Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Анализ трансцитоза эндотелиальных клеток как модель in vitro для оценки проницаемости внутреннего барьера крови и сетчатки

6.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/64076

⸱

7 июня 2022 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Boston Children’s Hospital, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол иллюстрирует анализ трансцитоза эндотелиальных клеток in vitro в качестве модели для оценки проницаемости внутреннего барьера крови и сетчатки путем измерения способности микрососудистых эндотелиальных клеток сетчатки человека транспортировать пероксидазу хрена через клетки в трансклеточных процессах трансклеточного транспорта, опосредованных кавеолами.

Аннотация

Дисфункция гемато-сетчаточного барьера (БРБ) способствует патофизиологии ряда сосудистых заболеваний глаз, нередко приводящих к отеку сетчатки и последующей потере зрения. Внутренний гемато-ретинальный барьер (iBRB) в основном состоит из эндотелия сосудов сетчатки с низкой проницаемостью в физиологических условиях. Эта особенность низкой проницаемости жестко регулируется и поддерживается низкими темпами параклеточного транспорта между соседними микрососудистыми эндотелиальными клетками сетчатки, а также трансклеточным транспортом (трансцитозом) через них. Оценка проницаемости трансклеточного барьера сетчатки может дать фундаментальное представление о целостности iBRB в здоровье и болезни. В этом исследовании мы описываем анализ трансцитоза эндотелиальных клеток (EC) в качестве модели in vitro для оценки проницаемости iBRB с использованием микрососудистых эндотелиальных клеток сетчатки человека (HRMECs). Этот анализ оценивает способность HRMECs транспортировать трансферрин и пероксидазу хрена (HRP) в рецептор- и кавеолах-опосредованных трансклеточных транспортных процессах соответственно. Полностью сливающиеся HRMECs, культивируемые на пористой мембране, инкубировали с флуоресцентно-меченым трансферрином (клатринозависимый трансцитоз) или HRP (кавеол-опосредованный трансцитоз) для измерения уровней трансферрина или HRP, перенесенных в нижнюю камеру, что свидетельствует об уровнях трансцитоза в монослое ЕС. Передача сигналов Wnt, известный путь, регулирующий iBRB, модулировали для демонстрации метода анализа трансцитоза на основе HRP, опосредованного кавеолами. Анализ трансцитоза EC, описанный здесь, может обеспечить полезный инструмент для исследования молекулярных регуляторов проницаемости EC и целостности iBRB при сосудистых патологиях и для скрининга систем доставки лекарств.

Введение

Человеческая сетчатка является одной из самых энергоемких тканей в организме. Правильное функционирование нервной сетчатки требует эффективного снабжения кислородом и питательными веществами наряду с ограниченным потоком других потенциально вредных молекул для защиты среды сетчатки, которая опосредована через гемато-ретинальный барьер (BRB)1. Подобно гематоэнцефалическому барьеру (ГЭБ) в центральной нервной системе, БРБ действует как селективный барьер в глазу, регулируя движение ионов, воды, аминокислот и сахара в сетчатке и из нее. BRB также поддерживает гомеостаз сетчатки и его иммунную привилегию, предотвращая воздействие факторов кровообращения, таких как иммунные клетки, антитела и вредные патогены2. Дисфункция BRB способствует патофизиологии некоторых сосудистых заболеваний глаз, таких как диабетическая ретинопатия, возрастная макулярная дегенерация (ВМД), ретинопатия недоношенных (РН), окклюзия вен сетчатки и увеит, что приводит к вазогенному отеку и последующей потере зрения 3,4,5.

BRB состоит из двух отдельных барьеров для двух различных глазных сосудистых сетей, соответственно: сосудистой сетчатки и фенестрированного хориокапилляриса под сетчаткой. Внутренний BRB (iBRB) в основном состоит из микрососудистых эндотелиальных клеток сетчатки (RMECs), выстилающих микроциркулятор сетчатки, который питает внутренние нейронные слои сетчатки. С другой стороны, пигментный эпителий сетчатки образует основной компонент наружного BRB, который находится между нейросенсорной сетчаткой и хориокапиллярием2. Для iBRB молекулярный транспорт через RMECs происходит как по параклеточным, так и по трансклеточным путям (рисунок 1). Высокая степень селективности вещества в iBRB зависит от (i) наличия соединительных белковых комплексов, которые ограничивают параклеточный транспорт между соседними эндотелиальными клетками (EC), и (ii) низких уровней экспрессии медиаторов, транспортеров и рецепторов caveolae в эндотелиальных клетках, которые поддерживают низкие скорости трансклеточного транспорта 1,6,7,8 . Соединительные комплексы, регулирующие параклеточный поток, состоят из плотных соединений (клаудины, окклюдины), адгезивных соединений (VE cadherins) и щелевых соединений (коннексины), что позволяет проходить воде и мелким водорастворимым соединениям. В то время как небольшие липофильные молекулы пассивно диффундируют через внутреннюю часть RMECs, движение более крупных липофильных и гидрофильных молекул регулируется АТФ-управляемыми трансэндотелиальными путями, включая везикулярный транспорт и мембранные транспортеры 5,9.

Везикулярный трансцитоз может быть классифицирован как кавеолин-опосредованный кавеолярный трансцитоз, клатринозависимый (и рецептор-опосредованный) трансцитоз и клатрино-независимый макропиноцитоз (рисунок 2). Эти везикулярные транспортные процессы включают везикулы разного размера, причем макропиносомы являются самыми большими (в диапазоне от 200-500 нм), а кавеолы - самыми маленькими (в среднем 50-100 нм), в то время как везикулы, покрытые клатрином, варьируются от 70-150 нм10. Кавеолы представляют собой колбовидные липидные инвагинации плазматической мембраны с белковой оболочкой, в основном состоящей из кавеолина-1, который связывает холестерин липидной мембраны и другие структурные и сигнальные белки через их кавеолин-каркасный домен11. Кавеолины работают вместе с периферически прикрепленным кавином, способствуя стабилизации кавеол на плазматической мембране12. Кавеолярные мембраны также могут нести рецепторы для других молекул, таких как инсулин, альбумин и циркулирующие липопротеины, включая липопротеины высокой плотности (ЛПВП) и липопротеины низкой плотности (ЛПНП), чтобы помочь их движению через эндотелиальные клетки13. В процессе развития формирование функционального БРБ зависит от подавления ЭК трансцитоза8. Зрелый эндотелий сетчатки, следовательно, имеет относительно низкие уровни кавеол, кавеолин-1 и альбуминовых рецепторов по отношению к другим эндотелиальным клеткам в физиологических условиях, что способствует его барьерным свойствам 4,9.

Поскольку разрушение iBRB является основным признаком многих патологических заболеваний глаз, важно разработать методы оценки проницаемости сосудов сетчатки in vivo и in vitro. Эти методы помогают обеспечить вероятное понимание механизмов нарушения целостности BRB и оценить эффективность потенциальных терапевтических мишеней. Текущая визуализация in vivo или количественные анализы сосудистой утечки обычно используют флуоресцентные (флуоресцеин натрия и декстран), колориметрические (краситель Evans Blue и субстрат пероксидазы хрена [HRP]) или радиоактивные индикаторы14 для обнаружения экстравазации из сосудистой системы в окружающие ткани сетчатки с помощью микроскопической визуализации или в изолированном тканевом лизате. Идеальный индикатор для количественной оценки сосудистой целостности должен быть инертным и достаточно большим, чтобы свободно проникать в скомпрометированные сосуды, находясь в пределах здоровых и неповрежденных капилляров. Методы, использующие флуоресцеин натрия или флуоресцеин изотиоцианат-конъюгированный декстран (FITC-декстран) в флуоресцеиновой ангиографии живого глазного дна (FFA) или изолированных плоских креплениях сетчатки, широко используются для количественной экстравазации сетчатки in vivo или ex vivo. FITC-декстран имеет то преимущество, что он доступен в различных молекулярных массах в диапазоне от 4 до 70 кДа для исследований с выбором размера 15,16,17. FITC-альбумин (~68 кДа) является альтернативным крупногабаритным белковым индикатором, имеющим биологическое значение для исследований сосудистой утечки18. Краситель Evans Blue, вводимый внутрисердечно19, ретроорбитально или через хвостовую вену20, также полагается на его связывание с эндогенным альбумином с образованием большой молекулы, которая может быть количественно определена в основном спектрофотометрическим обнаружением или, реже, флуоресцентной микроскопией в плоских маунтах20,21. Однако эти количественные или световые методологии визуализации часто не отличают параклеточный транспорт от трансэндотелиального транспорта. Для специфического анализа трансцитоза с ультраструктурной визуализацией трансцитозированных везикул индикаторные молекулы, такие как HRP, обычно используются для определения местоположения трансцитозированных везикул в эндотелиальных клетках, которые можно наблюдать под электронным микроскопом 22,23,24 (рисунок 3A-C).

Разработка и использование моделей in vitro iBRB для оценки проницаемости эндотелиальных клеток может обеспечить надежную и высокую оценку пропускной способности, чтобы дополнить эксперименты in vivo и помочь в исследовании молекулярных регуляторов сосудистой утечки. Обычно используемые анализы для оценки параклеточного транспорта и целостности плотных соединений включают трансэндотелиальное электрическое сопротивление (TEER), меру ионной проводимости (Фиг.4)2,25, и анализ сосудистой утечки in vitro с использованием флуоресцентных индикаторов26 с малой молекулярной массой. Кроме того, анализы трансцитоза на основе трансферрина, моделирующие ГЭБ, были использованы для изучения клатрино-зависимого трансцитоза27. Несмотря на это, анализы для оценки BRB и, более конкретно, кавеолярного трансцитоза EC сетчатки in vitro ограничены.

В этом исследовании мы описываем анализ трансцитоза EC с использованием микрососудистых эндотелиальных клеток сетчатки человека (HRMECs) в качестве модели in vitro для определения проницаемости iBRB и трансцитоза EC. Этот анализ опирается на способность HRMECs транспортировать трансферрин или HRP через рецептор-опосредованные или кавеолы-зависимые пути трансцитоза, соответственно (рисунок 2). HRMECs, культивируемые до полного слияния в апикальной камере (т.е. фильтрующей вставке), инкубировали с флуоресцентно-конъюгированным трансферрином (Cy3-Tf) или HRP для измерения интенсивности флуоресценции, соответствующей уровням трансферрина или HRP, перенесенных в нижнюю камеру исключительно посредством трансцитоза EC. Слияние монослоя ячейки может быть подтверждено измерением TEER, указывающим на целостность плотного соединения25. Для демонстрации метода анализа TEER и трансцитоза использовались известные молекулярные модуляторы проницаемости сосудов и трансцитоза EC, включая фактор роста эндотелия сосудов (VEGF)28 и те, которые находятся в передаче сигналов Wnt (лиганды Wnt: Wnt3a и Norrin)29.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Бостонской детской больнице для создания световой микроскопии и электромагнитных изображений (рисунок 3). Протоколы исследований in vivo можно получить из Wang et al.24. Все эксперименты с участием микрососудистых эндотелиальных клеток сетчатки человека (HRMECs) были одобрены Институциональным комитетом по биобезопасности (IBC) в Бостонской детской больнице.

1. Подготовка реагентов

  1. Раствор для покрытия тканевой культуры посуды: Готовят 0,1% раствор желатина путем растворения 1 мл раствора желатина (40%-50%) в 500 мл стерильной культуры тканей 1x PBS (рН = 7,4). Процедите раствор через фильтр 0,22 мкм. Хранить 0,1% раствор желатина при температуре 2-8°C. Он может храниться при указанной температуре в течение неопределенного времени в стерильном состоянии.
  2. Питательная среда: Приготовьте 500 мл полной среды роста эндотелиальных клеток (EGM) путем растворения добавок EGM в базальной среде роста эндотелиальных клеток (EBM) в соответствии с инструкциями производителя (Таблица материалов). Питательная среда Aliquot в пробирки по 50 мл и храните трубки при 4 °C. Срок годности питательной среды составляет 12 месяцев при 4 °C.
  3. Раствор трипсина: Для 0,25% раствора трипсина-ЭДТА, аликвота из запасного флакона в пробирки по 50 мл и хранение при 4 °C (до 2 недель) или −20 °C (до 24 месяцев).

2. Культивирование HRMC

  1. Начальная клеточная культура
    1. Покрывать клеточные культуры чашки Петри (диаметром 100 мм х высотой 20 мм) 5 мл 0,1% раствора желатина под ламинарным вытяжкой и держать их нетронутыми в вытяжке в течение 30 мин при комнатной температуре (RT) для равномерного покрытия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Желатиновое покрытие посуды усиливает прикрепление клеток. В качестве альтернативы можно также использовать колбы для культивирования T75 с желатиновым покрытием.
    2. Перед посевом клеток аспирируйте раствор желатина с помощью вакуумного насоса. Вакуумное давление используемого аспиратора составляло до 724 мм рт.ст.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Аспирация должна быть выполнена непосредственно перед посевом клеток, чтобы предотвратить высыхание раствора покрытия.
    3. Разморозьте замороженный флакон HRMECs (из хранения в жидком азоте) либо с помощью водяной бани при 37 °C, либо путем добавления теплой питательной среды во флакон. После размораживания перенесут клеточную суспензию в 9 мл питательной среды (при условии, что размороженный флакон HRMECs составляет 1 мл).
      ПРИМЕЧАНИЕ: HRMEC были получены в коммерческих целях (Таблица материалов). Питательная среда, добавляемая в клетки, всегда должна быть предварительно разогрета до 37 °C перед использованием.
    4. Раскрутите клетки при 200 х г в течение 5 мин при RT и осторожно аспирируйте супернатант, чтобы избежать удаления гранулы клетки.
    5. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в 10 мл питательной среды и переложите полученную суспензию на чашку Петри, покрытую желатином. Храните клетки в инкубаторе при 37 °C и 5% CO2. Как правило, HRMECs на 70%-80% сливаются через 72 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Среда роста меняется через день.
  2. Субкультура HRMC на проницаемых мембранных вставках
    1. Подготовьте фильтрующие вставки для клеточных культур (вставки 6,5 мм с поликарбонатной мембраной размером 0,4 мкм, помещенные в 24-луночную пластину) для посева HRMEC путем покрытия каждой вставки (апикальной камеры) 200 мкл 0,1% раствора желатина в течение 30 мин под ламинарной проточной вытяжкой. Убедитесь, что раствор покрывает всю нижнюю поверхность фильтрующей вставки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая скважина имеет апикальную и базолатеральную камеры, разделенные пористой мембраной.
    2. Выньте чашку Петри с культивированными HRMECs (шаг 2.1.5.) из инкубатора и аспирируйте питательную среду. Осторожно промойте клетки 2x с 10 мл 1x PBS под ламинарной проточной капюшоном, чтобы избавиться от потенциальных плавающих / мертвых клеток.
    3. Диссоциируют клетки 0,5-1 мл 0,25% раствора трипсина-ЭДТА и помещают чашку Петри в инкубатор (37 °C и 5% CO2) на 5 мин.
    4. Погасите активность трипсина путем добавления 4,5-9 мл питательной среды и перенесите клеточную суспензию в трубку объемом 15 мл с помощью пипетки объемом 10 мл.
    5. Раскрутите клетки при 200 х г в течение 5 мин при РТ, осторожно удалите надосадочный материал и повторно суспендируйте гранулу в 3 мл питательной среды.
    6. Подсчитайте количество ячеек с помощью ручного гемоцитометра или автоматизированного счетчика клеток и посыпайте семена при плотности 4 х 104 ячейки на вставку фильтра (т.е. 1,25 х 105 клеток /см2). Объем клеточной суспензии для каждой вставки составляет 250 мкл.
    7. Аспирировать раствор покрытия из скважин, содержащих проницаемые вставки, и переносить 250 мкл клеточной суспензии на вставку (апикальную камеру). Добавьте только среду (т.е. без ячеек) к одной из вкладышей, которая будет использоваться в качестве "пустого элемента управления" для измерения TEER. Одновременно добавляют также 750 мкл среды на лунку, в базолатеральные камеры.
    8. Держите 24-луночную пластину с проницаемыми вставками в инкубаторе (37 °C и 5% CO2) в течение 7-12 дней до тех пор, пока культивируемые клетки не станут полностью сливающимися и не будет достигнуто желаемое значение TEER ~ 20 Ω ·см2 .
    9. Меняйте питательную среду через день. Во время изменения среды тщательно аспирируйте среду, чтобы свести к минимуму разрушение монослоя клетки, и добавляйте 250 мкл и 750 мкл свежей среды на лунку в апикальную и базолатеральную камеры соответственно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Среда роста изменяется как для апикальной, так и для базолатеральной камер скважин.

3. Измерения TEER (рисунок 4)

  1. На 14-й день после посева ячеек (этап 2.2.9.) измерьте TEER для HRMC с использованием системы электрического сопротивления (ER) эпителиального вольтомметра (EVOM) (Таблица материалов) следующим образом.
  2. Предварительно зарядите систему ER и проверьте работоспособность счетчика с помощью тестового электрода STX04. При необходимости выполните калибровку.
  3. Подключите электрод к измерителю и уравновешивайте электрод, сначала замачивая его в 70% этаноле в течение 15-20 мин, а затем ненадолго погружая его в питательную среду EGM клеточной культуры.
  4. В то же время держите ячейку, содержащую 24 скважины пластины, в ламинарной проточной вытяжке на RT в течение 15-20 минут для выравнивания температуры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На измерения TEER влияет температура, поэтому шаг равновесия имеет важное значение.
  5. Для измерения TEER добавьте свежую питательную среду как в апикальную (250 мкл), так и в базолатеральную (750 мкл) камеры скважин.
  6. Выполните измерение TEER, тщательно погружая электрод таким образом, чтобы более короткий наконечник находился во вставке, а более длинный наконечник касался дна колодца. Сначала измерьте сопротивление на пустом элементе управления. Для каждой вставки измерьте TEER в трех экземплярах.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для промывки электрода в промежутках между измерениями используют питательные среды. Убедитесь, что электрод удерживается под углом 90° к нижней части вставки для стабильных показаний.
  7. Рассчитать электрическое сопротивление (в Ω·см2) по всему монослою по формуле TEER = чистое сопротивление (Ω) x площадь поверхности фильтрующей вставки (см2); здесь чистое сопротивление — это разница между сопротивлением каждой лунки (питательной среды с клетками) и пустой лунки (только питательной среды).
  8. Проводят дальнейшую обработку клеток только после того, как значение TEER достигнет ~20 Ω·см2. Если желаемый уровень TEER не достигнут, держите пластину в инкубаторе и измеряйте TEER на следующий день.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Слияние HRMEC также может быть подтверждено морфологическим исследованием формы клеток (под микроскопом) с типичной морфологией булыжника и/или наличием белков клеточного соединения с иммуногистохимическим окрашиванием отдельно.

4. Анализ трансцитоза

  1. Анализ трансцитоза in vitro, опосредованный клатрином, с использованием трансферрина, меченого Cy3 (рисунок 5)
    1. При достижении слияния со значениями TEER около 20 Ω·см2 сыворотка лишает клетки в течение 24 ч при 37 °C и 5% CO2 , используя 0,5% FBS в EBM (сывороточно-восстановленная среда) в обеих камерах (апикальная камера: 250 мкл и базолатеральная камера: 750 мкл) перед лечением лигандом. Сывороточно-восстановленный EBM использовался на протяжении всего анализа.
    2. Инкубируют клетки (используя сывороточно-восстановленную среду на стадии 4.1.1.) в апикальной камере флуоресцентным (цианин 3)-меченым трансферриновым лигандом (Cy3-Tf) (конечная концентрация 40 мкг/мл) в течение 60 мин при 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пластины, содержащие Cy3-Tf, должны быть защищены от света, чтобы избежать фотоотбеливания Cy3-Tf, завернув в них алюминиевую фольгу и выполнив эксперимент в вытяжке клеточной культуры с выключенным светом.
    3. Через 1 ч поместите пластину на лед и промыть монослой апически и базолатерально 4x (3-5 мин на промывку) с восстановленной в сыворотке средой при RT, чтобы удалить свободный несвязанный Cy3-Tf.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Промывка необходима для удаления свободных молекул индикатора и обеспечения точного считывания трансцитоза без потенциальной утечки из параклеточного пути.
    4. Добавьте свежую сывороточную среду (как на этапе 4.1.1.) к тщательно промытым фильтрующим вставкам, содержащим клетки, и переложите вкладыши в свежие колодцы 24-луночной пластины, содержащей предварительно нагретую сывороточную восстановленную среду.
    5. Инкубируют клетки еще 90 мин в инкубаторе (37 °C и 5% CO2), а затем собирают среду из базолатеральной камеры.
    6. Запишите интенсивность флуоресценции раствора из базолатеральной камеры с помощью флуоресцентного детектора. Уровни интенсивности флуоресценции, измеряемые как относительные флуоресцентные единицы (РФС), указывают на количество комплекса Cy3-Tf, трансцитозируемого через монослой HRMEC через клатрин-зависимый трансцитоз.
  2. Анализ трансцитоза in vitro, опосредованный кавеолами, с использованием HRP (рисунок 6)
    1. При достижении полного слияния со значениями TEER около 20 Ω·см2 сыворотка лишает клетки в течение 24 ч при 37 °C и 5% CO2 с использованием 0,5% FBS-содержащей EBM среды (сывороточно-восстановленная среда) перед лечением (как на стадии 4.1.1.). Сывороточно-восстановленная среда EBM использовалась на протяжении всего анализа.
    2. Обработайте клетки в апикальной камере желаемыми методами обработки и контроля транспортного средства.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы использовали модуляторы Wnt в качестве примера, чтобы продемонстрировать регуляцию трансцитоза, опосредованного кавеолами, сигнальным путем Wnt в HRMC: человеческий рекомбинантный Норрин и ингибитор Wnt XAV939. В типичном эксперименте клетки обрабатывали в течение 24 ч в инкубаторе (37 °C и 5% CO2) со следующими концентрациями: Норрин (125 нг/мл), Норрин (125 нг/мл) + XAV939 (10 мкМ) и раствор для управления транспортным средством. Кроме того, использовалась среда, кондиционированная Wnt3a (полученная из клеток L Wnt-3A).
    3. Инкубируют клетки в апикальной камере с HRP (5 мг/мл) в течение 15 мин при 37 °C.
    4. После этого поместите 24-луночную плиту на лед и интенсивно промывайте апикальную и базолатеральную камеры 6x с буфером P (10 мМ HEPES pH = 7,4, 1 мМ пирувата натрия, 10 мМ глюкозы, 3 мМ CaCl2, 145 мМ NaCl), чтобы удалить свободную внеклеточную HRP.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Промывка необходима для удаления свободных молекул индикатора и обеспечения точного считывания трансцитоза без потенциальной утечки из параклеточного пути.
    5. Добавьте свежую сывороточную среду (как на этапе 4.1.1.) в апикальную камеру и переложите вкладыши в свежий колодец, содержащий предварительно подогретую среду.
    6. Инкубируют монослой в течение дополнительных 90 мин в инкубаторе при 37 °C и 5% CO2 перед сбором среды из базолатеральной камеры.
    7. К собранной среде добавляют 100 мкл фторогенного пероксидазного субстрата HRP (Таблица материалов) в соответствии с инструкциями производителя и инкубируют на RT в течение 10 мин до остановки реакции 100 мкл стоп-раствора.
    8. Обнаружение уровней продукта реакции подложки HRP в среде с помощью считывателя флуоресцентных пластин. Измерьте интенсивность флуоресценции на длине волны излучения 420 нм (с возбуждением 325 нм) и в виде относительных флуоресцентных единиц (РФС). Значения указывают на уровень HRP, трансцитозируемого через слой HRMEC через кавеолы-опосредованный трансцитоз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцентный продукт, используемый здесь (Таблица материалов), не отбеливает. Светозащита от фотоотбеливания не нужна.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

ЭМ-изображения эндотелия сосудов сетчатки показывают трансцитотический везикулярный транспорт и кавеолярные везикулы в эндотелиальных клетках in vivo.
EC трансцитоз может быть визуализирован in vivo в поперечных сечениях сетчатки с темно-коричневым осадком, отражающим HRP-содержащие кровеносные сосуды под световым микроскопом (рисунок 3A) и в виде электронно-плотного осадка, указывающего на HRP-содержащие трансцитотическ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

BRB играет важную роль в здоровье и заболеваниях сетчатки. Методы in vitro , оценивающие проницаемость сосудов, оказались важнейшими инструментами в исследованиях, касающихся развития и функции барьеров (BRB / BBB). Процедура, описанная здесь, может быть использована для изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе трансцитоза ЕС, или оценки связанных молекулярных модуляторов, влияющих на проницаемость BRB. In vitro Анализы EC-трансцитоза имеют множество преимуществ по сравнению с анализами in...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют конфликта интересов или финансовой заинтересованности для раскрытия.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами NIH (R01 EY028100, EY024963 и EY031765) для JC. ZW был поддержан грантом Knights Templar Eye Foundation Career Starter Grant.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Шкаф биологической безопасности Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific1286
Клеточная культура петридиш Nest Biotechnology704001
центрифуги Eppendorf5702
(15 мл)Corning Inc.
Центрифужные пробирки (50 мл)Denville Scientific Inc.C1062-P
Цианин 3-человеческий трансферрин Jackson ImmunoResearchAB_2337082
Эндотелиальные клетки базальная среда-2 (EBM-2)Lonza BioscienceCC-3156
Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) SingleQuots ДобавкиLonza BioscienceCC-4176
EVOM Millicell Electric Resistance System-2 (ERS-2)MilliporeMERS00002
фетальная бычья сыворотка (FBS)Lonza BioscienceCC-4102B
Sigma-AldrichG7765
(2-чип)Bulldog BioDHC-N002
Пероксидаза хрена (HRP)Sigma-AldrichP8250
Микрососудистые эндотелиальные клетки сетчатки человека (HRMEC)Клеточные системыACBRI 181
ИнкубаторThermo Electron Корпорация, Thermo Fisher Scientific3110
L элементы (для контрольно-кондиционированной среды)ATCCCRL-2648
L Wnt-3A элементы (для Wnt3A-кондиционированной среды)ATCCCRL-2647
Световой микроскопLeicaDMi1
Многорежимный планшетный ридерEnSight, PerkinElmer
Фосфатно-солевой буфер (PBS) буфер (1x)GIBCO10010-023
QuantaBlu Набор субстрата для флуорогенной пероксидазыThermo Fisher Scientific15169
Рекомбинантный человеческий норрин (rhNorrin)R& D Systems3014-NR
Рекомбинантный фактор роста эндотелия сосудов человека (rhVEGF)R& D Systems293-VE
Шприцевой фильтр (0,22 &; m)Вкладыши MilliporeSLGP033RS
Transwell (6,5 мм transwell, 0,4 и микро; m поровая полиэфирная мембранная вставка)Corning Inc.CLS3470-48EA
Трипсин-ЭДТА (0,25%) (1x)GIBCO25-200-072
Водяная баняПрецизион, Thermo Fisher Scientific51221060
XAV939 (Wnt/β-ингибитор катенина)SelleckchemS1180
Центрифужные пробирки 352097 Гемоцитометр гемоцитометр

Ссылки

  1. Diaz-Coranguez, M., Ramos, C., Antonetti, D. A. The inner blood-retinal barrier: Cellular basis and development. Vision Research. 139, 123-137 (2017).
  2. Campbell, M., Humphries, P. The blood-retina barrier: Tight junctions and barrier modulation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 763, 70-84 (2012).
  3. Chen, J., et al. Wnt signaling mediates pathological vascular growth in proliferative retinopathy. Circulation. 124 (17), 1871-1881 (2011).
  4. Klaassen, I., Van Noorden, C. J., Schlingemann, R. O. Molecular basis of the inner blood-retinal barrier and its breakdown in diabetic macular edema and other pathological conditions. Progress in Retinal and Eye Research. 34, 19-48 (2013).
  5. Yemanyi, F., Bora, K., Blomfield, A. K., Wang, Z., Chen, J. Wnt signaling in inner blood-retinal barrier maintenance. International Journal of Molecular Sciences. 22 (21), 11877(2021).
  6. Naylor, A., Hopkins, A., Hudson, N., Campbell, M. Tight junctions of the outer blood retina barrier. International Journal of Molecular Sciences. 21 (1), 211(2019).
  7. Erickson, K. K., Sundstrom, J. M., Antonetti, D. A. Vascular permeability in ocular disease and the role of tight junctions. Angiogenesis. 10 (2), 103-117 (2007).
  8. Chow, B. W., Gu, C. Gradual suppression of transcytosis governs functional blood-retinal barrier formation. Neuron. 93 (6), 1325-1333 (2017).
  9. Daruich, A., et al. Mechanisms of macular edema: Beyond the surface. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 20-68 (2018).
  10. De Bock, M., et al. Into rather unexplored terrain-transcellular transport across the blood-brain barrier. Glia. 64 (7), 1097-1123 (2016).
  11. Rothberg, K. G., et al. Caveolin, a protein component of caveolae membrane coats. Cell. 68 (4), 673-682 (1992).
  12. Kovtun, O., Tillu, V. A., Ariotti, N., Parton, R. G., Collins, B. M. Cavin family proteins and the assembly of caveolae. Journal of Cell Science. 128 (7), 1269-1278 (2015).
  13. Wolburg, H., Dermietzel, R., Spray, D. C., Nedergaard, M. The Endothelial Frontier. Blood-Brain Interface: From Ontogeny to Artificial Barriers. , Wiley. Hoboken, NJ. 75-107 (2006).
  14. Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. Markers for blood-brain barrier integrity: How appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives. Frontiers in Neuroscience. 9, 385(2015).
  15. Atkinson, E. G., Jones, S., Ellis, B. A., Dumonde, D. C., Graham, E. Molecular size of retinal vascular leakage determined by FITC-dextran angiography in patients with posterior uveitis. Eye. 5, Pt 4 440-446 (1991).
  16. Natarajan, R., Northrop, N., Yamamoto, B. Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran extravasation as a measure of blood-brain barrier permeability. Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-15 (2017).
  17. Comin, C. H., Tsirukis, D. I., Sun, Y., Xu, X. Quantification of retinal blood leakage in fundus fluorescein angiography in a retinal angiogenesis model. Scientific Reports. 11 (1), 19903(2021).
  18. Pietra, G. G., Johns, L. W. Confocal- and electron-microscopic localization of FITC-albumin in H2O2-induced pulmonary edema. Journal of Applied Physiology. 80 (1), 182-190 (1996).
  19. Honeycutt, S. E., O'Brien, L. L. Injection of Evans blue dye to fluorescently label and image intact vasculature. Biotechniques. 70 (3), 181-185 (2021).
  20. Wu, J. H., et al. Inhibition of Sema4D/PlexinB1 signaling alleviates vascular dysfunction in diabetic retinopathy. European Molecular Biology Organization (EMBO) Molecular Medicine. 12 (2), 10154(2020).
  21. Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. Journal of Visualized Experiments. (73), e50062(2013).
  22. Vinores, S. A. Assessment of blood-retinal barrier integrity. Histology and Histopathology. 10 (1), 141-154 (1995).
  23. Ben-Zvi, A., et al. Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier. Nature. 509 (7501), 507-511 (2014).
  24. Wang, Z., et al. Wnt signaling activates MFSD2A to suppress vascular endothelial transcytosis and maintain blood-retinal barrier. Science Advances. 6 (35), (2020).
  25. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
  26. Martins-Green, M., Petreaca, M., Yao, M. An assay system for in vitro detection of permeability in human "endothelium". Methods in Enzymology. 443, 137-153 (2008).
  27. Sade, H., et al. A human blood-brain barrier transcytosis assay reveals antibody transcytosis influenced by pH-dependent receptor binding. PLoS One. 9 (4), 96340(2014).
  28. Feng, Y., et al. VEGF-induced permeability increase is mediated by caveolae. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 40 (1), 157-167 (1999).
  29. Wang, Z., Liu, C. H., Huang, S., Chen, J. Wnt signaling in vascular eye diseases. Progress in Retinal and Eye Research. 70, 110-133 (2019).
  30. Suarez, S., et al. Modulation of VEGF-induced retinal vascular permeability by peroxisome proliferator-activated receptor-beta/delta. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 55 (12), 8232-8240 (2014).
  31. Tomita, Y., et al. Long-acting FGF21 inhibits retinal vascular leakage in in vivo and in vitro models. International Journal of Molecular Science. 21 (4), 1188(2020).
  32. Tuma, P., Hubbard, A. L. Transcytosis: Crossing cellular barriers. Physiological Reviews. 83 (3), 871-932 (2003).
  33. Moleiro, A. F., Conceicao, G., Leite-Moreira, A. F., Rocha-Sousa, A. A critical analysis of the available in vitro and ex vivo methods to study retinal angiogenesis. Journal of Ophthalmology. 2017, 3034953(2017).
  34. Tucker, S. P., Melsen, L. R., Compans, R. W. Migration of polarized epithelial cells through permeable membrane substrates of defined pore size. European Journal of Cell Biology. 58 (2), 280-290 (1992).
  35. Butor, C., Davoust, J. Apical to basolateral surface area ratio and polarity of MDCK cells grown on different supports. Experimental Cell Research. 203 (1), 115-127 (1992).
  36. Villars, F., et al. Ability of various inserts to promote endothelium cell culture for the establishment of coculture models. Cell Biology and Toxicology. 12 (4-6), 207-214 (1996).
  37. Liu, F., Soares, M. J., Audus, K. L. Permeability properties of monolayers of the human trophoblast cell line BeWo. American Journal of Physiology. 273 (5), 1596-1604 (1997).
  38. Matter, K., Balda, M. S. Functional analysis of tight junctions. Methods. 30 (3), 228-234 (2003).
  39. Felix, K., Tobias, S., Jan, H., Nicolas, S., Michael, M. Measurements of transepithelial electrical resistance (TEER) are affected by junctional length in immature epithelial monolayers. Histochemistry and Cell Biology. 156 (6), 609-616 (2021).
  40. Senger, D. R., et al. Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid. Science. 219 (4587), 983-985 (1983).
  41. Antonetti, D. A., Barber, A. J., Hollinger, L. A., Wolpert, E. B., Gardner, T. W. Vascular endothelial growth factor induces rapid phosphorylation of tight junction proteins occludin and zonula occluden 1. A potential mechanism for vascular permeability in diabetic retinopathy and tumors. Journal of Biological Chemistry. 274 (33), 23463-23467 (1999).
  42. Argaw, A. T., Gurfein, B. T., Zhang, Y., Zameer, A., John, G. R. VEGF-mediated disruption of endothelial CLN-5 promotes blood-brain barrier breakdown. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (6), 1977-1982 (2009).
  43. Penn, J. S., et al. Vascular endothelial growth factor in eye disease. Progress in Retinal and Eye Research. 27 (4), 331-371 (2008).
  44. Worzfeld, T., Schwaninger, M. Apicobasal polarity of brain endothelial cells. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (2), 340-362 (2016).
  45. Roberts, R. L., Fine, R. E., Sandra, A. Receptor-mediated endocytosis of transferrin at the blood-brain barrier. Journal of Cell Science. 104, 521-532 (1993).
  46. Predescu, S. A., Predescu, D. N., Malik, A. B. Molecular determinants of endothelial transcytosis and their role in endothelial permeability. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 293 (4), 823-842 (2007).
  47. Nguyen, L. N., et al. Mfsd2a is a transporter for the essential omega-3 fatty acid docosahexaenoic acid. Nature. 509 (7501), 503-506 (2014).
  48. Pulgar, V. M. Transcytosis to cross the blood brain barrier, new advancements and challenges. Frontiers in Neuroscience. 12, 1019(2018).
  49. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
  50. Maurissen, T. L., et al. Microphysiological neurovascular barriers to model the inner retinal microvasculature. Journal of Personalized Medicine. 12 (48), 148(2022).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Эндотелиальный трансцитозHRMECизмерение TEERтранспортопосредованный кавеоламиклатрин-зависимый трансцитозсигнальный путь Wntпероксидаза хренапоглощение трансферрина
Анализ трансцитоза эндотелиальных клеток как модель in vitro для оценки проницаемости внутреннего барьера крови и сетчатки
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.