Стандартизированная подготовка коронарного кольца крысы и запись в режиме реального времени динамических изменений напряжения вдоль диаметра сосуда

Ишемическая болезнь сердца (ИБС) широко признана и обеспокоена как типичное и репрезентативное сердечно-сосудистое заболевание, являющееся основной причиной смерти как в развитых, так и в развивающихся странах ^1,2. В качестве пути снабжения кровью и кислородом для нормальной физиологической функции сердца циркулирующая кровь поступает и питает сердце через две основные коронарные артерии и кровеносную сосудистую сеть на поверхности миокарда ^3,4. Холестериновые и жировые отложения в коронарных артериях перекрывают кровоснабжение сердца и бурную воспалительную реакцию сосудистой системы, вызывая атеросклероз, стабильную стенокардию, нестабильную стенокардию, инфаркт миокарда или внезапную сердечную смерть ^5,6. В ответ на патологический стеноз коронарных артерий компенсаторно ускоренное физиологическое сердцебиение удовлетворяет кровоснабжение самого сердца или жизненно важных органов организма за счет увеличения выхода левого желудочка⁷. Если длительный коронарный стеноз вовремя не устранить, в определенных областях сердца могут развиться обширные новые кровеносные сосуды⁸. В настоящее время клиническое лечение ИБС часто принимает медикаментозный тромболизис или хирургический механический тромболизис и экзогенное бионическое сосудистое шунтирование с частыми лекарствами и большой хирургической инвалидностью⁹. Поэтому функциональное исследование физиологической активности коронарных артерий по-прежнему является актуальным прорывом при сердечно-сосудистых заболеваниях¹⁰.

Отсутствуют доступные технические средства для определения коронарной физиологической активности, за исключением беспроводных телеметрических систем, которые могут динамически регистрировать in vivo коронарное давление, сосудистое напряжение, насыщение крови кислородом и значения рН¹¹. Поэтому, учитывая текстурную тайну и сложность коронарных артерий, точная идентификация и изоляция коронарных артерий, несомненно, являются лучшим выбором для изучения нескольких механизмов ИБС in vitro⁴.

Серия мультимиографных систем, в частности проводной микрофотоскулярный детектор микрососудистого напряжения (см. Таблицу материалов), является очень зрелым рыночным устройством для регистрации изменений напряжения тканей in vitro малых сосудистых, лимфатических и бронхиальных трубок с характеристиками высокоточной и непрерывной динамической записи¹². Указанная система широко используется для регистрации характеристик натяжения тканей in vitro полостных структур диаметром от 60 мкм до 10 мм. Непрерывный нагрев особенностей платформы проволочной микрофотографии в значительной степени компенсирует стимуляцию неблагоприятной внешней среды. Между тем, постоянные входы газовой смеси и значения рН позволяют получить более точные данные о сосудистом напряжении в аналогичном физиологическом состоянии¹³. Однако, учитывая сложность анатомической локализации коронарных артерий крыс (рисунок 1), ее изоляция вызывает недоумение и ограничивает исследование механизма диверсифицированных сердечно-сосудистых заболеваний и разработку лекарств. Поэтому настоящий протокол подробно вводит анатомическое расположение и процесс разделения коронарной артерии крысы с последующим измерением напряжения на платформе проволочной микрофотографии¹⁴.

Протокол для животных был рассмотрен и одобрен Управляющим комитетом из Университета традиционной китайской медицины Чэнду (запись No 2021-11). Для настоящего исследования использовались самцы крыс Sprague Dawley (SD) (260-300 г, 8-10 недель). Крыс держали в камере для животных и могли свободно пить и есть во время эксперимента.

1. Приготовление раствора

1. Готовят физиологический солевой раствор (PSS), растворяя 118 мМ NaCl, 4,7 мМ K⁺, 2,5 мМ CaCl₂, 1,2 мМ KH₂PO₄, 1,2 мМ MgCl₂∙6H₂O, 25 мМ NaHCO₃, 11 мМ D-глюкозы и 5 мМ HEPES (см. Таблицу материалов).
2. Готовят раствор соли с высоким содержанием K⁺ , растворяя 58 мМ NaCl, 60 мМ K⁺, 2,5 мМ CaCl₂, 1,2 мМ KH₂PO4, 1,2 мМ MgCl₂∙6H₂O, 25 мМ NaHCO₃, 11 мМ D-глюкозы и 5 мМ HEPES.
3. Насытить два вышеуказанных раствора и пузырьком со смешанным газом 95%_O2 и 5% CO₂. Между тем, поддерживайте значения рН раствора между 7,38 и 7,42 с 2 мМ NaOH.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробной информации о приготовлении раствора, пожалуйста, смотрите ссылку¹⁵.

2. Рассечение коронарной артерии крысы

1. Обезболивают крысу путем вдыхания 2% изофлурана. Подтвердите глубокую анестезию щипкой пальцев ног и, при необходимости, введите дополнительные анестетики. Затем немедленно откройте грудную полость, чтобы обнажить сердце на переносном операционном столе после ранее опубликованного отчета¹².
2. После диссоциации и удаления сердца дренируют остаточную кровь из всех камер сердца, слегка сдавливая медицинскими пластическими щипцами. Быстро поместите предварительно обработанное сердце в чашку Петри, содержащую 95% O₂ + 5% CO₂ насыщенного PSS при 4 °C, имея значение рН 7,40.
3. Чтобы точно определить анатомическое положение коронарных артерий, скорректируйте положение изолированного сердца под световым микроскопом по принципиальной схеме (рисунок 2А).
   ПРИМЕЧАНИЕ: На фронтальном снимке правая ушная раковина и легочная артерия находились в верхнем левом и правом верхнем углу соответственно.
   1. Срежьте левую и правую желудочковую полости вдоль межжелудочковой перегородки от корня легочной артерии хирургическими ножницами и пинцетом (рисунок 2В).
4. Чтобы отделить левую и правую коронарные артерии от ткани миокарда, рассекните правый желудочек под оптическим анатомическим микроскопом, чтобы тщательно обнажить правую ветвь коронарной артерии. Затем определите положение левой коронарной артерии, повернув сердечную ткань на 45° по часовой стрелке (рисунок 2D).
5. После удаления окружающей липкой ткани миокарда явно различают пульсирующие левую (около 5 мм) и правую (около 5 мм) коронарные артерии. Немедленно отделите коронарные артерии посередине и полностью погрузите в ПСС при 4 °C. Приобретите артериальное кольцо размером около 2 мм, вертикально разрезав отделившуюся артерию анатомическими ножницами для регистрации сосудистого напряжения при различных раздражителях (рисунок 2Е).

3. Суспензия и фиксация артериального кольца

ПРИМЕЧАНИЕ: Подробную информацию об этом шаге см. в ссылке¹⁴.

1. Подготовьте две проволоки из нержавеющей стали по 2 см (см. Таблицу материалов) и предварительно замочите в растворе PSS при температуре 4 °C, насыщенном 95% O₂ + 5% CO₂. Пропустите оба провода параллельно через артериальное кольцо вместе с направлением сосуда под оптическим анатомическим микроскопом и с проводами одинаковой длины, выставленными на обоих концах сосудистой полости.
2. Зафиксируйте артериальное кольцо стальной проволокой спереди и сзади в ванне из проволоки на микрофотографии, заполненной пузырящейся ПСС с 95% O₂ + 5% CO₂. Поверните горизонтальную винтовую ручку для соответствующего переднего и заднего расстояния так, чтобы два провода были горизонтальными, а артериальное кольцо находилось в естественном состоянии расслабления.
3. После установки ванны DMT на термостатический аппарат откройте программное обеспечение для сбора данных (см. Таблицу материалов), чтобы убедиться, что был записан соответствующий сигнал пути. Установите следующие параметры: калибровка окуляра (мм/дел): 0,36; целевое давление (кПа): 13,3; IC1/IC100: 0,9; время онлайн-усреднения: 2 с; время задержки: 60 с. Этапы фиксации артериального кольца показаны на рисунке 3.

4. Стандартизация сосудистого напряжения в артериальном кольце крыс

ПРИМЕЧАНИЕ: Для различных образцов полостей для поддержания исключительной активности in vitro сосудам требовалось оптимальное начальное натяжение. Более подробную информацию см. в ссылке¹⁵.

1. Достигните оптимального начального натяжения артериального кольца, применяя разумное напряжение по диаметру сосуда.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На основе предыдущего исследования¹⁶ максимальное напряжение, вызванное агонистами, было достигнуто при значении коэффициента k 0,90 при начальном растяжении 1,16 ± 0,04 мН/мм (контрольные значения для различных образцов сосудов: значение k, 0,90-0,95; начальное напряжение, 1,16-1,52 мН/мм).
2. В этот момент установите отображаемое значение сосудистого напряжения равным нулю. После этого нанесите стимул 3 мН на артериальное кольцо, вращая спиральную ось ванны.
3. После инкубации в течение 1 ч в насыщенном кислородом PSS буфере при 37 °C, рН 7,40, снова установите значение натяжения 0 мН на панели управления натяжением проволочной микрофотографии. Процесс установки начального натяжения артериального кольца показан на рисунке 4.

5. Определение реактивности коронарного кольца

1. Выполняют сократительную активность коронарного кольца с помощью проводного миографа по методике^{14 и проверяют} в трех отдельных операциях, стимулируя 60 мМ раствора К⁺ в течение 10 мин каждая.
2. После каждой стимуляции промывайте ванну насыщенным кислородом ПСС до тех пор, пока тонус сосудов не вернется в исходное состояние.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Только когда флуктуация напряжения трех параллельных измерений составляла менее 10%, а амплитуда каждого сокращения превышала 1 мН/мм, для дальнейших экспериментов можно было использовать квалифицированные и высокоактивные артериальные кольца. Проверка активности коронарного кольца крысы показана на рисунке 5.

6. Послеоперационное лечение

1. После операции усыплите животных в соответствии с институционально утвержденными протоколами.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для настоящего исследования животные были усыплены путем вдыхания избытка изофлурана.

Анатомически расположенные коронарные артерии крыс, распределенные и скрытые глубоко в ткани миокарда, были нелегко распознаны. Путем сравнения коронарных артерий человека (Рисунок 1А) и крыс (Рисунок 1В) было проведено быстрое и точное разделение коронарных артерий крыс в соответствии с процессом отбора проб на Рисунке 2. После точного определения местоположения правой ушной раковины, легочной артерии и вершины спереди под оптическим микроскопом миокард рассекли вдоль сплошной черной линии, показанной на рисунке 2А. Около 5 мм межжелудочковой ветви коронарной артерии было явно выставлено на наш взгляд. После тонкого разделения липкого миокарда, окружающего желудочковую перегородочную артерию, 2-сантиметровую проволоку использовали для пересечения 2-миллиметровой петли коронарной артерии в направлении выравнивания сосудов. Мгновенно отсоединившееся коронарное кольцо диаметром 2 мм было надежно закреплено в ванне ДМТ, как показано на рисунке 3. После того, как начальное напряжение 3 мН было применено к артериальному кольцу (рисунок 4), его напряжение превысило более 2 мН, применив 60 мМ К+ параллельно три раза (Рисунок 5). Таким образом, вышеуказанные процедуры привели к изолированному коронарному кольцу с отличной физиологической активностью.

Кумулятивные K+ (20, 28, 39, 55, 77 и 108 мМ) или U46619 (0,01, 0,03, 0,1, 0,3 и 1 мкМ) добавляли в ванну DMT 620M, что приводило к концентрационно-зависимому повышению тонуса сосудов in vitro. Следующая концентрация K+ или U46619 (агонист рецептора тромбоксана A2 (TP)15 добавлялась, когда эффект сужения сосудов достигал плато. Экспериментальные результаты показаны на рисунке 6A,B. Для изолированных коронарных колец, суженных K+ (60 мМ) и U46619 (0,3 мкМ), тестируемый препарат апигенин (1, 3, 10, 30 и 100 мкМ) вызывал вазодилатацию удивительно концентрационно-зависимым образом (рисунок 6C).

Рисунок 1: От руки рисунки коронарных артерий человека и крысы. (А) представлены характеристики поверхностного распределения левой и правой коронарных артерий с переднего вида человеческого сердца и легко распознаются невооруженным глазом. (B) демонстрирует левую и правую коронарные артерии крыс глубоко в миокарде и их ветвящуюся межжелудочковую перегородку. Сокращения: RCA = правая коронарная артерия; LCA = левая коронарная артерия; ISB = межжелудочковая ветвь перегородки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Диаграмма разделения коронарных артерий у крыс. (A) Правая ушная раковина, легочная артерия, вершина и анатомическая линия сердца крысы наблюдались с переднего вида под световым микроскопом. (B) Просвет левого и правого желудочков были разрезаны вдоль перегородки от корня легочной артерии. (C) Анатомическое расположение левой и правой коронарных артерий и их межжелудочковой перегородочной ветви. (D) Кольцо артерии размером 2 мм. (E) Артериальное кольцо фиксируется проволокой вдоль направления сосуда. Сокращения: RA = правая ушная раковина; PA = легочная артерия; RCA = правая коронарная артерия; ISB = межжелудочковая ветвь перегородки; LCA = левая коронарная артерия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Схема процедуры артериального монтажа. Артериальное кольцо с проволокой переносили на (А) и зажимали на ванне ДМТ (В). Стальная проволока была закреплена и привинчена по часовой стрелке к верхнему левому краю (C) и левому нижнему углу (D).. (E) Раздвинутые челюсти были привинчены, чтобы освободить место для пропускания второго провода через артериальное кольцо. F) Второй провод был параллельным через артериальное кольцо. Стальная проволока была закреплена и привинчена по часовой стрелке к верхнему правому краю (G) и правому нижнему углу (H). (I) Раздвинутые челюсти были свободно привинчены, чтобы оставить артериальное кольцо в его естественном состоянии. Зеленые линии представляют провода, а оранжевые цилиндры представляют собой 2 мм изолированное артериальное кольцо. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Процедура нормализации артериального кольца. После того, как напряжение неподвижного изолированного артериального кольца вернулось к 0 мН, к артериальному кольцу одновременно прикладывалась тяговая сила 3 мН. Через 5 мин сосудистое напряжение снизилось до 2,5 мН. Увеличивая напряжение до 3 мН и удерживая его устойчивым в течение 5 мин, напряжение коронарного кольца инициализировали до 0 мН и отдыхали в течение 1 ч для последующих исследований сосудистого напряжения различных раздражителей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Тестирование сосудистой реактивности. Три применения 60 мМ K+ стимулировали напряжение изолированного коронарного кольца до более чем 2 мН, и три измерения были менее 10%, что свидетельствует о превосходной сосудистой активности. После каждой стимуляции ванну осторожно промывали насыщенным кислородом раствором PSS с температурой 37 °C до тех пор, пока напряжение не достигло 0 мН. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Репрезентативный индикатор кумулятивного сокращения дозы коронарной артерии крысы через K+ или U46619. По мере увеличения дозы K+ (A) и U46619 (B) сила увеличивалась в зависимости от дозы. (C) относится к релаксативному эффекту апигенина на 60 мМ K+- и 0,3 мкМ U46619-сжатого артериального кольца в зависимости от концентрации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Авторам нечего раскрывать.