Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Мышиная модель легочного фиброза, вызванного распылением назального блеомицина

4.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/64097

⸱

20 января 2023 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pulmonary and Critical Care Medicine, Center of Respiratory Medicine, China-Japan Friendship Hospital, National Clinical Research Center for Respiratory Diseases, Institute of Respiratory Medicine, Chinese Academy of Medical Sciences, 2Graduate School of Peking Union Medical College, Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College, 3Capital Medical University, 4Beijing University of Chinese Medicine, 5Tianjin Chest Hospital, 6Institute of Clinical Medical Sciences, China-Japan Friendship Hospital, 7Beijing Key Laboratory for Immune-Mediated Inflammatory Diseases, Institute of Clinical Medical Sciences, China-Japan Friendship Hospital

В этой статье

Краткое содержание

Были созданы различные животные модели легочного фиброза с использованием блеомицина для уточнения патогенеза легочного фиброза и поиска новых мишеней для лекарств. Тем не менее, большинство моделей легочного фиброза, нацеленных на легочную ткань, имеют неравномерное введение препарата. В данной работе мы предлагаем модель равномерного легочного фиброза, вызванного назальной небулизацией блеомицина.

Аннотация

Фиброз легких характерен для нескольких заболеваний легких человека, которые возникают по различным причинам. Учитывая, что варианты лечения довольно ограничены, мышиные модели продолжают оставаться важным инструментом для разработки новых антифибротических стратегий. В этом исследовании внутрилегочное введение блеомицина (BLM) осуществляется путем небулизации носа для создания мышиной модели легочного фиброза, которая точно имитирует клинические характеристики заболевания. Мыши C57BL/6 получали BLM (7 ЕД/мл, 30 мин/сут) путем небулизации носа в течение 3 дней подряд и были умерщвлены на 9, 16 или 23 день для наблюдения за воспалительными и фиброзными изменениями в легочной ткани. Назальный аэрозольный BLM был направлен непосредственно на легкие, что приводило к широкому и равномерному воспалению легких и фиброзу. Таким образом, мы успешно создали экспериментальную мышиную модель типичного легочного фиброза человека. Этот метод может быть легко использован для изучения влияния введения различных назальных аэрозолей на патофизиологию легких и валидации новых противовоспалительных и антифибротических методов лечения.

Введение

Легочный фиброз – это прогрессирующий патологический процесс, при котором чрезмерное отложение компонентов внеклеточного матрикса, в первую очередь коллагена I типа, в интерстиции легких приводит к нарушению функции легких1. Патофизиология легочного фиброза сложна, и возможности лечения в настоящее время весьма ограничены. Мышиные модели остаются важным инструментом для изучения патогенетических механизмов, способствующих возникновению и прогрессированию заболевания, а также новых стратегий разработки лекарств.

Различные животные модели легочного фиброза основаны на интратрахеальном инстилляции BLM 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Тем не менее, распределение фиброзных изменений, которые вызывает BLM в легких, неравномерно, и животные подвержены риску удушья в процессе закапывания. Хотя внутрибрюшинное введение BLM вызывает относительно равномерные фиброзные изменения в легких, оно требует многократных доз из-за недостаточного нацеливания препарата. Внутритрахеальное введение аэрозоля через ларингоскоп не требует трахеотомии или пункции, а полученное в результате распределение препарата в легких является оптимальным. Однако аэрозольные частицы имеют большие размеры (5-40 мкм) и, таким образом, не могут достичь субплевральной области легочной ткани.

В данном исследовании внутрилегочное введение BLM осуществляется методом назальной небулизации. Во время распыления мыши самопроизвольно дышали и вдыхали частицы препарата. Аэрозольные частицы имели размер 2,5-4 мкм, что позволяло им не только равномерно распределяться по всему легкому, но и достигать субплевральной области. При малом увеличении наиболее значимыми гистопатологическими особенностями легких у пациентов с идиопатическим легочным фиброзом (ИЛФ) являются различная тяжесть поражений, непоследовательное распределение, чередование различных фазовых поражений, а также наличие интерстициального воспаления, фиброзных поражений и сотовых изменений легких, чередующихся с нормальной легочной тканью. Эти патологические изменения преимущественно затрагивают периферическую субплевральную паренхиму или лобулярную перегородку вокруг бронхиол. Таким образом, учитывая, что такой подход позволяет частицам BLM достигать субплевральной области легких, данная модель точно имитирует клинические характеристики заболевания у человека.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Комитет по исследованиям на животных Больницы китайско-японской дружбы (Пекин, Китай) одобрил все процедуры на мышах, которые были выполнены в рамках этого исследования (NO190108). Мышей содержали в стерильном помещении для животных Китайско-японского института клинических медицинских исследований дружбы при комнатной температуре 20-25 °C, относительной влажности 40-70%, интенсивности света животных 15-20 лк, чередовании света и темноты в течение 12 часов/12 часов. Животные имели свободный доступ к пище и воде.

1. Мыши

  1. Убедитесь, что все животные акклиматизированы в жилом помещении за 7 дней до распыления.
  2. Для распыления используйте мышей-самцов C57BL/6 в возрасте 8-10 недель.

2. Небулайзеризация назального блеомицина

  1. Приготовление блеомицина
    ВНИМАНИЕ: BLM - это химический яд, который убивает опухоли, но также может повредить нормальные клетки и нормальные ткани.
    1. Приготовьте раствор BLM на чистом стенде.
      1. Для получения рабочей концентрации (7 Ед/мл) ресуспендировать 15 Ед гидрохлорида BLM в 2,14 мл нормального физиологического раствора. Тщательно перемешайте ресуспендированный BLM до полного растворения.
    2. Храните рабочий раствор при температуре 4 °C или на льду и используйте в течение 1 суток. Перед распылением доведите раствор BLM до комнатной температуры.
  2. Анестезия
    1. Подготовьтесь к анестезии, растворив 0,1 г пентобарбитала натрия в 10 мл обычного физиологического раствора. Храните рабочий раствор для анестезии в темном месте при температуре 4 °C и используйте в течение 3 дней.
    2. Обезболивайте мышей путем введения пентобарбитала натрия в брюшную полость с помощью шприца объемом 1 мл с иглой 26 г в окончательной дозе 75 мг/кг массы тела.
      Примечание: В этом исследовании мыши не реагировали на эту дозу в течение как минимум 30 минут. При необходимости корректируйте дозу по согласованию с ветеринарным врачом в соответствии с реакцией мыши.
    3. Через несколько минут надавите на пальцы ног мыши, находящейся под наркозом, указательным и большим пальцами, чтобы убедиться, что рефлекс отведения конечности исчез.
  3. Подготовка системы распыления
    1. После калибровки прибора закрепите мышь под наркозом мягкой сетчатой крышкой (рис. 1А), добавьте рабочий раствор BLM в верхнюю распылительную головку экспонируемой башни с помощью пипетки (рис. 1В) и запустите небулайзер в течение 30 мин для достижения стабильного распыления.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочий процесс показан на рисунке 1C,D. Подробные инструкции по работе с программным обеспечением см. на Дополнительном рисунке S1 и Дополнительном рисунке S2, которые иллюстрируют шаги 2.3.1.1-2.3.1.9.
      1. Дважды щелкните по значку flexiWare 8 (дополнительный рисунок S1A), нажмите на сеанс экспериментирования (дополнительный рисунок S1B) и нажмите кнопку « Новое исследование » (дополнительный рисунок S1C).
      2. Измените название эксперимента (дополнительный рисунок S1D) и заголовок и владельца (дополнительный рисунок S1E).
      3. Выберите шаблон IX-4DIO (Дополнительный рисунок S1F), введите оператор (Дополнительный рисунок S1G), нажмите кнопку «Подтвердить » (Дополнительный рисунок S1H) | Кнопка «Далее» (дополнительный рисунок S1I).
      4. Выберите насос и нажмите «Далее» (дополнительный рисунок S1J) | Кнопка "Далее" (Дополнительный рисунок S2A) | Кнопка «Далее» (дополнительный рисунок S2B) | Кнопка «Готово» (дополнительный рисунок S2C).
      5. Нажмите на настройки для Continuous-1Lmin (три точки, дополнительный рисунок S2D) | DIO1, установите Коэффициент заполнения (%) на 25% и нажмите OK (Дополнительный рисунок S2E).
      6. Нажмите DIO2, установите коэффициент заполнения (%) на 25%, а затем нажмите OK (дополнительный рисунок S2F).
      7. Нажмите кнопку DIO3, установите коэффициент заполнения (%) на 25%, а затем нажмите кнопку OK (дополнительный рисунок S2G).
      8. Нажмите кнопку DIO4, установите коэффициент заполнения (%) на 25%, а затем нажмите кнопку OK (дополнительный рисунок S2H).
      9. Нажмите верхнюю зеленую кнопку (слева), чтобы начать работу, и нажмите красную кнопку (справа), чтобы остановить работу. Нажмите x в правом верхнем углу, чтобы выйти (дополнительный рисунок S2I).
    2. В группе BLM распыляйте 12 мышей за раз, в общей сложности четыре раза, всего до 48 мышей. Распыляйте одновременно шесть мышей в нормальной контрольной группе с помощью физиологического раствора.
  4. Восстановление животных
    1. После лечения в небулайзере в течение 30 минут переместите мышь в клетку для восстановления, оборудованную грелкой.
    2. Наблюдайте за мышами до тех пор, пока они не придут в полное сознание.
    3. Как только подтвердится, что мышь находится в хорошем состоянии, что означает, что она может свободно двигаться, верните ее в исходную клетку. Не помещайте его вместе с другими животными, пока он полностью не выздоровеет.
    4. Проверяйте физиологические показатели, включая частоту дыхания, выживаемость и любые симптомы, дважды в течение 24 часов после лечения BLM.

3. Обработка легочной ткани

  1. Через 9, 16 и 23 дня после введения BLM принесите в жертву шесть мышей, введя им в брюшную полость пентобарбитал натрия (конечная доза 100 мг/кг массы тела).
  2. Удалите трахею и легкие и немедленно промойте холодным фосфатно-солевым раствором.
  3. Зафиксируйте левое легкое в 10% нейтральном формалиновом буфере на 24 ч до введения парафина.
  4. Окрашивание гематоксилин-эозином (H&E окрашивание)
    1. Обезвоживайте неподвижную легочную ткань в дегидраторе.
    2. Поместите обезвоженный блок легочной ткани в коробку для растворения воска при температуре 56 °C на 1 час.
    3. Для заделки залейте расплавленный парафин в формовочную коробку, а затем быстро поместите пропитанный парафином тканевый блок на дно формовочной коробки, охладите и затвердите.
    4. Закрепите встроенный восковой блок на микротоме, отрегулируйте стол для нарезки вверх и вниз в нужное положение, нажмите на лезвие, отрегулируйте масштаб и отрежьте ломтик толщиной 4 мкм. С помощью пинцета поместите ломтик в коробку, наполненную водой, чтобы развернуть ее (лицевой стороной вверх).
    5. Залатать и запечь ломтики. После того как восковой срез полностью развернется, приложите предметное стекло к восковому срезу под углом 135°, с помощью пинцета переместите восковой срез на предметное стекло, поднимите предметное стекло и при необходимости отрегулируйте положение воскового слияния. Поместите предметные стекла с установленными восковыми ломтиками на стол с постоянной температурой при температуре 47 °C на 1 минуту, чтобы снова дать ломтикам развернуться Когда ломтики станут полностью плоскими, поместите предметные стекла в инкубатор с температурой 62 °C на 1 час.
    6. Для депарафинизации дважды поместите запеченные предметные стекла в ксилол на 20 минут.
    7. Для регидратации поместите предметные стекла в серию с градуированным содержанием алкоголя для регидратации срезов легочной ткани: 100% спирт на 2 мин, 95% спирт на 1 мин, 90% спирт на 1 мин, 85% спирт на 1 мин, 75% спирт на 1 мин и дистиллированная вода на 3 мин.
    8. Окрашивайте срезы в гематоксилин в течение 5 мин. Дважды постирать в течение 1 минуты, затем поместить в 0,5% раствор соляной кислоты для дифференциации спирта на 5 секунд, дважды промыть водой в течение 1 минуты, поместить в раствор для окрашивания «Синь» на 8-10 секунд, дважды прополоскать водопроводной водой, и запачкать эозином в течение 30 секунд.
    9. Для обезвоживания и задержания поместите испачканные участки в 75% спирт на 1 мин, 85% спирт на 1 мин, 90% спирт на 1 мин, 95% спирт на 1 мин, 100% спирт на 1 мин, а затем дважды на 1 мин ксилол и удалите всю оставшуюся жидкость абсорбирующей бумагой.
    10. Для монтажа нанесите каплю нейтрального герметизирующего раствора на середину среза и установите покровное стекло.
  5. Стандарт морфологической градации легочной ткани мыши
    1. Используя метод, описанный Ashcroft et al., попросите исследователя, ослепленного экспериментальной группой, случайным образом выбрать три микроскопических поля из каждого образца и наблюдать за степенью легочного фиброза при 100-кратном увеличении: степень 0, нормальное легкое; 1 степень, слегка отечные альвеолы, локализованный фиброз легкой степени; 2 степень, выраженный фиброз (толщина альвеолярной стенки более чем в три раза от нормы), с фиброзными очагами; 3 степень, сплошные участки фиброза (толщина альвеолярной стенки в три раза больше нормы); 4 степень, сращение фиброзных очагов, при этом фиброзная зона составляет менее 10% легочной ткани; 5 степени фиброзные очаги сросшиеся, площадь фиброза составляет от 10% до 50%, а альвеолярная структура значительно повреждена; 6 степень, большие сплошные фиброзные очаги (более 50% легочной ткани); 7 степень, альвеолярное пространство заполнено фиброзной тканью, присутствуют легочные буллы; 8 степень, полный фиброз.
    2. Назначьте балл, соответствующий оценке, каждому полю зрения (например, оценка 4 равна четырем баллам) и оцените каждую группу из шести образцов отдельно.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Повреждение легких было вызвано распылением BLM, а контрольные животные были распылены тем же объемом нормального физиологического раствора. Мышей распыляли один раз в день в течение 3 дней по 30 минут в день, используя концентрацию BLM 7 Ед/мл. Мышей приносили в жертву на 9, 16 и 23 день после введения BLM для окрашивания H&E (рисунок 2B). В легких мышей, получавших BLM, наблюдались диффузные легочные поражения с потерей нормальной альвеолярной архитектуры, утолщением перегородки, увеличением альвео...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Интратрахеальная инъекция блеомицина приводит к острой воспалительной и фиброзной реакции в обоих легких и может считаться эффективным подходом к созданию экспериментальной мышиной модели интерстициального заболевания легких человека. Интратрахеальное введение является наиболее часто используемым путем введения 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Работа выполнена при поддержке Национального фонда естественных наук Китая (No 92068108).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
  блеомицинBioway/Nippon Kayaku Co Ltd  DP721Модельные препараты от фиброза
0,9% физиологического раствора для инъекцийBaxter Healthcare(Tianjin) Co., Ltd.Препарат Бломицин
1 мл шприцBD300481Обезболивание животных
10% нейтральный формалиновый буферTechaLab Biotech CompanyФикс легочной ткани
15 мл центрифужная пробиркаcorning430790Подготовка к анестезии
20° C холодильникNew-fly groupBCD-213KМагазин лекарств
4° C холодильникNew-fly groupBCD-213K Магазинлекарств
Adobe illustrator cc2020AdobeProcess изображения
синяя спина жидкостьПекин Chemical Worksокрашивание тканей
чистая скамейкаСучжоу Суцзе Очистительное оборудование Ко., Лтд.Жидкость
для дифференцировкиБломицин Пекинский химический заводокрашивание тканей
Электронные весыМЕТТЛЕР ТОЛЕДОАА-160Подготовка к анестезии
окрашивание эозином ПекинYili Fine Chemicals Co,Ltd.окрашивание тканей
грелкаHIDOMИнкубация мышей окрашивание
гематоксилином BeijingYili Fine Chemicals Co,Ltd.окрашивание тканей
фосфатно-солевой буфер (PBS)HycloneSH30256.01Чистая легочная ткань
для рисования PhotoshopAdobe Process images
SCIREQ INEXPOSEEMKA Biotech Beijing Co., Ltd.Распылительный аппарат
Вертикальный флуоресцентный микроскопOlympusBX53Наблюдайте за срезом
препарата Программа

Ссылки

  1. Raghu, G., et al. Diagnosis of idiopathic pulmonary fibrosis. An official ATS/ERS/JRS/ALAT clinical practice guideline. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 198 (5), e44-e68 (2018).
  2. Moore, B. B., Hogaboam, C. M. Murine models of pulmonary fibrosis. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 294 (2), L152-L160 (2008).
  3. Degryse, A. L., et al. Repetitive intratracheal bleomycin models several features of idiopathic pulmonary fibrosis. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (4), L442-L452 (2010).
  4. Sueblinvong, V., et al. Predisposition for disrepair in the aged lung. The American Journal of the Medical Sciences. 344 (1), 41-51 (2012).
  5. Peng, R., et al. Bleomycin induces molecular changes directly relevant to idiopathic pulmonary fibrosis: a model for "active" disease. PLoS One. 8 (4), e59348(2013).
  6. Izbicki, G., et al. Time course of bleomycin-induced lung fibrosis. International Journal of Experimental Pathology. 83 (3), 111-119 (2002).
  7. Aguilar, S., et al. Bone marrow stem cells expressing keratinocyte growth factor via an inducible lentivirus protects against bleomycin-induced pulmonary fibrosis. PLoS One. 4 (11), e8013(2009).
  8. Ortiz, L. A., et al. Mesenchymal stem cell engraftment in lung is enhanced in response to bleomycin exposure and ameliorates its fibrotic effects. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (14), 8407-8411 (2003).
  9. Rojas, M., et al. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells in repair of the injured lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 33 (2), 145-152 (2005).
  10. Ortiz, L. A., et al. Interleukin 1 receptor antagonist mediates the antiinflammatory and antifibrotic effect of mesenchymal stem cells during lung injury. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (26), 11002-11007 (2007).
  11. Foskett, A. M., et al. Phase-directed therapy: TSG-6 targeted to early inflammation improves bleomycin-injured lungs. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), L120-L131 (2014).
  12. Hecker, L., et al. Reversal of persistent fibrosis in aging by targeting Nox4-Nrf2 redox imbalance. Science Translational Medicine. 6 (231), 231ra47(2014).
  13. Taooka, Y., et al. Effects of neutrophil elastase inhibitor on bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice. American Journal of Respiratory & Critical Care Medicine. 156 (1), 260-265 (1997).
  14. Gharaee-Kermani, M., Ullenbruch, M., Phan, S. H. Animal models of pulmonary fibrosis. Methods in Molecular Medicine. , 251-259 (2005).
  15. Orlando, F., et al. Induction of mouse lung injury by endotracheal injection of bleomycin. Journal of Visualized Experiments. (146), e58902(2019).
  16. Moore, B. B., et al. Animal models of fibrotic lung disease. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (2), 167-179 (2013).
  17. Gauldie, J., Kolb, M. Animal models of pulmonary fibrosis: how far from effective reality. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 294 (2), L151(2008).
  18. Jenkins, R. G., et al. An official American thoracic society workshop report: use of animal models for the preclinical assessment of potential therapies for pulmonary fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 56 (5), 667-679 (2017).
  19. Moeller, A., et al. The bleomycin animal model: A useful tool to investigate treatment options for idiopathic pulmonary fibrosis. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 40 (3), 362-382 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

C57BL 6
Мышиная модель легочного фиброза, вызванного распылением назального блеомицина
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.