Метод пилинга:метод крио-ЭМ-пробоподготовки для отделения отдельных слоев от многослойных или концентрированных биологических образцов

Краткое содержание

Метод пилинга-пятнистости представляет собой метод крио-ЭМ-подготовки сетки, который позволяет разделять многослойные и концентрированные биологические образцы на отдельные слои для уменьшения толщины, увеличения концентрации образца и облегчения обработки изображений.

Аннотация

Метод подготовки крио-ЭМ-сетки с пилингом представляет собой значительно модифицированный метод обратной инъекции с целью достижения уменьшения слоев многослойных образцов. Это удаление слоев перед погружением замораживания может помочь уменьшить толщину образца до уровня, подходящего для сбора крио-ЭМ данных, улучшить плоскостность образца и облегчить обработку изображений. Метод пилинга-блоттинга позволяет разделить многоламеллярные мембраны на отдельные слои, слоистые 2D-кристаллы на отдельные кристаллы и уложенные листообразные структуры растворимых белков также быть разделенными на отдельные слои. Высокая толщина образцов этих типов образцов часто создает непреодолимые проблемы для сбора крио-ЭМ данных и крио-ЭМ обработки изображений, особенно когда ступень микроскопа должна быть наклонена для сбора данных. Кроме того, сетки с высокими концентрациями любого из этих образцов могут быть подготовлены для эффективного сбора данных, поскольку концентрация образца до подготовки сетки может быть увеличена, а метод шелушения-пятна скорректирован таким образом, чтобы привести к плотному распределению однослойного образца.

Введение

Метод пилинга-блоттинга был разработан для того, чтобы разделить сложенные двумерные кристаллы мембранных белков на отдельные слои для получения достаточно тонких образцов для сбора крио-ЭМ 2D и 3D данных и облегчения обработки изображений¹. Протокол также подходит для других типов многоламерных образцов, а также для достижения высоких концентраций образцов любого типа образца на сетке без увеличения толщины в Z.

Уменьшение слоев образца до одного слоя достигается путем применения комбинации капиллярного давления и сил сдвига в протоколе, который существенно расширяет и модифицирует метод обратной инъекции

Протокол

1. Этапы подготовки к технике пилинг-блоттинг

ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка требует размещения следующих предметов рядом друг с другом.

1. Сложите два куска фильтровальной бумаги размером 20-25 мкм (см. Таблицу материалов).
2. Поместите парафиновую пленку длиной ~8 см х 10 см рядом с фильтровальной бумагой вверх.
3. Поместите кусочек субмикронной фильтровальной бумаги поверх двух дополнительных кусочков фильтровальной бумаги No4 (рисунок 1-1).
4. Расположите антикапиллярные щипцы с согнутой ногой вверх и прямой ногой вниз. Затем выберите се....

Результаты

Успешный эксперимент с шелушением приведет к созданию отдельных слоев образцов в часто высоких концентрациях. Следует ожидать, что некоторые области в большинстве квадратов сетки по-прежнему будут содержать несколько слоев, особенно при меньшем количестве итераций шагов отслаивания. Большинство квадратов сетки, однако, будут содержать обширные области одиночных слоев, как это наблюдается для 2D-кристаллов человеческой лейкотриен-С4-синтазы (рисунок 2) и липосом (добавленных на этапе 3.2,

Обсуждение

Пил-блоттинг является мощным методом преодоления укладки и толщины многослойных 2D-кристаллов и аналогичных образцов для сбора крио-ЭМ данных и обработки изображений. Решение об использовании пилинга будет основываться на биологических параметрах образца, а также потребует оценки после того, как будет доступна 3D-крио-ЭМ-модель. Биологическая важность контактов и потенциальная гибкость регионов контактов будут особенно важны в этой оценке.

Количество отслаивающихся пятен первоначально будет ус.......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Сетки на 600 меш	SPI	2060-C-XA
Антикапиллярные щипцы	Ted Pella	510-5
Carbon для покрытия слюды
Cryo-EM			сетки Cryo-EM могут быть экранированы при напряжении 120 кВ или 200 кВ. Данные с высоким разрешением собираются при напряжении 300 кВ.
Щипцы Dumpont #5	Тед Пелла	5622
Сетчатый ящик для хранения крио-ЭМ	Тед Пелла	160-40
Салфетки
Жидкий азот
Слюда	Тед Пелла	56	Слюда покрыта углеродом и разрезана на квадраты, которые немного больше, чем сетка ПЭМ. Толщина углерода может потребовать оптимизации, чтобы избежать тонкого углерода, который легко разрушается при многократном отслаивании.
Отрицательное окрашивание			1-2% уранилацетатом подходит для многих образцов. Другие красители, такие как фосфовольфрамовая кислота, могут быть заменены.
Парапленочный
контейнер			Используется для остекловывания сетки peel-blot. Транспортный контейнер из полистирола может быть переработан для этой цели и облицован алюминиевой фольгой.
Субмикронная фильтровальная бумага	MilliporeSigma	DAWP04700
Пропускающий электронный микроскоп	JEOL	JEM-1400	Любой ПЭМ, работающий на ускоряющем напряжении 80-120 кВ, подойдет для экранирования отрицательно окрашенных сеток.
Трегалоза			Приготовьте 4% раствор трегалозы.
Ватман #4 фильтровальная бумага	MilliporeSigma	WHA1004150	Это соответствует 20-25 мкм; m размер пор фильтровальной бумаги в протоколе.

Ким из полистирола