В настоящем протоколе изложены методы проведения крупномасштабного гравитаксисового анализа с личинками Caenorhabditis dauer. Этот протокол позволяет лучше обнаруживать поведение гравитаксиса по сравнению с анализом на основе пластин.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Крупномасштабный гравитационный анализ личинок Caenorhabditis Dauer
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Ощущение гравитации является важным и относительно недостаточно изученным процессом. Ощущение гравитации позволяет животным ориентироваться в окружающей среде и облегчает движение. Кроме того, гравитационное ощущение, которое возникает во внутреннем ухе млекопитающих, тесно связано со слухом - таким образом, понимание этого процесса имеет значение для слуховых и вестибулярных исследований. Гравитаксисовые анализы существуют для некоторых модельных организмов, включая дрозофилу. Одиночные черви ранее были проанализированы на предмет их предпочтения ориентации, когда они оседают в растворе. Тем не менее, надежный и надежный анализ для Caenorhabditis gravitaxis не был описан. Настоящий протокол описывает процедуру выполнения гравитаксис-анализов, которые могут быть использованы для тестирования сотен caenorhabditis dauers одновременно. Этот крупномасштабный, дальний анализ позволяет собирать подробные данные, выявляя фенотипы, которые могут быть пропущены в стандартном анализе на основе пластин. Движение Dauer вдоль вертикальной оси сравнивается с горизонтальными элементами управления, чтобы гарантировать, что направленное смещение обусловлено гравитацией. Затем гравитактическое предпочтение можно сравнить между штаммами или экспериментальными условиями. Этот метод может определить молекулярные, клеточные и экологические требования к гравитакси у червей.
Введение
Ощущение гравитационного притяжения Земли имеет решающее значение для ориентации, движения, координации и равновесия многих организмов. Однако молекулярные механизмы и нейросхема гравитационного ощущения плохо изучены по сравнению с другими органами чувств. У животных гравитационное ощущение взаимодействует и может быть вытеснено другими стимулами для влияния на поведение. Визуальные сигналы, проприоцептивная обратная связь и вестибулярная информация могут быть интегрированы для создания чувства осознания тела относительно окружения животного 1,2. И наоборот, гравитактическое предпочтение может быть изменено п....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Штаммами, используемыми в настоящем исследовании, являются C. elegans (N2) и C. briggsae (AF16) (см. Таблицу материалов). Для каждого анализа использовалась разнополая популяция дауэров.
1. Подготовка камеры
- Работайте в вытяжном шкафу. Настройте рабочее пространство с горелкой Бунзена, 1-2 бритвенными лезвиями, плоскогубцами, пинцетом и пластиковой режущей поверхностью (см. Таблицу материалов).
- Для каждой камеры соберите две серологические пипетки по 5 мл. Снимите ватную пробку с одной пипетки пинцетом. Держите лезвие бритвы над горелкой Бунзена до нагр....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Сравнение гравитаксиса между видами
Следуя процедуре, описанной выше, C. briggsae dauer gravitaxis можно сравнить с C. elegans gravitaxis и горизонтальными регуляторами. Вертикальное распределение (бордовый) C. briggsae dauers наклонено к вершинам камер, при этом большой процент червей достигает +7 (рисунок 2A). В отличие от горизонтальных элементов управления (aqua), в которых дауэры распределены по примерно колоколообразной кривой вокруг центр.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Сравнение с предыдущими методами
В отличие от хемотаксиса, гравитаксис при кенорхабдите не может быть надежно обнаружен с использованием традиционной экспериментальной конструкции агаровой пластины. Стандартная чашка Петри имеет диаметр 150 мм, в результате чего только 75 мм доступны в любом направлении для dauers, чтобы продемонстрировать предпочтения гравитаксиса. Хотя ориентационные предпочтения C. elegans могут быть проанализированы в растворе12, этот мето.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.
Благодарности
Это исследование было поддержано исследовательскими грантами от Национальных институтов здравоохранения для JHR (#R01 5R01HD081266 и #R01GM141493). Некоторые штаммы были предоставлены CGC, который финансируется Управлением исследовательских инфраструктурных программ NIH (P40 OD010440). Мы хотели бы поблагодарить Прадипа Джоши (UCSB) за его редакционный вклад. Статистические консультации, предоставляемые UCSB DATALAB.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1% раствор | Из запаса 10% (w/v) SDS в деионизированной воде | ||
| 15 мл Центрифужные пробирки | Falcon | 14-959-53A | |
| 3 мм Шестигранный ключ | Можно использовать другие металлические инструменты аналогичного размера | ||
| 4% Агар в нормальной питательной среде (NGM) - 1 л | Перед автоклавированием: 3 г NaCl, 40 г агара, 2,5 г пептона, 2 г декстрозы, 10 мл урацила (2 мг/мл), 500 г; L Холестерин (10 мг/мл), 1 мл CaCl2, 962 мл DI воды; После автоклавирования: 24,5 мл фосфатного буфера, 1 мл 1 MgSO4 (1 М), 1 мл стрептомицина (200 мг/мл) | ||
| 5 мл Серологические пипетки | Fisherbrand | S68228C | полистирол, а не боросиликатное стекло |
| 60% раствор | 60% сахарозы (w/v) в деионизированной воде; стерилизовать фильтрацией (0,45 мкм; м). Держитесь при 4 °deg; C | ||
| AF16 C. briggsae или другой экспериментальный штамм | Доступно в CGC (Центр генетики Caenorhabditis) | ||
| Горелка | |||
| Пищевая пленка | Fisherbrand | 22-305654 | |
| Клиническая центрифуга | |||
| Одноразовые бритвенные лезвия | Fisherbrand | 12-640 | |
| Фарадея | может быть изготовлена из картона и алюминиевой фольги; 30" Д x 6" Ш x 26" В или больше | ||
| Чернильные маркеры | Sharpie или другой марки для маркировки на пластиковой | ||
| маркировочной ленте | Carolina | 215620 | |
| M9 буфер | 22 мМ KH2PO4, 42 мМ штамм Na2HPO4, 86 мМ штамм | ||
| N2 C. elegans | Доступно в CGC (Caenorhabditis Genetics Center) | ||
| NGM планшеты с OP50 | 1,7% (w/v) агаром в NGM (см. описание: 4% агар в NGM). Семена с | ||
| парафиновой пленкой | OP50 Bemis | 13-374-10 | |
| Пластиковая разделочная доска | |||
| Плоскогубцы | |||
| Вращающийся вертикальный миксер | BTLab SYSTEMS | BT913 | С трубкой 22 x 15 мл |
| Серологическая пипетка | Corning | 357469 | |
| Стереомикроскоп | Laxco | S2103LS100 | |
| Счетчик тала | ULINE | H-7350 | |
| Густой NGM/агаровый тарелочный фильтр - 1 л | Смотрите 4% агар в рецепте NGM; замените 40 г агара на 20 г Агаровый | ||
| пинцет |
Ссылки
- Peterka, R. J. Sensory integration for human balance control. Handbook of Clinical Neurology. 159, 27-42 (2018).
- Lacquaniti, F., et al. Multisensory Integration and Internal Models for Sensing Gravity Effects in Primates. BioMed Researc....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
