Настоящий протокол описывает оптимизированную процедуру культивирования гемопоэтических стволовых и клеток-предшественников (HSPC) для надежного приживления генетически отредактированных клеток in vivo.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
CRISPR/Cas9 Редактирование генов гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток для применения генной терапии
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
CRISPR/Cas9 является очень универсальным и эффективным инструментом редактирования генов, широко используемым для коррекции различных генетических мутаций. Возможность генных манипуляций с гемопоэтическими стволовыми и прогениторными клетками (HSPCs) in vitro делает HSPC идеальной клеткой-мишенью для генной терапии. Однако HSPC умеренно теряют свой потенциал приживления и многолинейной репопуляции в культуре ex vivo . В настоящем исследовании описаны идеальные условия культивирования, которые улучшают приживление HSPC и генерируют увеличенное количество генно-модифицированных клеток in vivo. В текущем отчете показаны оптимизированные условия культивирования in vitro , включая тип питательных сред, уникальные добавки коктейля с малыми молекулами, концентрацию цитокинов, пластины клеточной культуры и плотность культуры. В дополнение к этому, оптимизированная процедура редактирования генов HSPC, наряду с проверкой событий редактирования генов, предоставляется. Для валидации in vivo отображается генетически отредактированная инфузия HSPCs и анализ после приживления у реципиентов мышей. Результаты показали, что система культивирования увеличивает частоту функциональных ГСК in vitro, что приводит к надежному приживлению генетически отредактированных клеток in vivo.
Введение
Недоступность для доноров, соответствующих лейкоцитарному антигену человека (HLA), в условиях аллогенной трансплантации и быстрое развитие очень универсальных и безопасных инструментов генной инженерии делают аутологичную трансплантацию гемопоэтических стволовых клеток (HSCT) лечебной стратегией лечения наследственных заболеваний крови 1,2. Аутологичная генная терапия гемопоэтическим стволовым и прогениторным клетками (HSPC) включает в себя сбор HSPC пациентов, генетические манипуляции, коррекцию болезнетворных мутаций и трансплантацию генно-скорректированных HSPC пациенту 3,4
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Эксперименты in vivo на иммунодефицитных мышах были одобрены и проведены в соответствии с руководящими принципами Комитета по этике животных Института (IAEC), Христианского медицинского колледжа, Веллор, Индия. Образцы периферической крови, мобилизованные гранулоцитарным колониестимулирующим фактором (G-CSF), были взяты у здоровых доноров человека с информированного согласия после получения одобрения Институционального наблюдательного совета (IRB).
1. Выделение мононуклеарных клеток периферической крови (PBMNC) и очистка CD34 + клеток
- Выполните изоляцию PBMNC, выполнив следующие действия.
ПР....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Настоящее исследование определяет идеальные условия культивирования HSPC, которые облегчают удержание CD34 + CD133 + CD90 + HSC в культуре ex vivo. Чтобы продемонстрировать обогащение культуры ГСК наряду с усиленной генерацией генно-модифицированных ГСК, приведены оптимизированные процедуры выделения PBMNC, очистки клеток CD34+, культуры, редактирования генов, трансплантации, характеристики приживления и генно-модифицированных клеток in vivo (
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Успешный результат генной терапии HSPC зависит преимущественно от качества и количества приживляемых ГСК в трансплантате. Тем не менее, функциональные свойства ГСК сильно влияют на подготовительном этапе продуктов генной терапии, в том числе культурой in vitro и токсичностью, связанной с процедурой генной манипуляции. Чтобы преодолеть эти ограничения, мы определили идеальные условия культивирования HSPCs, которые сохраняют стволовысть CD34 + CD133 + CD90 + HSC в культуре ex v.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что конкурирующих финансовых интересов не существует.
Благодарности
Авторы хотят отметить персонал установки проточной цитометрии и животноводческой установки CSCR. A.C. финансируется стипендией ICMR-SRF, K.V.K. финансируется стипендией DST-INSPIRE, а P.B. финансируется стипендией CSIR-JRF. Эта работа финансировалась Департаментом биотехнологии правительства Индии (грант No BT/PR26901/MED/31/377/2017 и BT/PR31616/MED/31/408/2019)
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 4D-нуклеофлектор® X Unit | LONZA BIOSCIENCE | AAF-1003X | |
| 4D-Nucleofector™ X Kit ( 16-луночный Nucleocuvette™ Полоски) | LONZA BIOSCIENCE | V4XP-3032 | |
| Антибиотик-антимикотик (100X) | THERMO SCIENTIFIC 15240096 | ||
| Античеловеческий CD45 APC | BD BIOSCIENCE | 555485 | |
| Античеловеческий CD13 PE | BD BIOSCIENCE | ||
| Античеловеческий CD19 PerCP | BD BIOSCIENCE | ||
| Античеловеческий CD3 PE-Cy7 | BD BIOSCIENCE | 557749 | |
| Античеловеческий CD90 APC | BD BIOSCIENCE | ||
| 561971 Античеловеческий CD133/1 | Miltenyibiotec | 130-113-673 | |
| Античеловеческий CD34 PE | BD BIOSCIENCE | ||
| Антимышиный CD45.1 PerCP-Cy5 | BD BIOSCIENCE | 560580 | |
| Облучатель крови-2000 | BRIT (Департамент биотехнологии, Индия) | BI 2000 | |
| Чашка для клеточных культур (дельта-обработанные поверхности 6-луночные планшеты) | NUNC (THERMO SCIENTIFIC) | ||
| CrysoStor CS10 | BioLife solutions | #07952 | |
| Бусульфан | CELON LABS (60мг/10мл) | - | |
| Рекомбинант Cas9 | TAKARA BIO | 632640 | |
| Cas9-eGFP | SIGMA | C120040 | |
| Пробирка для центрифуги-15мл | CORNING | 430790 | |
| Пробирка центрифуга-50мл | NUNC (THERMO SCIENTIFIC) | ||
| DMSO | MPBIO | 219605590 | |
| ДНКазы | STEMCELL TECHNOLOGIES | 6469 | |
| Dulbecco′ s Фосфатный буферный физиологический раствор - 1X | HYCLONE | SH30028.02 | |
| EasySep™ Набор для положительного отбора CD34 человека II | STEMCELL TECHNOLOGIES | 17856 | |
| Магнит EasySep | STEMCELL TECHNOLOGIES | 18000 | |
| Электрофорез | ORANGE ИНДИЯ | HDS0036 | |
| FBS | THERMO SCIENTIFIC | ||
| Проточный цитометр – ARIA III | BD BIOSCIENCE | -  | |
| FlowJo | BD BIOSCIENCE | - | |
| Flt3-L | PEPROTECH | 300-19-1000 | |
| Система визуализации геля | CELL BIOSCIENCES | 11630453 | |
| реагент HighPrep DTR | MAGBIOGENOMICS | DT-70005 | |
| Human BD Fc Block | BD BIOSCIENCE | 553141 | |
| IL6 | PEPROTECH | 200-06-50 | |
| IMDM медиа | THERMO SCIENTIFIC | 12440053 | |
| Инфракрасная лампа | MURPHY-Инсулин | ||
| шприц 6мм 31Г | BD BIOSCIENCE | ||
| Кетамин | KETMIN 50-Loading | ||
| краситель 6X | TAKARA BIO | 9156 | |
| Lymphoprep | STEMCELL TECHNOLOGIES | 7851 | |
| Мышиный ограничитель | AVANTOR | TV-150 | |
| Нанокапельный спектрофотометр | THERMO SCIENTIFIC | ND-2000C | |
| Камера подсчета клеток Нейбауэра | ROHEM INSTRUMENTS | CC-3073 | |
| NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) | Лаборатория Джексона | RRID:IMSR_JAX:005557 | |
| NOD,B6. SCID Il2rγ &минус;/&минус; KitW41/W41 (NBSGW) | Лаборатория Джексона | RRID:IMSR_JAX:026622 | |
| Nunc дельта 6-луночная пластина | THERMO SCIENTIFIC | 140675 | |
| Полистирольная трубка с круглым дном | BD | 352008 | |
| P3 первичная клетка Нуклеофекционный раствор | LONZA BIOSCIENCE | PBP3-02250 | |
| Пипетка Пастера | FISHER SCIENTIFIC | 13-678-20A | |
| Набор для очистки ПЦР | TAKARA BIO | 740609.25 | |
| Клетка для мышиного пирога | FISCHER SCIENTIFIC | 50-195-5140 | |
| полистирольная трубка с круглым дном (12 x 75 мм) | STEMCELL TECHNOLOGIES | 38007 | |
| Primer3 | Институт биомедицинских исследований Уайтхеда | https://primer3.ut.ee/ | |
| QuickExtract™ Раствор для экстракции ДНК | Lucigen | QE09050 | |
| Reserveratrol | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72862 | |
| SCF | PEPROTECH | 300-07-1000 | |
| SFEM-II | STEMCELL TECHNOLOGIES | 9655 | |
| sgRNA | SYNTHEGO- | ||
| SPINWIN | TARSON | 1020 | |
| StemReginin 1 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72342 | |
| Инструмент для анализа ICE | SYNTHEGO | a href="https://ice.synthego.com/">https://ice.synthego.com/ | |
| Tris-EDTA буферный раствор (TE) 1X | SYNTHEGO | Поставляется с гРНК | |
| Термоамплификатор | APPLIED BIOSYSTEMS | 4375305 | |
| ТПО | PEPROTECH | 300-18-1000 | |
| Трипановый синий | HIMEDIA LABS | TCL046 | |
| UM171 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72914 | |
| UM729 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72332 | |
| Ксилазин | КСИЛАКСИН - INDIAN IMMUNOLOGICALS LIMITED | - T |
Ссылки
- Staal, F. J. T., Aiuti, A., Cavazzana, M. Autologous stem-cell-based gene therapy for inherited disorders: State of the art and perspectives. Frontiers in Pediatrics. 7, 443(2019).
- Naldini, L. G....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
