, но не все, туши червя не растворятся (рисунок 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не отбелить червей, так как это уничтожит яйца. Некоторые мутации могут увеличить сложность изоляции яйцеклеток.
  7. Отжим при 716 х г в течение 1 мин.
  8. Вылить раствор отбеливателя одним движением; до тех пор, пока трубка не будет встряхнута в этой точке, яйца будут прилипать к боковой части трубки.
  9. Добавьте 15 мл 1x буфера M9 и инвертируйте. Вращайтесь при 716 x g в течение 1 мин и выливайте буфер M9 одним плавным движением.
  10. Выполните в общей сложности три промывки с 1 буфером M9, как описано в шаге 2.9.
  11. После окончательной промывки добавьте 10 мл свежего 1x M9 и поместите на ротатор на ночь при 15 °C, чтобы изолировать синхронизированную популяцию голодающих животных первой личиночной стадии (L1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед размещением на ротаторе проверьте, есть ли яйца в буфере M9. Если нет, повторите подготовку с резервными пластинами и отбеливателем в течение более короткого времени.

3. Покрытие синхронизировано C. elegans (день 2)

  1. Распечатайте карту плит с 24 скважинами и назначьте деформации рандомизированным местам. Каждая деформация должна быть представлена в 24-луночной плите не менее шести раз.
  2. Примерно через 24 ч после подготовки отбеливателя отшелушиваются вылупившиеся голодные черви L1 в буфере M9 при 716 х г в течение 1 мин при комнатной температуре.
  3. Удалите ~9 мл буфера M9 с помощью пластиковой передаточной пипетки, а затем осторожно перемешайте голодающих червей первой личиночной стадии (L1s) в оставшемся буфере M9.
  4. Немедленно пипетировать 3 мкл червей в буфере M9 на предметное стекло микроскопа и определить количество L1s; желаемое число составляет 20-30 L1s в 3 мкл. Открутите и удалите M9, если концентрация червя слишком низкая, и добавьте M9, если концентрация слишком высока.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте количество червей на 3 мкл не менее 2x, каждый раз переворачивая трубку.
  5. Пипетка 3 мкл L1s (всего 20-30 червей) в каждую скважину в соответствии с предварительно составленной картой пластин (этап 3.1; Рисунок 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инвертируйте трубку с L1s в M9 часто, чтобы поддерживать равномерное распределение червей, поскольку они будут оседать на дно. Если этого не сделать, в некоторых колодцах будет слишком мало червей, в то время как в других будет слишком много. Кроме того, не прокалывайте агар наконечником пипетки, так как это заставит животных зарыться.
  6. Дайте червям вырасти до зрелого возраста в течение 3 дней при 20 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование различных температур роста и определенных мутаций может повлиять на скорость созревания, поэтому обязательно учитывайте жизненный цикл C. elegans .

4. Выполнение анализа левамизола (день 5)

  1. Распечатайте пустое техническое описание, которое будет использоваться для записи количества червей, движущихся в каждой скважине каждые 5 минут в течение 1 часа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Студенты смогут подсчитывать червей не более чем в 12 скважинах каждые 5 минут. Верхние 12 скважин анализируются в первый час, а нижние 12 скважин анализируются в последующий час.
  2. Проверьте червей в 24-луночных пластинах. Используя маркер, сделайте «X» на крышке пластины над любыми скважинами, которые имеют загрязнение, голодают или имеют слишком много червей (>40), что затруднит подсчет.
  3. Внесите 0,4 мМ раствора левамизола, добавив 200 мкл 100 мМ запаса левамизола к 50 мл 1x M9. Приготовьте 100 мМ запаса левамизола, растворив 240,76 мг гидрохлорида левамизола в 10 млH2Oи храните его при температуре −20 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Левамизол должен быть разбавлен в М9; разведение вH2Oускоряет паралич. Студенты должны носить перчатки. Прием внутрь высоких концентраций левамизола токсичен.
  4. Запустите таймер, а затем, используя передаточную пипетку, добавьте 1 мл 0,4 мМ левамизола в первые две скважины, чтобы животные свободно плавали. Продолжайте добавлять левамизол в соседние скважины, ошеломляя время в зависимости от количества скважин, подлежащих анализу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Например, если провести анализ 10 скважин, левамизол будет добавлен следующим образом: скважины 1 и 2 в момент 0, скважины 3 и 4 через 1 мин, скважины 5 и 6 через 2 мин, скважины 7 и 8 через 3 мин и скважины 9 и 10 через 4 мин.
  5. Через 5 минут начните вручную подсчитывать только количество движущихся червей в каждой скважине, начиная с первой скважины, и запишите это число в техническом описании (рисунок 1). Счетчики могут быть использованы, но не требуются для точного определения количества движущихся червей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Студенты должны следить за таймером, так как они иногда отстают в ранние моменты времени, прежде чем многие черви парализуются. Количество временных точек может быть скорректировано, или при необходимости может быть проанализировано меньше скважин в каждый момент времени.
  6. Продолжайте подсчитывать количество движущихся червей в каждой скважине каждые 5 мин в течение 1 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Погружение в M9 вызывает постоянное плавательное движение в течение этого 1-часового анализа, что устраняет необходимость подталкивания червей для оценки паралича (рисунок 2A). Воздействие 0,4 мМ раствора левамизола вызывает зависимый от времени паралич, наблюдаемый при прекращении плавания; черви, которые парализуют, не выздоравливают.
  7. Повторите шаги 4.4.-4.6. для остальных скважин в плите.
  8. В конце анализа или когда позволяет время, запишите общее количество червей в каждой скважине.

5. Анализ данных

  1. Получите карту пластин (шаг 3.1.) и запишите, какая деформация соответствует каждой скважине.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за объема собранных данных последующий анализ и обсуждение данных займет не менее пары часов.
  2. Введите данные в электронную таблицу, начиная с общего количества червей в каждой скважине и организуя по генотипу.
  3. Объединив данные из скважин, определите количество червей, движущихся в каждой точке времени для каждой деформации.
  4. Используйте эти данные для создания «кривой выживания» в статистическом программном обеспечении (Таблица материалов) для визуального отображения зависящего от времени паралича популяции (рисунок 2B).
  5. Сделайте таблицу данных такой, чтобы в левом столбце указывалось время, а последующие столбцы содержали данные для каждого штамма. Для каждого животного, которое парализовано в течение первых 5 минут, создайте ряд и введите «1» в течение 5 минут. Повторите это для каждой точки времени. Для всех животных, которые не парализуются к концу анализа, введите «0» в течение 60 мин.
  6. Выполните парные сравнения, используя тест log-rank (Mantel-Cox) в статистическом программном обеспечении (Table of Materials), чтобы определить, существует ли статистически значимая разница между двумя различными штаммами.
  7. Для дополнительного/альтернативного анализа вместо выполнения шага 5.3. и шаг 5.4, определить процент животных, движущихся в каждой скважине в каждый момент времени. Постройте среднее значение со стандартной погрешностью в каждой точке времени для всех штаммов, проанализированных с помощью программы для работы с электронными таблицами или статистического программного обеспечения (рисунок 2C).

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Передача сигналов через рецепторы AChR и GABA позволяет мышцам на одной стороне тела C. elegans сокращаться, в то время как мышцы на другой стороне расслабляются, обеспечивая скоординированную локомоцию 6,16. Связывание левамизола с ионотропными L-AChRs вызывает сокращение, что приводит к зависящему от времени параличу диких животных. Здесь мы оценили чувствительность дикого типа, мутанта unc-63 L-AChR, кластерирующего мутанта lev-10 L-AChR и мутантарецептора unc-49 GABA A C. elegans к левамизолу. Мутации в субъединицах L-AChR, а также в генах, необходимых для транспортировки L-AChRs к мышечной плазматической мембране, кластеризации постсинаптических L-AChRs и нисходящей передачи сигналов Ca2+, вызывают устойчивость к параличу, вызванному левамизолом 7,8,9,10,11,16,17, как это наблюдалось у мутантов unc-63 и lev-10 (рисунок 2B) ,С). Потеря ГАМК-закрытого ионного канала UNC-49 вызывала гиперчувствительность левамизола (фиг.2В,С) из-за нарушения правильного баланса холинергической и ГАМкергической сигнализации12. Когда этот анализ был недавно выполнен студентами в передовой генетической лаборатории, 100% студентов наблюдали резистентность левамизола с мутантами unc-63 и lev-10, в то время как 88% наблюдали гиперчувствительность левамизола к мутанту unc-49. Эти данные, собранные с помощью жидкостного анализа плавания левамизола, согласуются с фенотипами, наблюдаемыми в традиционных анализах левамизола на основе пластин 7,8,11,12,13.

figure-results-1
Рисунок 1: Схема подготовки и реализации анализа левамизола. 24-луночные плиты НГМ заливаются; Через 2 дня OP50 Escherichia coli высевают в колодцы. C. elegans синхронизируются с помощью подготовки к отбеливанию и первой личиночной стадии (L1) животных для каждого штамма, подлежащего анализу (дикий тип, черный; unc-63(x26), пурпурный; лев-10(x17), зеленый; unc-49(e407), синий) пипетируются в скважины в соответствии с заранее определенной картой плит на следующий день. После 3 дней роста при 20 ºC или когда животные достигают зрелого возраста, в каждую лунку добавляют 0,4 мМ левамизола в буфере M9, и количество движущихся животных подсчитывается каждые 5 мин в течение 1 ч. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2: Левамизол-индуцированный паралич у дикого типа и репрезентативного мутанта C. elegans. (A) Воздействие левамизола 0,4 мМ вызывает зависящий от времени паралич; это не наблюдается у животных, плавающих в буфере 1x M9 в течение 1 ч. (B) Зависимый от времени паралич диких (черный), unc-63(x26) (пурпурный), lev-10(x17) (зеленый) и unc-49(e407) (синий) животных в плавательном анализе левамизола. Потеря субъединицы L-AChR UNC-63 или кластеризующего белка L-AChR LEV-10 приводила к резистентности к левамизолу, а потеря рецептора ГАМКА UNC-49 вызывала гиперчувствительность к левамизолу. n ≥ 50 на генотип, p < 0,0001 для всех мутантов по сравнению с диким типом в этом репрезентативном эксперименте. (C) Используя те же данные, что и в панели (B), процент движущихся животных в каждый момент времени (среднее процентное содержание для каждой скважины ± SE) был определен для каждого штамма. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Измененный ответ на левамизол может идентифицировать гены, необходимые для постсинаптической холинергической сигнализации и мышечной функции. Протокол здесь описывает жидкий анализ левамизола, используемый для количественного определения зависимого от времени паралича в течение 1-часового периода времени. Студенты делают прогнозы о влиянии определенных генетических мутаций, проводят эксперимент с большим размером выборки, а затем количественно оценивают свои результаты. Этот анализ является простым и эффективным способом количественной оценки паралича, вызванного левамизолом, без отбора или подталкивания животных, что делает его подходящим для лабораторий бакалавриата, а также исследователей, изучающих нервно-мышечную передачу. Здесь обсуждаются некоторые из наиболее распространенных ловушек, ограничения анализа и вариация протокола, которая позволяет использовать его с животными RNAi; Здесь также обсуждается, как этот анализ может быть встроен в исследовательский опыт бакалавриата на основе курса.

Правильная подготовка плит из 24 скважин имеет важное значение. Во-первых, бактериальные газоны должны быть полностью сухими, прежде чем обнаружить животных L1 в колодцах. Если бактерии недостаточно высушены, они смешиваются с раствором левамизола во время анализа, превращая жидкость в мутную и не позволяя людям подсчитывать червей. Во-вторых, при синхронизации червей через подготовку отбеливателя животные не должны подвергаться воздействию раствора отбеливателя слишком долго, так как это приведет к распаду защитного покрытия на яйцах. В-третьих, крайне важно обнаружить только 20-30 L1s на скважину, так как слишком много червей в скважинах чрезвычайно затрудняет точный подсчет количества движущихся в отведенное время. Наконец, важно поддерживать асептическую технику во время подготовки пластин, так как загрязненные колодцы не могут быть проанализированы.

Есть несколько ограничений, которые необходимо учитывать при выполнении этого анализа. Во-первых, подсчет количества движущихся червей в каждой скважине каждые 5 минут может быть ошеломляющим для людей, у которых нет предыдущего лабораторного опыта, и это может привести к неточному сбору данных. Что касается других анализов, используемых для определения чувствительности к лекарственным средствам18,19, то этот эксперимент может быть выполнен с меньшим количеством временных точек. Во-вторых, покрытие голодающих L1, выделенных из отбеливателя, является простым методом получения синхронизированной популяции; однако необходимо внести коррективы, если сроки развития различаются между анализируемыми штаммами. Для этого анализа можно собрать животных поздней четвертой личиночной стадии (L4s) в 24-луночную пластину; однако при приготовлении многих тарелок это слишком трудоемко. В качестве альтернативы следует определить продолжительность времени, необходимого для достижения каждой деформацией L4, а затем поместить L1s в скважины в разное время, чтобы скорректировать различия в скорости созревания. Наконец, хотя этот анализ может быть использован для идентификации новых генов, важных для постсинаптической мышечной функции11, измененный ответ левамизола также может быть вызван мутацией или нокдауном RNAi пресинаптических генов12. Если наблюдается измененная чувствительность к левамизолу, необходимо провести дополнительные эксперименты для определения причины этого фенотипа.

Внеся несколько модификаций в 24-луночные пластины, описанный плавательный анализ левамизола также может быть выполнен на RNAi нокдаун животных11. Нокдаун гена через RNAi может быть достигнут путем питания бактерий C. elegans , которые экспрессируют двухцепочечную РНК, соответствующую интересующему гену20. Для приготовления пластин РНКи необходимо добавить 1 мл 1М ИПТГ и 1 мл 25 мг/мл карбенициллина на литр среды после удаления из автоклава. Бактериальные культуры выращивают путем сбора одной колонии в 3 мл бульона LB плюс 3 мкл 25 мг / млкарбенициллина и встряхивания при 37 ° C в течение ночи, и карта пластин составляется, когда различные бактерии обнаруживаются в колодцах. C. elegans синхронизируются путем подготовки отбеливателя, как описано; однако гиперчувствительный штамм RNAi eri-1(mg366) следует использовать вместо дикого типа для увеличения нокдауна генов. Нокдауны РНКи приводят к тем же фенотипам левамизола, которые наблюдаются у мутантов с потерей функции11.

Протокол, представленный здесь, может быть использован в лабораторных исследованиях, в качестве самостоятельного эксперимента в лаборатории бакалавриата или в первые недели продвинутого курса бакалавриата в качестве введения в основные методы C. elegans и нервно-мышечную функцию. В более продвинутом курсе, основанном на открытиях, студенты могут использовать этот анализ, чтобы определить, изменяет ли потеря C. elegans гомологов генов, мутировавших у людей с миастеническими синдромами, мышечными дистрофиями или миопатиями, чувствительность к левамизолам. В заключение, этот простой, недорогой анализ чувствительности левамизола обеспечивает практический подход к изучению сигнализации в NMJ и получению опыта работы с модельной системой C. elegans .

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Рию Даттани и Лорен Хогстром, которые собрали данные на рисунке 2B, C в слепом к генотипу в Лаборатории передовой генетики BISC413 (весна 2022 года) в Университете штата Делавэр. Дополнительная информация о научно-исследовательском опыте бакалавриата НА основе курса BISC413 (CURE), а также доступ к лабораторному руководству, разработанному J. Tanis, доступны по запросу. Штаммы нематод были предоставлены Центром генетики Caenorhabditis , который поддерживается NIH-ORIP (P40 OD010440). Эта работа была поддержана наградой P20 GM103446 Delaware INBRE Mentored CURE Award (для J.E.T.).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
60 мм невентилируемый, острый край Чашки ПетриTriTech ResearchCat #: T3308
BD Difco BactoAgar Fisher ScientificCat#: DF0140-01-0
BioLite 24 Well Multidish FisherScientificCat#:12-556-006
Кальция хлорид дигидрат FisherScientificCat#: BP510-500
ХолестеринMP BiomedicalsCat#: 02101382-CF
eri-1(mg366)Caenorhabditis Genetics Center (CGC)GR1373
Gibco Bacto PeptoneFisher ScientificCat#: DF0118-17-0
Gibco Bacto TryptoneFisher ScientificCat#: DF0123-17-3
GraphPad Prism (статистическое программное обеспечение)GraphPad Software, Inc.
lev-10(x17)Caenorhabditis Genetics Center (CGC)ZZ17
Левамизола гидрохлоридFisher ScientificCat#: AC187870100
Low Splash Regular Bleach - 121oz - up & upTarget Search target.com
Magnesium Sulfate HeptahydrateFisher ScientificCat#: BP213-1
MicrosoftExcel Microsoft, Inc
N2 дикий типCaenorhabditis Genetics Center (CGC)Bristol N2
OP50 E. coliCaenorhabditis Genetics Center (CGC)OP50
Калия фосфат двухосновнойFisher ScientificCat#: BP363-1
Potassium Phosphate MonoprincipalFisher ScientificCat#: BP362-500
Sodium Chloride (NaCl)Fisher ScientificCat#: BP358-1
Sodium Hydroxide 10NFisherScientific Cat#: SS255-1
Sodium Phosphate DibasicFisher ScientificCat#: BP332-1
unc-49(e407)Caenorhabditis Genetics Center (CGC)CB407
unc-63(x26)Центр генетики Caenorhabditis (CGC)ZZ26

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Engel, A. G., Shen, X. M., Selcen, D., Sine, S. M. Congenital myasthenic syndromes: Pathogenesis, diagnosis, and treatment. The Lancet Neurology. 14 (4), 420-434 (2015).
  2. Mahjneh, I., Lochmüller, H., Muntoni, F., Abicht, A. DOK7 limb-girdle myasthenic syndrome mimicking congenital muscular dystrophy. Neuromuscular Disorders. 23 (1), 36-42 (2013).
  3. Rodríguez Cruz, P. M., et al. Congenital myopathies with secondary neuromuscular transmission defects; A case report and review of the literature. Neuromuscular Disorders. 24 (12), 1103-1110 (2014).
  4. Montagnese, F., et al. Two patients with GMPPB mutation: The overlapping phenotypes of limb-girdle myasthenic syndrome and limb-girdle muscular dystrophy dystroglycanopathy. Muscle and Nerve. 56 (2), 334-340 (2017).
  5. Gieseler, K., Qadota, H., Benian, G. M. Development, structure, and maintenance of C. elegans body wall muscle. WormBook. , 1-59 (2017).
  6. Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nature Neuroscience. 2 (9), 791-797 (1999).
  7. Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 95 (4), 905-928 (1980).
  8. Gally, C., Eimer, S., Richmond, J. E., Bessereau, J. L. A transmembrane protein required for acetylcholine receptor clustering in Caenorhabditis elegans. Nature. 431 (7008), 578-582 (2004).
  9. Eimer, S., et al. Regulation of nicotinic receptor trafficking by the transmembrane Golgi protein UNC-50. The EMBO Journal. 26 (20), 4313-4323 (2007).
  10. Gendrel, M., Rapti, G., Richmond, J. E., Bessereau, J. L. A secreted complement-control-related protein ensures acetylcholine receptor clustering. Nature. 461 (7266), 992-996 (2009).
  11. Chaya, T., et al. A C. elegans genome-wide RNAi screen for altered levamisole sensitivity identifies genes required for muscle function. G3: Genes, Genomes, Genetics. 11 (4), 047(2021).
  12. Vashlishan, A. B., et al. An RNAi screen identifies genes that regulate GABA synapses. Neuron. 58 (3), 346-361 (2008).
  13. Krajacic, P., Pistilli, E. E., Tanis, J. E., Khurana, T. S., Lamitina, S. T. FER-1/Dysferlin promotes cholinergic signaling at the neuromuscular junction in C. elegans and mice. Biology Open. 2 (11), 1245-1252 (2013).
  14. Gottschalk, A., et al. Identification and characterization of novel nicotinic receptor-associated proteins in Caenorhabditis elegans. The EMBO Journal. 24 (14), 2566-2578 (2005).
  15. Loria, P. M., Hodgkin, J., Hobert, O. A conserved postsynaptic transmembrane protein affecting neuromuscular signaling in Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 24 (9), 2191-2201 (2004).
  16. Treinin, M., Jin, Y. Cholinergic transmission in C. elegans: Functions, diversity, and maturation of ACh-activated ion channels. Journal of Neurochemistry. 158 (6), 1274-1291 (2021).
  17. Rapti, G., Richmond, J., Bessereau, J. L. A single immunoglobulin-domain protein required for clustering acetylcholine receptors in C. elegans. The EMBO Journal. 30 (4), 706-718 (2011).
  18. Kim, S., Sieburth, D. A receptor tyrosine kinase network regulates neuromuscular function in response to oxidative stress in Caenorhabditis elegans. Genetics. 211 (4), 1283-1295 (2019).
  19. Oh, K., Kim, H. Aldicarb-induced paralysis assay to determine defects in synaptic transmission in Caenorhabditis elegans. Bio-Protocol. 7 (14), 2400(2017).
  20. Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

24

Похожие статьи