Использование биполярного электрода для создания модели мышиной эпилепсии височной доли путем электрического растопления миндалевидного тела

Summary

Миндалевидное тело играет ключевую роль в височной эпилепсии, которая возникает и распространяется из этой структуры. В этой статье приведено подробное описание изготовления глубоких электродов мозга, обладающих как записывающей, так и стимулирующей функциями. Он представляет модель медиальной височной эпилепсии, происходящей из миндалевидного тела.

Abstract

Миндалевидное тело является одним из наиболее распространенных источников судорог, и модель миндалевидного тела у мыши необходима для иллюстрации эпилепсии. Тем не менее, лишь немногие исследования подробно описали экспериментальный протокол. В данной работе проиллюстрирован весь процесс создания модели эпилепсии при электрическом разжигании миндалевидного тела с внедрением метода изготовления биполярных электродов. Этот электрод может как стимулировать, так и записывать, уменьшая травму головного мозга, вызванную имплантацией отдельных электродов для стимуляции и записи. Для длительной записи электроэнцефалограммы (ЭЭГ) использовались контактные кольца для устранения прерывания записи, вызванного спутыванием и падением кабеля.

После периодической стимуляции (60 Гц, 1 с каждые 15 мин) базолатеральной миндалины (AP: 1,67 мм, L: 2,7 мм, V: 4,9 мм) в течение 19,83 ± 5,742 раза, полное растопление наблюдалось у шести мышей (определяемое как индукция трех непрерывных эпизодов V степени, классифицированных по шкале Расина). На протяжении всего процесса растопки регистрировалась внутричерепная ЭЭГ, а после растопки наблюдался эпилептический разряд в миндалине продолжительностью 20-70 с. Таким образом, это надежный протокол моделирования эпилепсии, происходящей из миндалевидного тела, и метод подходит для выявления роли миндалевидного тела в височной эпилепсии. Это исследование способствует будущим исследованиям механизмов мезиальной височной эпилепсии и новых противоэпилептогенных препаратов.

Introduction

Височная эпилепсия (TLE) является наиболее распространенным типом эпилепсии и имеет высокий риск превращения в лекарственно-устойчивую эпилепсию. Хирургическое вмешательство, такое как селективная миндалевидное тело, является эффективным методом лечения TLE, а эпилептогенез и ихтогенез заболевания все еще исследуются ^1,2. Было показано, что патогенез TLE происходит не только в гиппокампе, но и в миндалине ^3,4. Например, как склероз миндалевидного тела, так и увеличение миндалевидного тела часто сообщаются как о происхождении судорог TLE ^5,6. Важность миндалевидного тела нельзя недооценивать; Миндалевидное тело имеет важное значение для изучения эпилептогенеза, и срочно необходима четкая иллюстрация этой модели.

Было предложено несколько подходов для индукции судорог на животных моделях. В прошлом противосудорожные препараты вводили внутрибрюшинно на ранней стадии⁷. Хотя этот метод был удобен, расположение эпилептических очагов было неопределенным. С развитием стереотаксических технологий и подробного атласа мозга животных для решения проблемы локализации стало применяться внутричерепное введение препарата⁸. Однако отсутствие вмешательства при тяжелых припадках в острой стадии приводило к высокой смертности, а хронические спонтанные припадки сопровождались проблемой нестабильной межприступной частоты и частоты приступов ^9,10. Наконец, был разработан метод электрической растопки; Этот метод периодически стимулирует определенные области мозга несколько раз, позволяя вызывать судороги с определенным контролем как местоположения, так и времени начала¹¹.

Преимуществом этого метода является то, что внутричерепная имплантация электродов является малоинвазивной¹². Кроме того, тяжесть припадка можно контролировать путем прекращения раздражителей, что снижает смертность, вызванную судорогами. Эти изменения устранили недостатки предыдущих подходов. Примечательно, что эта модель может адекватно имитировать судороги человека и особенно подходит для изучения эпилептического статуса (SE) из-за ее способности быстро индуцировать SE¹³. Он также может быть использован для скрининга противоэпилептических препаратов¹⁴ и в исследованиях механизма эпилепсии. Наконец, хорошо известно, что миндалевидное тело тесно связано с модуляцией памяти, обработкой вознаграждения и эмоциями¹⁵. Расстройства этих психических функций часто встречаются у пациентов с эпилепсией, и, таким образом, модель миндалевидного тела эпилепсии может быть лучшим выбором для изучения эмоциональных проблем при эпилепсии¹⁶.

Protocol

Этот эксперимент был одобрен Комитетом по этике экспериментальных животных больницы Сюаньу Столичного медицинского университета. Все мыши содержались в лаборатории на животных больницы Сюаньу Столичного медицинского университета. Этот протокол разделен на четыре части. Первые две части знакомят с методом построения электрода и электрической цепи с использованием контактного кольца для соединения электродов и оборудования для записи/стимуляции ЭЭГ. В третьей части описан метод операции по имплантации электродов, а в четвертой части представлены параметры регистрации и стимуляции ЭЭГ, используемые для модели эпилепсии миндалевидного тела.

1. Изготовление электродов

1. Держите наготове следующие заранее подготовленные материалы: два куска вольфрамовой проволоки с тефлоновым покрытием длиной 3 см (голый диаметр: 76,2 мкм), один кусок серебряной проволоки (голый диаметр: 127 мкм) той же длины и один набор штифтов 2 x 2 калибра.
2. Используйте зажигалку, чтобы сжечь один конец каждой вольфрамовой проволоки, чтобы удалить 5 мм изоляционного покрытия.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Вольфрамовый провод со снятой изоляцией становится черным; Эта часть вольфрамовой проволоки называется верхним концом.
3. Очистите отрезок ультратонкой многожильной проволоки и оберните его снизу вверх, где он начнет темнеть, продолжая движение к верху. Объедините эту сверхтонкую проволоку (имеет мягкую текстуру) с вольфрамовой проволокой, зажав один конец и осторожно скрутив другой конец, что позволяет легко переплетать два материала вместе.
4. Аккуратно потяните, чтобы убедиться, что они плотно обмотаны, и отрежьте лишнюю сверхтонкую проволоку. Старайтесь, чтобы вольфрамовая проволока была прямой на протяжении всего процесса.
5. Прикрепите рядной штифт к зажиму на сварочном столе более длинной стороной штифтов наружу. Используйте иглу шприца, чтобы набрать немного паяльной пасты и нанести ее на штифты. Нагрейте сварочную горелку до 320 °C; Расплавьте и намажьте наконечником горелки немного бессвинцовой оловянной проволоки.
6. Перекройте верхний конец вольфрамовой проволоки одной иглой рядных штифтов и используйте припой на горелке, чтобы прикрепить вольфрамовую проволоку к штифту.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Было бы очень сложно сварить вольфрамовую проволоку со штифтами напрямую без помощи сверхтонкой проволоки.
7. Таким же образом приварите еще одну вольфрамовую проволоку и еще одну серебряную проволоку к рядному штифту так, чтобы каждая проволока соответствовала игле (см. рис. 1,i).
8. Отрежьте две термоусадочные трубки чуть длиннее верхнего конца вольфрамовой проволоки. Наденьте их на паяное соединение двух вольфрамовых проводов, убедившись, что проводящая часть полностью покрыта трубкой, чтобы цепь двух вольфрамовых проводов не была размещена последовательно.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что есть три провода, если два из них изолированы, три провода не будут идти последовательно; К серебряной проволоке также можно добавить трубку.
9. Снимите электрод с зажима сварочного стола и осторожно удерживайте электрод большими плоскогубцами, так как электроды легко теряют свою форму при нагреве термоусадочной трубки, используя зажим с хорошей теплопроводностью с немного большей силой.
10. Включите воздуховод и нагревайте до тех пор, пока не будет достигнута температура 320 °C. Продуйте термоусадочную трубку в течение нескольких секунд, пока она не затянется (см. рис. 1,ii).
11. Если иглы отделяются от пластикового корпуса в процессе сварки, соедините сварочную часть и пластиковый корпус клеем-расплавом (см. рис. 1,iii). Будьте осторожны, чтобы не размазать его по интерфейсу, так как это может повлиять на вставку интерфейса.
12. Возьмитесь за две вольфрамовые проволоки и скрутите их вместе, держа их концы друг от друга (см. рис. 1,iv). Обрежьте скрученные вольфрамовые провода примерно до 10 мм в длину так, чтобы расстояние на концах не превышало 0,5 мм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг также может быть выполнен перед имплантацией электрода, чтобы обеспечить гибкую регулировку длины электрода.
13. Нагрейте клеевой пистолет и равномерно нанесите клей вокруг электрода.
14. Проверьте электроды мультиметром: поместите один стержень мультиметра на несваренную сторону рядных штифтов, а конец вольфрамовой проволоки или серебряной проволоки аккуратно прикоснитесь к другому стержню, проверяя, ровная ли цепь. Следите за тем, чтобы линии не располагались последовательно.

2. Соединение контактного кольца и описание схемы

ПРИМЕЧАНИЕ: Когда электроды на мышах подключены к устройству ЭЭГ через кабели в свободно движущемся состоянии, кабели могут запутаться, когда мыши движутся и поворачиваются. Это приводит к тому, что кабели становятся короче, что в конечном итоге мешает мышам двигаться или приводит к тому, что кабели падают с их голов. В описанном здесь способе вводится четырехканальное контактное кольцо для предотвращения падения кабелей. Четыре канала представлены четырьмя цветами на рисунке 1B.

1. Снимите по 5 мм изоляционной оболочки с каждого конца, чтобы обнажить металлическую проволоку внутри.
2. Добавьте отрезок термоусадочной трубки к каждому проводу статора.
3. Приварите каждый провод к штекеру разъема устройства ЭЭГ.
4. Сожмите термоусадочную трубку горячим воздухом.
5. Добавьте отрезок термоусадочной трубки к каждому проводу ротора.
6. Прикрутите проводящие части красного и оранжевого проводов вместе и приварите их к стыку в коллекторе, чтобы он соответствовал рядному штифту.
7. Приварите два других провода на коллекторе к каждому стыку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Коричневый канал, соответствующий серебристому проводу, подключается к устройству ЭЭГ для заземления. Красный и оранжевый каналы принимают сигналы от одного и того же вольфрамового провода, а оранжевый канал служит опорным для устройства ЭЭГ. Сигналы в красном канале бессмысленны, но они должны сосуществовать с черным каналом, чтобы сформировать текущий стимул. Сигналы в черном канале являются реальными электрическими сигналами в мозге. Различные схемы могут быть спроектированы с многоканальными контактными кольцами для разных устройств.

3. Операция по имплантации

1. Животные
   1. Используйте для операций 8-недельных мышей-самцов C57BL / 6 дикого типа весом 24-26 г.
   2. Размещайте их в 12-часовом цикле свет-темнота (время освещения: 8:00-20:00) в среде с контролируемой температурой (22 ± 1 ° C) и обеспечьте воду и корм вволю.
   3. Используйте дополнительный нагревательный коврик, чтобы согреть животных во время операции.
   4. После операции вводят мелоксикам подкожно (10 мг/кг) в качестве первого введения анальгетиков. Затем поместите животных в отдельные клетки, чтобы оптимизировать восстановление. Добавляйте мелоксикам в рацион животного в течение первой недели после операции.
   5. После эксперимента под наркозом ввели в левый желудочки мышей 4% параформальдегид и собрали ткани мозга для гистологической проверки электродной мишени.
2. Взвесьте мышь и обезболите ее внутрибрюшинной инъекцией 1% раствора пентобарбитала. Стерилизуйте все хирургические инструменты и расходные материалы, которые будут использоваться, включая сверла, электроды, стоматологический цемент и т. Д., Путем автоклавирования.
3. Когда мышь полностью обезболит, сбрейте волосы от глаза до области уха бритвой.
4. Зафиксируйте мышь на стереотаксической рамке. Вставьте передние верхние зубы в резцовую планку и вставьте обе ушные планки одинаково глубоко в уши. Нанесите глазную мазь с эритромицином на глаза, чтобы предотвратить сухость и слепоту, вызванные ярким светом во время операции.
5. Продезинфицируйте операционную область тремя чередующимися тампонами йодофора и 75% спирта круговыми движениями. Затем сделайте сагиттальный разрез вперед от середины этого разреза и отрежьте кожу по обе стороны от разреза, чтобы создать треугольное окно.
6. Скатайте небольшой кусочек ваты в шарик и смочите его 3% перекисью водорода. Удалите мягкие ткани, прикрепленные к черепу, осторожно протирая открытую область небольшим ватным тампоном, пока не станут четко видны передний и задний родничок.
7. Отрегулируйте переднюю и заднюю высоту так, чтобы передний и задний родничок находились в горизонтальном положении. Считайте, что положение переднего родничка является началом осей.
8. Закрепите винт из нержавеющей стали на левом черепе мозжечка, используя дрель, чтобы создать плоскую поверхность. Убедитесь, что винт выступает наполовину из черепа.
9. Убедитесь, что координаты для разжигания миндалевидного тела составляют -1,67 мм сзади, -2,7 мм сбоку и -4,9 мм вентрально от брегмы. Отрегулируйте стереотаксическое устройство, чтобы найти это место и отметить его.
10. Просверлите отверстие в отмеченном месте сверлом для черепа диаметром 0,5 мм.
11. Прикрепите электроды к фиксирующему стержню стереотаксического устройства, поместите электрод вертикально над отверстием и медленно опустите положение до -4,9 мм. Трижды оберните серебряную проволоку вокруг винта, стараясь не трясти корпус электрода во время работы.
12. Смешайте зубной цемент и аккуратно нанесите его на электрод и поверхность черепа. Когда зубной цемент затвердеет, модифицируйте его снаружи до тех пор, пока цемент, окружающий неподвижный электрод, не превратится в конус.
13. Когда цемент затвердеет, освободите электрод от стереотаксического устройства. Подкожно вводят мелоксикам 10 мг / кг для облегчения дискомфорта, вызванного болью у животных. Вводят мелоксикам в животную пищу для обезболивающего эффекта в первую неделю после операции. Выньте мышь и поместите ее обратно в клетку, держа ее отдельно от других мышей.

4. Электрическая растопка

1. Дайте мышам отдохнуть не менее 1 недели после операции перед растопкой, чтобы обеспечить послеоперационное восстановление и позволить воспалению утихнуть.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, мыши, которые не восстановились должным образом, плохо реагируют на растопку.
2. Поместите мышь в индивидуальную коробку с кабелями контактного кольца, соединяющими электрод на голове мыши и устройство ЭЭГ. Пропустите кабель через отверстие в крышке коробки и отрегулируйте длину, оставшуюся в коробке, чтобы мышь могла свободно двигаться.
3. Включите устройство ЭЭГ и проверьте, правильно ли оно работает. Настройте стимулятор на подачу монофазных прямоугольных импульсов с частотой 1 мс с частотой 60 Гц в течение 1 с.
4. Начните с силы тока 50 мкА для первой стимуляции; следить за ЭЭГ на предмет послеразряда, который характеризуется высокочастотными всплесками. Если после разряда не наблюдается, добавьте 25 мкА к следующему стимулу и продолжайте этот процесс каждые 10 минут, пока не будет наблюдаться послеразряд и не продлится 5 с.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если эксперимент не требует разряда, шаг 4.4 можно пропустить; 300 мкА достаточно прочно для растопки.
5. Стимулируйте мышь интенсивностью тока, определенной на шаге 4.3, каждые 15 минут, не более 20 раз в день.
6. Следите за поведенческими реакциями на стимул.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Появление трех последовательных эпизодов V класса считается полным растопкой в сочетании со стандартом^{ранга Расина 17}.

Results

Электрод и схема позволяют регистрировать ЭЭГ и функционировать как стимуляция (рис. 1); Эта установка позволяет избежать сложностей имплантации записывающих и стимулирующих электродов по отдельности и сводит к минимуму повреждение тканей мозга. Применение контактных колец позволяет подключать электроды ко всем типам устройств.

Мы провели операцию по имплантации электродов шести здоровым взрослым мышам-самцам C57BL/6, а электростимуляция была проведена через 2 нед...

Discussion

Эпилепсия – это группа заболеваний с множественными проявлениями и разнообразными причинами¹⁸; Следует отметить, что ни одна модель не может быть использована для всех типов эпилепсии, и исследователи должны выбрать подходящую модель для своего конкретного исследования. В настоящем исследовании представлен один из наиболее доступных методов изготовления электродов. Различные части этого метода могут быть скорректированы для адаптации к различным условиям эксперимента.

В...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488-конъюгированный Donkey anti-rabbit IgG	invitrogen	A-21206
c-Fos антитело		ab222699
Черепная бормашина	SANS SAS	SA302
стоматологический цемент	NISSIN
для записи и стимуляции ЭЭГ	Neuracle Technology (Changzhou) Co., Ltd	NSHHFS-210803
бессвинцовая оловянная проволока	BAKON
Контактный разъем / Гнездовой разъем	XIANMISI		расстояние 1,27 мм
Серебряная проволока	A-M системы	786000
Контактное кольцо	Senring Electronics Co.,Ltd	SNM008-04
Вольфрамовая проволока	A-M системы	796000
ультратонкая многостоечная проволока	Шэньчжэнь Чэнсин проволока и кабельное	сварочное оборудование UL10064-FEP
	BAKON	BK881