Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Стратегия изучения IL-9-продуцирующих лимфоидных клеток в модели инфекции Nippostrongylus brasiliensis

1.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/64075

⸱

3 марта 2023 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Departamento de Biología Celular y del Desarrollo, Instituto de Fisiología Celular, Universidad Nacional Autónoma de México

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

IL-9-экспрессирующие Т- и ILC2-клетки индуцируются во время инфекции N. brasiliensis , однако их характеристика в значительной степени упускается из виду в инфицированном кишечнике из-за их низкой частоты и дифференциальной кинетики. Этот протокол описывает выделение этих клеток из разных органов-мишеней и подтверждение их идентичности с помощью проточной цитометрии на разных стадиях инфекции.

Аннотация

IL-9 представляет собой плейотропный цитокин, связанный с различными процессами, включая противоопухолевый иммунитет, индукцию аллергических патологий и иммунный ответ против гельминтозных инфекций, где он играет важную роль в изгнании паразита. В мышиной модели инфекции Nippostrongylus brasiliensis IL-9 продуцируется в основном CD4+ Т-лимфоцитами и врожденными лимфоидными клетками, обнаруженными в легких, тонкой кишке и дренирующих лимфатических узлах. Учитывая технические трудности, связанные с внутриклеточным окрашиванием IL-9, а также сложность выделения гемопоэтических клеток из тонкой кишки при инфекции, существует острая необходимость во всеобъемлющем, но простом протоколе для анализа экспрессии IL-9 в различных лимфоидных и нелимфоидных тканях в этой модели. Описанный здесь протокол описывает кинетику IL-9, продуцируемого CD4+ Т-клетками и врожденными лимфоидными клетками в легких и тонкой кишке, основных органах, на которые нацелен N. brasiliensis, а также в средостении и брыжеечных лимфатических узлах, на протяжении всей инфекции. Кроме того, в нем подробно описывается количество личинок, необходимых для заражения, в зависимости от типа клеток и интересующего органа. Этот протокол направлен на то, чтобы помочь в стандартизации анализов, чтобы сэкономить время и ресурсы, предлагая возможность сосредоточиться на конкретных клетках, органах и стадиях заболевания, представляющих интерес в модели инфекции N. brasiliensis.

Введение

Анкилостомы — это кишечные паразиты, которые заражают около 700 миллионов человек во всем мире, в основном в тропических районах слаборазвитых стран. Инфекции высокой интенсивности, вызванные анкилостомой двенадцатиперстной кишки и Necator americanus, наиболее распространенными паразитами анкилостомы у людей, вызывают анемию и дефицит белка, что может привести к задержке роста и умственного развития1. N. americanus и паразит грызунов Nippostrongylus brasiliensis индуцируют прототип иммунного ответа типа 2 у своего хозяина и имеют сходство в своем жизненном цикле. Следовательно, заражение мышей N. brasiliensis является наиболее часто используемой моделью для инфекций анкилостомы человека. Стадия 3 (L3): Инфекционные личинки N. brasiliensis перемещаются из кожи в легкие в первые несколько часов после заражения. Попав в легкое, они становятся L4 и мигрируют вверх по трахее, чтобы проглотиться, пройти через желудок и достичь кишечника, чтобы стать взрослыми (L5) в течение 4-5 дней. В кишечнике черви L5 откладывают яйца, которые выделяются с фекалиями, чтобы перезапустить жизненный циклпаразита 2.

Иммунный ответ, индуцированный N. brasiliensis , характеризуется увеличением нескольких цитокинов типа 2, включая IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 и IL-13, наряду с эозинофилией, базофилией, гиперплазией бокаловидных и тучных клеток, а также повышенной продукцией IgG1 и IgE. Большинство исследований, пытающихся идентифицировать и определить иммунные реакции, вызванные инфекцией N. brasiliensis, сосредоточены на роли IL-4 или IL-13 в этой модели3. Тем не менее, идентификация и характеристика клеток, экспрессирующих IL-9, и функция этого цитокина были в значительной степени упущены из виду, пока Licona-Limón et al. не опубликовали первое исследование, демонстрирующее критическую роль IL-9 в иммунном ответе против N. brasiliensis. Используя репортерных мышей, это исследование описало Т-клетки (в основном Т-хелперы 9) и врожденные лимфоидные клетки 2 типа (ILC2) в качестве основных клеточных подмножеств, экспрессирующих IL-9 при инфекции4.

Выделение и характеристика иммунных клеток из легких, инфицированных гельминтами, возможны, и об этом широко сообщалось 3,4. Однако из-за присущего ремоделирования тканей и производства слизи сделать это в инфицированном кишечнике оказалось технической проблемой до недавней публикации Ferrer-Font et al.5. Группа изложила протокол для выделения и анализа одноклеточных суспензий иммунных подмножеств из кишечника мышей, инфицированных Heligmosomoides polygyrus. На его основе мы стандартизировали протокол выделения и цитометрического анализа IL-9-экспрессирующих лимфоидных клеток из кишечника, инфицированного N. brasiliensis. Кроме того, мы установили кинетику IL-9 из различных клеточных источников и анатомических мест на протяжении всей инфекции.

Характеристика различных клеточных популяций, участвующих в этой инфекции, жизненно важна для более широкого понимания иммунного ответа на паразита и его взаимодействия с хозяином. Этот всеобъемлющий протокол обеспечивает четкий путь для выделения и анализа клеток, продуцирующих IL-9, из желаемых органов на интересующих стадиях заболевания, что позволяет значительно улучшить знания о роли этих клеток в инфекции N. brasiliensis и паразитарных инфекциях в целом.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты на животных, описанные здесь, были одобрены Внутренним комитетом по обращению с животными (CICUAL) Института клеточной физиологии Национального автономного университета Мексики.

ПРИМЕЧАНИЕ: Блок-схема всего протокола показана на рисунке 1.

1. Содержание мышей

  1. Используйте 8-10-недельные группы мышей, самок или самцов, размещенных в помещениях для животных с постоянной температурой и влажностью в 12-часовых циклах света/темноты, с свободным доступом к воде и пище.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе используется репортерный штамм мыши IL-9 на фоне C57BL/6, как описаноранее 4; однако можно было использовать другие репортерные штаммы IL-9 6,7,8, а также внутриклеточное окрашивание IL-9 с вариабельными результатами 9.

2. Заражение мышей

  1. Побрейте спину мышей от середины тела до основания хвоста за 1 день до заражения. Использование анестетиков не является обязательным.
  2. Подкожно инокулируют каждой мыши 200 жизнеспособных личинок N. brasiliensis третьей стадии (L3) в 100 мкл фосфатного солевого буфера (PBS)10 в нижней части спины, как описано ранее2,11, или вводят 100 мкл только PBS в качестве контроля. Принесите животных в жертву на 4-й, 7-й или 10-й день после заражения.

3. Выделение легких, тонкой кишки, средостения и брыжеечных лимфатических узлов

  1. Усыпить мышь вывихом шейки матки. Положите мышь на спину и сбрызните ее 70% этанолом. Сделайте разрез по средней линии с помощью ножниц и откройте кожу, чтобы обнажить брюшную и грудную области.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изофлуран может быть использован в качестве альтернативного метода эвтаназии12. Камеры с углекислым газом не рекомендуются, так как CO2 приводит к повреждению легочной ткани и кровоизлиянию13.
  2. Выделение лимфатических узлов средостения и легких
    1. Сделайте разрез на грудине и разрез в форме буквы «V», чтобы удалить ребра и грудные мышцы. После того, как грудная полость обнажена, найдите лимфатические узлы средостения рядом с пищеводом, ниже сердца (см. дополнительный рисунок 1).
    2. Извлеките лимфатические узлы средостения и соберите их в 1 мл среды R-10 (таблица 1) в 12-луночную культуральную пластину. Хранить на льду, защищенном от света до момента обработки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы должны быть защищены от света, чтобы избежать снижения флуоресцентного сигнала от мышей-репортеров, используемых в этих экспериментах.
    3. Извлеките легкие и соберите их в 1 мл среды R-10 в 12-луночную культуральную пластину на мышь. Хранить на льду, защищенном от света до момента обработки.
  3. Выделение цепей брыжеечных лимфатических узлов и тонкой кишки
    1. Обнажите брюшную полость и осторожно переместите тонкую кишку вправо, чтобы обнажить цепь брыжеечных лимфатических узлов (MLN) вдоль толстой кишки.
    2. С помощью щипцов извлеките MLN, аккуратно раскатайте его на бумажном полотенце и стяните жир.
    3. Переведите MLN в 1 мл среды R-10 в 12-луночную культуральную пластину. Хранить на льду, защищенном от света до момента обработки.
    4. Разрежьте тонкую кишку чуть ниже пилорического сфинктера и над слепой кишкой. Медленно вытащите кишечник с помощью щипцов, удалив прикрепленную брыжейку и жировую ткань.
    5. Положите тонкую кишку на бумажное полотенце и щедро смочите ее PBS. Удалите пейеровы пятна из тонкой кишки ножницами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы сохранить жизнеспособность, удалите оставшуюся жировую ткань и держите тонкую кишку влажной с помощью PBS в течение всего процесса.
    6. Разрежьте тонкую кишку продольно с помощью ножниц и аккуратно проведите щипцами по открытой кишке, чтобы удалить содержимое кала и слизь.
    7. Держите тонкую кишку щипцами и промойте ее в 5 мл PBS на льду, осторожно погрузив ее несколько раз. Повторите дважды.
    8. Разрежьте тонкую кишку на короткие кусочки (примерно 5 мм) и соберите их в коническую пробирку объемом 50 мл с 10 мл HBSS14 с 2% FBS (таблица 1). Немедленно продолжают выделять интраэпителиальные и собственные клетки пластинки.

4. Приготовление одноклеточных суспензий из тонкой кишки, легких и лимфатических узлов

ПРИМЕЧАНИЕ: Чрезвычайно важно обрабатывать не более шести мышей на человека при приготовлении одноклеточных суспензий из тонкого кишечника, так как жизнеспособность клеток значительно снижается с более длительными периодами обработки. Этот метод был адаптирован из мышиной модели5 с инфекцией Heligmosomoides polygyrus.

  1. Предварительно прогрейте встряхивающий инкубатор, среду R-20, HBSS и HBSS-2 мМ ЭДТА (таблица 1) при 37 °C.
  2. Приготовьте 10 мл среды для переваривания тонкой кишки (таблица 1) на образец.
  3. Энергично встряхните кусочки кишечника из шага 3.3.8 рукой.
  4. Отфильтруйте каждый образец через нейлоновую сетку (примерно 10 см x 10 см) над стеклянной воронкой. Промойте образец, добавив 10 мл предварительно нагретого HBSS поверх сетки, и выбросьте проточный. Повторите еще раз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте новую сетку для каждого образца и повторно используйте ее на протяжении всей процедуры.
  5. Извлеките сетку из воронки и соберите образец из сетки в коническую пробирку объемом 50 мл с 10 мл теплого HBSS-2 мМ ЭДТА (шаг 4.1). Инкубировать 10 мин при 37 °C, встряхивая при 200 об/мин.
  6. Вихревая в течение 10 с на максимальной скорости (3 200 об/мин) и фильтруйте образец с сеткой над стеклянной воронкой, восстанавливая поток в конической пробирке объемом 50 мл.
  7. Повторите шаги 4.5 и 4.6 дважды, восстанавливая проток в той же конической пробирке объемом 50 мл. Интраэпителиальные клетки расположены в этой фракции 30 мл. Сохраните оставшуюся ткань.
  8. Препарат одноклеточной суспензии из интраэпителиальных клеток
    1. Центрифугируют 30 мл клеточной суспензии, извлеченной на стадии 4.7, в концентрации 450 x g в течение 5 мин при комнатной температуре (RT). Откажитесь от надосадочной жидкости.
    2. Добавьте 5 мл PBS и центрифугу при 450 x g в течение 5 мин при ЛТ. Выбросьте надосадочную жидкость.
    3. Ресуспендируют клеточную гранулу в 3 мл RPMI 10% FBS-20 мкг / мл ДНКазы (таблица 1). Держать на льду, защищенном от света до окрашивания клеток.
  9. Препарат одноклеточной суспензии из собственных клеток пластинки
    1. Промойте оставшуюся ткань тонкой кишки с шага 4.7, налив более 10 мл теплого HBSS через сетку над воронкой. Повторите стирку. Соберите ткань из сетки в коническую пробирку объемом 50 мл с 10 мл среды для переваривания тонкой кишки.
    2. Выдерживать 30 мин при 37 °C, встряхивая при 200 об/мин. Вихрь на максимальной скорости в течение 10 с каждые 5 мин.
    3. Добавьте 10 мл буфера FACS-EDTA (таблица 1), чтобы остановить реакцию пищеварения, и поместите его на лед.
    4. Фильтруйте каждый образец через клеточный фильтр размером 100 мкм с помощью серологической пипетки, восстанавливая суспензию в конической пробирке объемом 50 мл, помещенной на лед.
    5. Центрифуга при 600 x g в течение 6 мин при 4 °C.
    6. Откажитесь от надосадочной жидкости. Промыть гранулы клетки 5 мл PBS и центрифугировать при 600 x g в течение 6 мин при 4 ° C.
    7. Откажитесь от надосадочной жидкости и ресуспендируйте клеточную гранулу в 1 мл RPMI 10% FBS-20 мкг / мл ДНКазы. Держать на льду, защищенном от света до окрашивания клеток.
  10. Препарат одноклеточной суспензии из легких
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждое легкое и тонкая кишка должны обрабатываться параллельно двумя людьми, чтобы избежать длительного времени обработки, что приводит к низкой жизнеспособности клеток.
    1. Приготовьте 4 мл среды для пищеварения легких (таблица 1) на обработанный образец.
    2. Удалите среду RPMI из лунки, содержащей легкие, из шага 3.2.3. Нарежьте легкое мелкими ножницами на мелкие кусочки.
    3. Перенесите кусочки легких в коническую трубку объемом 15 мл с помощью шпателя. Добавьте 4 мл среды для пищеварения легких (таблица 1).
    4. Инкубировать 30 мин при 37 °C, встряхивая при 250 об/мин. Когда закончите, держите на льду, пока каждый образец не будет обработан.
    5. Отфильтруйте каждый образец через клеточный сетчатый фильтр размером 100 мкм, расположенный в одной лунке 6-луночной культуральной пластины. Диссоциируйте ткань с помощью поршня шприца.
    6. Извлекают каждый образец в коническую пробирку объемом 15 мл и добавляют 4 мл среды R-2 (таблица 1). Держите на льду, пока обрабатываются другие образцы.
    7. Центрифуга при 600 x g в течение 5 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в 1 мл среды R-5 (таблица 1).
    8. Во время центрифугирования готовят 4 мл 27,5% раствора с градиентом плотности (табл. 1) на пробу для обогащения фракции гемопоэтических клеток15,16. Эта стратегия разделения отдельных ячеек является более эффективной, экономичной и менее токсичной по сравнению с другими аналогичными средами с градиентомплотности 17.
    9. Добавьте 4 мл 27,5% раствора с градиентом плотности к 1 мл клеточной суспензии с шага 4.10.7 и энергично встряхните.
    10. Медленно добавьте 1 мл среды R-5 (таблица 1) поверх смешанной суспензии, чтобы создать две фазы.
    11. Центрифуга при 1 500 x g в течение 20 мин при RT, с низким ускорением и выключенным тормозом. Обратите внимание на кольцо, образованное между двумя фазами.
    12. Восстановите кольцо, образованное между двумя фазами, с помощью микропипетки объемом 1 мл и ресуспендируйте в 4 мл среды R-2.
    13. Центрифуга при 450 x g в течение 5 мин при 4 °C. Откажитесь от надосадочной жидкости. Ресуспендировать клеточную гранулу в 1 мл буфера ACK (таблица 1) и инкубировать в течение 1 мин при ЛТ.
    14. Добавьте 4 мл среды R-5 и центрифугу при 450 x g в течение 5 мин при 4 ° C. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в 1 мл среды R-10. Хранить на льду, защищенном от света, до окрашивания для проточной цитометрии.
  11. Препарат одноклеточной суспензии из лимфатических узлов
    1. Поместите лимфатические узлы из этапов 3.2.2 или 3.3.3 между двумя кусками сетки в лунку из 6-луночной культуральной пластины и диссоциируйте с помощью поршня шприца.
    2. Восстановите клеточную суспензию в конической пробирке объемом 1,5 мл и центрифуге при 450 x g в течение 5 мин при 4 °C.
    3. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в 1 мл среды R-10. Хранить на льду, защищенном от света, до окрашивания для проточной цитометрии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если видны скопления, отфильтруйте образец через сетчатый фильтр 100 мкм.

5. Окрашивание клеток для проточной цитометрии (рис. 2 и рис. 3)

ПРИМЕЧАНИЕ: Центрифугируйте суспензию клеток лимфатических узлов с этапа 4.11.3 при 450 x g в течение 5 мин при 4 ° C и ресуспендируйте клеточную гранулу в 500 мкл буфера FACS (таблица 1).

  1. Окрашивание клеток для идентификации ILC2 (рис. 3 и дополнительный рис. 2)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура окрашивания специфична для идентификации IL-9-экспрессирующих клеток ILC2.
    1. Планшет 150 мкл на образец легкого (приблизительно 1,8 х 10 6 клеток) со стадии 4.10.14 и 50 мкл на образец лимфатического узла с этапа 4.11.3 (приблизительно 0,7 х 10 6 и 2,2 х 106 клеток для образцов средостения и брыжеечных лимфатических узлов соответственно) в 96-луночной конической нижней культуральной пластине. Добавьте 100 мкл буфера FACS и центрифугу при 450 x g в течение 5 мин при 4 °C.
    2. Планшет 100 мкл на образец тонкой кишки (приблизительно 2,7 х 10 6 и 0,6 х 106 клеток для интраэпителиальных образцов и образцов собственной пластинки, соответственно) из этапов 4.8.3 и 4.9.7 в 96-луночной конической нижней культуральной пластине. Добавьте 150 мкл буфера FACS и центрифугу при 450 x g в течение 5 мин при 4 °C.
    3. Откажитесь от надосадочной жидкости и ресуспендируйте каждую клеточную гранулу в 50 мкл коктейля биотинилированных антител (таблица 2), разбавленного в буфере FACS. Инкубировать 30 мин при температуре 4 °C в защищенном от света месте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте буфер FACS с ДНКазой 20 мкг/мл для образцов интраэпителия и собственной пластинки.
    4. Добавьте 150 мкл буфера FACS. Центрифуга при 450 x g в течение 5 мин при 4 °C.
    5. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в 200 мкл буфера FACS. Снова центрифугу и выбросьте надосадочную жидкость.
    6. Ресуспендировать клеточную гранулу в 50 мкл коктейля антитело/краситель (таблица 2) и инкубировать в течение 30 мин при 4 ° C в защищенном от света месте.
    7. Добавьте 150 мкл буфера FACS. Центрифуга при 450 x g в течение 5 мин при 4 °C.
    8. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в 200 мкл буфера FACS. Снова центрифугу и выбросьте надосадочную жидкость. Повторите промывку (этап 5.1.7) и выбросьте надосадочную жидкость.
    9. Ресуспендируют клеточную гранулу в 300 мкл буфера FACS и анализируют с помощью проточной цитометрии.
    10. Для образцов тонкой кишки и легких используйте стратегию стробирования: лимфоциты, отдельные клетки, живые клетки, гемопоэтические клетки, клетки CD90 + линии, ST2 + клетки и клетки IL-9 + (рис. 3A, B и дополнительный рисунок 2A). Для образцов лимфатических узлов используйте стратегию стробирования: живые клетки, одиночные клетки, клетки линии CD90+, клетки ST2+ и клетки IL-9+ (дополнительный рисунок 2B, C).
  2. Клеточное окрашивание для идентификации IL-9-продуцирующих лимфоцитов (рис. 2 и дополнительный рис. 3)
    1. Перенос 800 мкл на образец легкого с этапа 4.10.14 в пробирку объемом 1,5 мл (приблизительно 14,6 х 106 клеток ). Центрифуга при 450 x g в течение 5 мин при 4 °C. Откажитесь от надосадочной жидкости.
    2. Для образцов лимфатических узлов планшет 400 мкл клеточной суспензии со стадии 4.11.3 (приблизительно 5,6 x 10 6 и 17,5 x 106 клеток для образцов средостения и брыжеечных лимфатических узлов соответственно) в 96-луночную коническую нижнюю пластину в два этапа.
      1. Сначала перенесите 200 мкл, центрифугу при 450 x g в течение 5 мин при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость.
      2. Переведите еще 200 мкл в соответствующую лунку. Центрифугу при 450 x g в течение 5 мин при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость.
    3. Ресуспендировать клеточную гранулу в 50-400 мкл коктейля антитело/краситель (таблица 3) и инкубировать в течение 30 мин при 4 ° C в защищенном от света месте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы легких следует ресуспендировать в 400 мкл, образцы лимфатических узлов средостения - в 50 мкл и образцы брыжеечных лимфатических узлов - в 100 мкл окрашивающего коктейля.
    4. Добавьте 150 мкл буфера FACS к образцам лимфатических узлов средостения и 100 мкл к образцам брыжеечных лимфатических узлов. Центрифугу при 450 x g в течение 5 мин при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость.
    5. Промойте образцы легких и лимфатических узлов, ресуспендируя гранулы в 1 мл и 200 мкл буфера FACS соответственно. Центрифуга при 450 xg в течение 5 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость и повторите стирку.
    6. Ресуспендируют образцы легких в 600 мкл буфера FACS и анализируют их с помощью проточной цитометрии. Используйте стратегию стробирования: лимфоциты, отдельные клетки, живые клетки, гемопоэтические клетки, клетки CD4+TCRβ+ и клетки IL-9+ (рис. 2A).
    7. Ресуспендируют образцы лимфатических узлов в 300 мкл буфера FACS и анализируют с помощью проточной цитометрии. Используйте стратегию стробирования: лимфоциты, отдельные клетки, живые клетки, клетки CD4+ TCRβ+ и клетки IL-9+ (рис. 2B и дополнительный рис. 3A).

6. Определение абсолютного числа клеток в одноклеточных суспензиях

  1. Разбавляют образцы из этапов выделения 4.8.3, 4.9.7, 4.10.14 и 4.11.3 PBS в соотношении 1:20 (10 мкл образца + 190 мкл PBS).
  2. Смешайте 10 мкл каждого разбавленного образца из шага 6.1 с 10 мкл трипанового синего. Загрузите 10 мкл в гемоцитометр и подсчитайте живые клетки, учитывая каждое разведение.
  3. Получите абсолютное количество клеток, умножив процент интересующей популяции из живых клеток, определенный с помощью проточной цитометрии (жизнеспособность красителей, отрицательных клеток), на общее количество живых клеток в одноклеточной суспензии после выделения и разделив это число на 100 (дополнительный рисунок 4, дополнительный рисунок 5 и дополнительный рисунок 6).
    Абсолютное число = (Процент интересующей популяции из живых клеток, определенный с помощью проточной цитометрии x Общее количество живых клеток в одноклеточной суспензии)/100

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Мышам подкожно вводили 200 личинок L3 стадии N. brasiliensis или PBS для фиктивного контроля. Количество личинок, используемых в этом протоколе, было скорректировано, чтобы изолировать жизнеспособные клетки из легких, лимфоидной ткани и тонкой кишки, в отличие от предыдущих отчетов, где более высокие нагрузки червей использовались для обнаружения клеток в лимфоидных тканях и легких только4. Легкие, лимфатические узлы средостения, брыжеечные лимфатические узлы и тонкую кишку собирали на 0,...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Полное понимание взаимодействия кишечного паразита и хозяина и иммунных реакций на гельминтную инфекцию требует идентификации и анализа различных клеточных популяций и эффекторных молекул, которые являются ключевыми для индукции ремоделирования тканей и изгнания червя. Гельминтозы, передающиеся через почву, представляют собой большую проблему в развивающихся странах во всем мире. Однако до недавнего времени протокол, который позволял бы анализировать популяции редких клеток, присутствующих в тонком кишечнике, основном ор...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам раскрывать нечего.

Благодарности

Авторы выражают признательность Хосе Луису Рамосу-Бальдерасу за его техническую поддержку. Эта работа была поддержана следующим грантом PLL от CONACYT (FORDECYT-PRONACE-303027). OM-P и EO-M получили стипендию от CONACYT (соответственно 736162 и 481437). MCM-M получил стипендию от CONACYT (Estancias Posdoctorales por México 2022 (3)).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ACK буферСамодельный
цитометр Attune NxtThermofisher
B220Biolegend103204
CD11bBiolegend101204
CD11c Биолегенда117304
CD19 Биолегенда115504
CD4Биолегенда100404
CD4 (BV421)Биолегенда100443
CD45.2Биолегенда109846
CD8 Biolegend100703
CD90.2Biolegend105314
коллагеназой DRoche11088866001
ДНКазой IInvitrogen18068015Специфическая активность: ≥ 10 000 ед./мг     
Сортировщик Facs ARIA IIBD Biosciences
FACS Сортировщик клеток MelodyBD Biosciences
Fc-BlockBiolegend101320
Fcε RIeBioscience13589885
Фетальная бычья сывороткаGibco26140079
FlowJoFlowJoПрограммное обеспечение для анализа данных цитометрии
Gr-1Tonbo305931
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)Домашний
IL-9biolegend514103
NK1.1& НБСП;Biolegend108704
Нейлоновая сетка  ‎ lbaB07HYHHX5V
OptiPrep Density Gradient MediumSigmaD1556
Фосфатно-солевой буфер Домашний
RPMIGibco11875093
Siglec F Biolegend155512
стрептавидинBiolegend405206
TCR-β  Biolegend109203
TCR-β (PE/Cy7)Biolegend109222
TCR-γ &дельта;  Biolegend118103
Ter119 Biolegend116204
Трициновый буфер Домашний
зомби Aqua Поправляемый краситель для жизнеспособностиBiolegend423101

Ссылки

  1. Centers for Disease Control and Prevention. Parasites - Hookworm. , (2022).
  2. Camberis, M., Le Gros, G., Urban, J. Animal model of Nippostrongylus brasiliensis and Heligmosomoides polygyrus. Current Protocols in Immunology. , Chapter 19 (Unit 19.12) (2003).
  3. Mearns, H., et al. Interleukin-4-promoted T helper 2 responses enhance Nippostrongylus brasiliensis-induced pulmonary pathology. Infection and Immunity. 76 (12), 5535-5542 (2008).
  4. Licona-Limon, P., et al. Th9 cells drive host immunity against gastrointestinal worm infection. Immunity. 39 (4), 744-757 (2013).
  5. Ferrer-Font, L., et al. High-dimensional analysis of intestinal immune cells during helminth infection. Elife. 9, 51678(2020).
  6. Kharwadkar, R., et al. Expression efficiency of multiple IL9 reporter alleles Is determined by cell lineage. Immunohorizons. 4 (5), 282-291 (2020).
  7. Wilhelm, C., et al. An IL-9 fate reporter demonstrates the induction of an innate IL-9 response in lung inflammation. Nature Immunology. 12 (11), 1071-1077 (2011).
  8. Gerlach, K., et al. TH9 cells that express the transcription factor PU.1 drive T cell-mediated colitis via IL-9 receptor signaling in intestinal epithelial cells. Nature Immunology. 15 (7), 676-686 (2014).
  9. Olson, M. R., et al. Paracrine IL-2 is required for optimal type 2 effector cytokine production. Journal of Immunology. 198 (11), 4352-4359 (2017).
  10. Cold Spring Harbor Protocols. Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
  11. Pinto, M. E. S., Licona-Limon, P. Th9 cells and parasitic inflammation: Use of Nippostrongylus and Schistosoma models. Methods in Molecular Biology. 1585, 223-245 (2017).
  12. Lawrance, C. C., Lucas, E. A., Clarke, S. L., Smith, B. J., Kuvibidila, S. Differential effects of isoflurane and CO2 inhalation on plasma levels of inflammatory markers associated with collagen-induced arthritis in DBA mice. International Immunopharmacology. 9 (7-8), 807-809 (2009).
  13. Boivin, G. P., Bottomley, M. A., Schiml, P. A., Goss, L., Grobe, N. Physiologic, behavioral, and histologic responses to various euthanasia methods in C57BL/6Ntac male mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 56 (1), 69-78 (2017).
  14. old Spring Harbor Protocols. Hank's balanced salt solution (HBSS) without phenol red. Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
  15. Bielecki, P., et al. Skin-resident innate lymphoid cells converge on a pathogenic effector state. Nature. 592 (7852), 128-132 (2021).
  16. Sanjabi, S., Mosaheb, M. M., Flavell, R. A. Opposing effects of TGF-beta and IL-15 cytokines control the number of short-lived effector CD8+ T cells. Immunity. 31 (1), 131-144 (2009).
  17. Liu, H., Li, M., Wang, Y., Piper, J., Jiang, L. Improving single-cell encapsulation efficiency and reliability through neutral buoyancy of suspension. Micromachines. 11 (1), 94(2020).
  18. Huang, Y., et al. IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1(hi) cells are multipotential 'inflammatory' type 2 innate lymphoid cells. Nature Immunology. 16 (2), 161-169 (2015).
  19. Huang, Y., et al. S1P-dependent interorgan trafficking of group 2 innate lymphoid cells supports host defense. Science. 359 (6371), 114-119 (2018).
  20. Flamar, A. L., et al. Interleukin-33 induces the enzyme Tryptophan hydroxylase 1 to promote inflammatory group 2 innate lymphoid cell-mediated immunity. Immunity. 52 (4), 606-619 (2020).
  21. Olguín-Martínez, E., et al. IL-33 and the PKA pathway regulate ILC2 populations expressing IL-9 and ST2. Frontiers in Immunology. 13, 787713(2022).
  22. Olguin-Martinez, E., Ruiz-Medina, B. E., Licona-Limon, P. Tissue-specific molecular markers and heterogeneity in type 2 innate lymphoid cells. Frontiers in Immunology. 12, 757967(2021).
  23. Noelle, R. J., Nowark, E. C. Cellular sources and immune functions of interleukin-9. Nature Reviews. Immunology. 10 (10), 683-687 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

9CD4
Стратегия изучения IL-9-продуцирующих лимфоидных клеток в модели инфекции Nippostrongylus brasiliensis
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.