Закупка и децеллюляризация задних конечностей крыс с использованием биореактора ex vivo на основе перфузии для васкуляризированной композитной аллотрансплантации

VCA является новым вариантом для пациентов, нуждающихся в сложной хирургической реконструкции. Травматические повреждения или резекции опухоли приводят к потере объемной ткани, которую может быть трудно реконструировать. VCA предлагает трансплантацию нескольких тканей, таких как кожа, кости, мышцы, нервы и сосуды, в качестве композитного трансплантата от донора к реципиенту¹. Несмотря на свой многообещающий характер, VCA ограничен из-за длительных иммуносупрессивных схем. Пожизненное применение таких препаратов приводит к повышению риска оппортунистических инфекций, злокачественных новообразований и токсичности конечных органов ^1,2,3. Чтобы помочь уменьшить и / или устранить потребность в иммуносупрессии, тканеинженерные каркасы, использующие подходы к децеллюляризации для VCA, показывают большие перспективы.

Децеллюляризация тканей влечет за собой сохранение структуры внеклеточного матрикса при удалении клеточного и ядерного содержимого. Этот децеллюляризованный каркас может быть повторно заселен специфическими для пациента клетками⁴. Однако сохранение ECM-сети композитных тканей является дополнительной проблемой. Это связано с наличием нескольких типов тканей с различной плотностью тканей, архитектурой и анатомическим расположением в каркасе. Настоящий протокол предлагает хирургическую технику и метод децеллюляризации для задних конечностей крыс. Это доказательство концепции для применения этой техники тканевой инженерии к композитным тканям. Это также может побудить к последующим усилиям по регенерации композитных тканей путем рецеллюляризации.

Трупные самцы крыс Льюиса (300-430 г), полученные из Научно-исследовательского института больницы общего профиля Торонто, использовались для всех экспериментов. Для всех хирургических процедур для поддержания асептической техники использовались стерильные инструменты и расходные материалы (см. Таблицу материалов). Все процедуры были выполнены в соответствии с руководящими принципами Комитета по уходу за животными в Научно-исследовательском институте больниц общего профиля Торонто, Сеть университетского здравоохранения (Торонто, Онтарио, Канада). В общей сложности четыре задних конечности были децеллюляризированы.

1. Предоперационная подготовка

1. Готовят 50 мл 5% гепаринизированного физиологического раствора. Из солевого мешка объемом 50 мл выньте 2,5 мл физиологического раствора с помощью шприца объемом 5 мл и выбросьте. Используя шприц объемом 5 мл, добавьте 2,5 мл гепарина в солевой мешок. Переверните солевой мешок, чтобы перемешать его содержимое.
2. Поместите трупную крысу в лежачее положение под синей подушечкой. Побрейте заднюю конечность и область паха по окружности с помощью электробритвы и удалите волосы.
3. Приведите крысу на хирургическую станцию и нанесите раствор скраба йода Повидона марлей на заднюю конечность и паховую область. Затем нанесите 70% изопропиловый спирт, чтобы вытереть раствор скраба марлей.
4. Отбросьте синюю прокладку с шага 1.2 и переодевайте в новые, стерильные перчатки.

2. Заготовка задних конечностей крыс

1. Сделайте разрез кожи с помощью хирургического лезвия No 10 и лезвия No 3 вдоль уровня паховой связки, двигаясь от бокового к медиальному направлению (рисунок 1A). Используйте щипцы Adson, чтобы удерживать окружающую кожу, чтобы обеспечить гладкий разрез.
2. Когда основной жир обнажается, используйте тупое рассечение, чтобы тщательно рассечь жир. Найдите верхние эпигастральные сосуды.
3. Используйте микроциссоры для проксимального рассечения и обнажения подлежащего бедренного нерва, артерии и вены на уровне паховой связки.
4. Под рассеченным микроскопом идентифицируют бедренные сосуды и рассекают артерию и вену проксимально с помощью тонких щипцов для получения достаточной длины от точек бифуркации артериальной сети (рисунок 1B).
5. Обжигайте бедренную артерию и вену отдельно с помощью 6-0 швов.
6. Проводят окружное рассечение вокруг остальной части заднего сгиба, не нарушая перевязанные бедренные сосуды.
7. Трансекция бедренной кости средней длины с помощью костяного резака.
8. Чтобы полностью изолировать задний край, перерефектируйте перевязанные бедренные сосуды ниже лигатур с помощью микросублиц.
9. Каннулировать бедренную артерию с помощью ангиокатетера 24 Г под рассеченным микроскопом. Используйте тонкие щипцы, чтобы аккуратно вставить канюлю. Промывайте гепаринизированным физиологическим раствором до тех пор, пока не будет наблюдаться прозрачный отток из бедренной вены.
10. Закрепите канюлю, завязав один шов вокруг канюлированного сосуда и еще один шов дистально вокруг самой канюли. Убедитесь, что канюля расположена проксимально, чтобы предотвратить блокирование точек бифуркации.
11. Погружайте полученные задние конечности в фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS) до децеллюляризации.

Рисунок 1: Закупка задних конечностей крыс. (А) Маркировка разреза кожи на уровне паховой связки от латеральной до медиальной. (B) Вид бедренной вены и бедренной артерии, которые были рассечены проксимально к паховой связке, обозначенной пунктирной линией. Сокращения: L = латеральный; M = медиальный; FV = бедренная вена; ФА = бедренная артерия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

3. Приготовление растворов

1. В стеклянной колбе объемом 6 л приготовьте 5-литровый резервуар моющего средства с 0,25% додецилсульфата натрия (SDS), растворив 12,5 г порошка SDS в 5 л сверхчистой дистиллированной воды. Накройте отверстие колбы парапленкой, чтобы запечатать ее.
2. В стеклянной банке объемом 1 л приготовить 1 л 0,25% раствора SDS отдельно, растворив 2,5 г SDS в 1 л сверхчистой дистиллированной воды. Добавьте перемешивание, чтобы перемешать раствор на магнитной мешалке, пока все SDS не растворится.
3. Приготовьте 1 л 1 промывочного раствора PBS с 1% раствором антибиотика-антимикотика (АА). В колбу объемом 1 л добавьте 990 мл 1 раствора PBS и 10 мл АА.
4. Отдельно в стеклянной банке объемом 500 мл снова приготовьте 1x PBS + 1% раствор AA, используя 495 мл 1x раствора PBS и 5 мл AA.
5. Приготовьте 200 мл 1% раствора перуксусной кислоты (PAA)/4% этанола (EtOH). Приготовьте этот раствор под вытяжным кожухом.

4. Построение биореактора и перфузионного контура

ПРИМЕЧАНИЕ: Конфигурация биореактора и перфузионного контура на всех перечисленных этапах приведена на рисунке 2 .

1. В камере объемом 500 мл (пластиковый контейнер) просверлите три отверстия (1/4 дюйма) в маркированных местах на рисунке 2: Порт A - это впускная линия, Порт B - линия пополнения, а Порт C - выходная линия. Удалите и выбросьте лишний пластик. Распылите и протрите камеру 70% этанолом.
2. Вырежьте три силиконовые трубки длиной 5 см и вставьте по одной наполовину в каждый порт камеры. Соедините разъем Luer на отверстии порта A, обращенном к внутренней части камеры, и женский разъем Luer на другом конце трубки снаружи камеры.
3. Подключите гнездовой разъем Luer в порту B и порту C на концах труб, выходящих из камеры.
4. В герметичной крышке для пластикового контейнера просверлите одно отверстие на поверхности крышки.
5. Вырежьте силиконовую трубку размером 3 см и вставьте ее в отверстие крышки. Убедитесь, что приблизительно 2 см трубки расположено из крышки, как показано на рисунке 2.
6. Стерилизуйте камеру и крышку трубкой.
7. Вырежьте две силиконовые трубки по 30 см ножницами. Подключите 1/16 дюйма к разъему 1/8 дюйма на одном конце каждой трубки.
8. Отдельно вырежьте две силиконовые трубки по 12 см ножницами. Подключите 1/16 дюйма к разъему 1/8 дюйма на одном конце обеих трубок. Подключите разъем Luer на другом конце одной трубки и женский разъем Luer к другой трубке.
9. Стерилизуйте весь трубчатый материал на стадии 4.7 и стадии 4.8. Включите в стерилизацию две 3-ступенчатые насосные трубки (1,85 мм).
10. Подготовьте три 3-позиционных запорных крана, один шприцевой фильтр, две серологические пипетки 1 мл и один шприц 10 мл для установки децеллюляризации. Снимите фильтр с серологических пипеток объемом 1 мл.

Рисунок 2: Подготовка биореактора и построение перфузионного контура. Показана аппаратура перфузионного контура, включающая (А) перистальтический насос и (В) соответствующие кассеты как для впускных, так и для выпускных линий. (С, Г) Силиконовые трубки размером 12 см и 30 см также показаны с соответствующими разъемами. (E) Трубки для перистальтического насоса (1,85 мм). Камера биореактора с маркированными отверстиями для притока (F), (G) пополнения порта и (H) оттока. I) Крышка биореактора с вентиляционным отверстием. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

5. Децеллюляризация задних конечностей крыс

1. Поместите стерилизованную камеру и винт на три одноразовых 3-ходовых запорных крана на входной, выходной и пополняющей линиях. Убедитесь, что запорный кран для порта пополнения закрыт в оставшихся двух портах, чтобы предотвратить утечку.
2. Прикрепите трубы, выполненные на шаге 4.8, к запорным кранам на входной и выходной линиях.
3. Подключите перистальтические трубки к трубкам на шаге выше. Закрепите кассету на перистальтической трубке и поместите ее на перистальтический насос. Пока не закрепляйте кассеты с трубкой на месте.
4. Подключите одну трубку от стадии 4.7 к концу перистальтической трубки выпускной линии от шага выше. Подключите серологическую пипетку объемом 1 мл на другом конце. Подвешивайте конец, прикрепленный серологической пипеткой в колбе резервуара для отходов.
5. Повторите шаг 4.7 для входной линии. Подвесьте конец трубки, прикрепленной к серологической пипетке, в резервуар для моющего средства. Немедленно запечатайте отверстие колбы резервуара моющего средства парапленкой. Смотрите рисунок 3A,B для обзора схемы децеллюляризации.
6. Добавьте 0,25% SDS из стеклянной банки объемом 1 л (этап 3.2) в камеру биореактора на половине уровня.
7. Возьмите закупленный задний налим с помощью щипцов Adson и осторожно подвешивайте его в камере биореактора.
8. Используйте две пары щипцов Adson, чтобы направить канюлированную часть задней конечности к входной линии. Удерживая канюлю одной парой щипцов, используйте другую пару щипцов, чтобы закрутить и закрепить впускную линию к канюле. Убедитесь, что канюля не вытягивается и не скручивается, чтобы предотвратить деканнуляцию.
9. После закрепления добавьте еще 0,25% SDS из стеклянной банки объемом 1 л, чтобы полностью погрузить конечность, по мере необходимости. Убедитесь, что выходной порт также погружен в резервуар биореактора, чтобы обеспечить поддержание постоянного оттока (рисунок 3C).
10. Прикрепите одноразовый шприцевой фильтр к вентиляционному отверстию на крышке камеры биореактора, ссылаясь на этапы 4.4 и 4.5.
11. Закрепите крышку биореактора и убедитесь, что камера герметизирована со всех сторон (рисунок 3B).
12. Чтобы удалить воздух из трубки и загрунтовать перфузионный контур, используйте новый одноразовый шприц объемом 10 мл для извлечения моющего средства из резервуара моющего средства с помощью 3-позиционного запорного крана на входной линии.
13. После рисования используйте ту же жидкость для вставки в 3-полосный запорный кран на выходной линии. Убедитесь, что моющее средство присутствует по всей трубке как на входной, так и на выходной линиях.
14. Прижмите и закрепите кассеты трубкой в перистальтическом насосе. Включите перистальтический насос с помощью кнопки питания.
    1. На экране перистальтического насоса перейдите ко второй вкладке с помощью клавиши со стрелкой, чтобы установить скорость перфузии для первого канала. Входной расход как способ подачи и установить скорость перфузии на уровне 1 мл/мин. Убедитесь, что направление потока правильное в соответствии с настройкой аппарата. Повторите для второго канала.
    2. Откалибруйте перистальтический насос, чтобы убедиться, что количество жидкости, подаваемой через впускную линию и/или взятой из выходной линии, течет с постоянной скоростью между ними. Убедитесь, что для идентификатора трубки установлено значение 1,85 мм.
15. Начните децеллюляризацию с помощью перфузии машины со скоростью 1 мл /мин для входной и выходной линий, нажав кнопку питания на клавиатуре. Контролируйте и убедитесь, что поток является последовательным и непрерывным как на входной, так и на выходной линиях.
16. Продолжайте децеллюляризацию и ежедневно контролируйте. Используйте 1 л 0,25% SDS (шаг 3.2) для пополнения резервуара биореактора через порт пополнения по мере необходимости. Ищите белый, полупрозрачный вид ткани, который появится к 5 дню, что указывает на децеллюляризацию задних конечностей крысы.

Рисунок 3: Обзор схемы перфузионной децеллюляризации биореактора задних конечностей крыс. (А) Схематическое изображение перфузионной схемы биореактора. Синие стрелки указывают направление потока моющих средств и отходов. (B) Обзор схемы децеллюляризации с биореактором, содержащим заднюю конечность крыс. Резервуар SDS (левая колба) ведет в перистальтический насос и во впускную трубку биореактора. Отток подключается к резервуару для отходов (правая колба) через перистальтический насос. (C)(I) Биореактор, содержащий заднюю конечность крыс с впускной трубкой, соединенной с канюлярной бедренной артерией. II) Порт пополнения, расположенный в углу для перфузионного моющего средства. III) Трубы для оттока, подвешенные в суспензионном резервуаре. Аббревиатура: SDS = додецилсульфат натрия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

6. Постдецеллюлярная промывка и стерилизация

1. После подтверждения децеллюляризации замените резервуар моющего средства резервуаром 1x PBS + 1% AA резервуар. Запечатайте отверстие колбы парапленкой. Начинают 1x PBS + 1% перфузию АА при 1 мл/мин и продолжают в течение 2 дней.
2. Замените резервуар 1x PBS + 1% AA на 200 мл 0,1% PAA/4% EtOH резервуара и начните перфузию со скоростью 1 мл/мин в течение 2 ч.
3. Отсоедините заднюю конечность от входной линии, используя две пары стерильных щипцов Адсона, причем одна пара щипцов скручивает впускную линию, а другая удерживает канюлю. Убедитесь, что канюля не вытягивается, чтобы предотвратить деканнуляцию.
4. Храните конечность в стеклянной банке объемом 500 мл, содержащей 1x PBS + 1% AA при 4 °C до дальнейшего использования.

Протокол закупок был успешным в изоляции и каннулировании общих бедренных артерий для последующих этапов перфузии. Репрезентативные изображения рассечения на рисунке 1A,B показывают расположение разреза и экспозицию бедренных сосудов на достаточном расстоянии от точек бифуркации. На фиг.2 показано устройство, необходимое для подготовки биореактора и перфузионного контура. Конечную точку децеллюляризации определяли путем наблюдения за белым, полупрозрачным видом ткани. Машинная перфузионная система ex vivo была успешной в перфузионной децеллюляризации задней конечности крысы. Поддерживалась однопроходная замкнутая системная схема (рисунок 3). Грубая морфология нативной задней конечности изменилась на белый, бледный вид через 5 дней перфузии SDS 0,25% (рисунок 4).

Удаление клеточного содержимого наблюдалось при окрашивании гематоксилином и эозином (H&E) в бедренные сосуды, кожу, нервы, кости и мышцы, где не было обнаружено ядер. Структуры каждой тканевой структуры были проанализированы относительно нативной ткани. Как децеллюляризированная бедренная артерия, так и вена показали потерю ядерного содержимого во всех слоях и окружающей соединительной ткани, учитывая отсутствие окрашенных синим цветом ядер, в противном случае присутствующих в нативных сосудах (рисунок 5A, B и рисунок 5D, E). Оболочка интима, среда и адвентиция как бедренной вены, так и артерий поддерживались в децеллюляризированных сосудах (рисунок 5D, E). Бедренный нерв показал сохранение структуры ткани, включая эндоневрий (рисунок 5C и рисунок 5F). Кость сохранила свою общую структуру ткани после децеллюляризации, с наблюдаемой потерей окрашенных ядер остеоцитов из кости и из окружающих слоев эндостеума и надкостницы (рисунок 5G и рисунок 5J). Кожа показала потерю клеток из эпидермиса и дермы. Дерма показала сохраненные коллагеновые волокна, похожие на нативные ткани кожи (рисунок 5H и рисунок 5K). Наконец, поперечный вид скелетных мышц показал потерю ядер, расположенных на периферии эндомизия. Содержание миофибры оставалось сохраненным в соответствующих фасцикулах после децеллюляризации (рисунок 5I и рисунок 5L). Также была проведена количественная оценка ДНК с использованием Picogreen, где содержание ДНК было значительно снижено в бедренных сосудах, нервах, коже, мышцах и костях (рисунок 6).

Рисунок 4: Грубая морфология нативных и децеллюляризованных задних конечностей крыс. (А) Бедренная артерия нативного заднего сцепления с ангиокатетером 24 G после закупки. (B) Белый, полупрозрачный вид задних конечностей после 5 дней децеллюляризации с 0,25% SDS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Гистологическое окрашивание тканей задних конечностей крыс с использованием гематоксилина и эозина. H&E-окрашенная нативная (верхняя панель) и децеллюляризированная (нижняя панель) (A, D) бедренная вена и (B, E) артерия, (C, F) нерв, (G, J) кость, (H, K) кожа и (I, L) мышца. Потеря ядер и клеточного содержимого видна во всех децеллюляризованных образцах. Шкала стержней = 200 мкм (сосуды, нервы, кости) и 300 мкм (кожа, мышцы). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Количественная оценка ДНК нативных и децеллюляризованных тканей задних конечностей крыс. Содержание ДНК снижается в нативных и децеллюляризованных сосудах, нервах, мышцах, коже и костях, выражаясь в сухом весе нг/мг. Ткани сушили и переваривали в папаине в течение ночи при 65 °C. ДНК была флуоресцентно обнаружена с помощью PicoGreen. Было проведено несколько непарных Т-тестов. Данные представлены в виде среднего значения ± SD. **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Сокращения: N = родной; D = децеллюляризированный. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

У авторов нет конфликта интересов, о которых можно было бы заявить.