Методическая статья

Стандартизированная подготовка коронарного кольца крысы и запись в режиме реального времени динамических изменений напряжения вдоль диаметра сосуда

DOI:

10.3791/64121

⸱

16 июня 2022 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2School of Basic Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Research Institute of Integrated TCM & Western Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В настоящем протоколе описана техника проводного миографа для измерения сосудистой реактивности коронарной артерии крысы.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Как ключевое событие заболеваний сердечно-сосудистой системы, ишемическая болезнь сердца (ИБС) широко рассматривается как главный виновник атеросклероза, инфаркта миокарда и стенокардии, которые серьезно угрожают жизни и здоровью людей во всем мире. Однако то, как записать динамические биомеханические характеристики изолированных кровеносных сосудов, давно озадачило людей. Между тем, точное позиционирование и изоляция коронарных артерий для измерения динамических изменений сосудистого напряжения in vitro стали тенденцией в разработке лекарств ИБС. Настоящий протокол описывает макроскопическую идентификацию и микроскопическое разделение коронарных артерий крыс. Функцию сокращения и расширения коронарного кольца вдоль диаметра сосуда контролировали с помощью установленной мультимиографической системы. Стандартизированные и запрограммированные протоколы измерения напряжения коронарных колец, от отбора проб до сбора данных, значительно улучшают повторяемость экспериментальных данных, что обеспечивает подлинность записей сосудистого напряжения после физиологического, патологического и медикаментозного вмешательства.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ишемическая болезнь сердца (ИБС) широко признана и обеспокоена как типичное и репрезентативное сердечно-сосудистое заболевание, являющееся основной причиной смерти как в развитых, так и в развивающихся странах 1,2. В качестве пути снабжения кровью и кислородом для нормальной физиологической функции сердца циркулирующая кровь поступает и питает сердце через две основные коронарные артерии и кровеносную сосудистую сеть на поверхности миокарда 3,4. Холестериновые и жировые отложения в коронарных артериях перекрывают кровоснабжение сердца и бурную воспалительную реакцию сосудистой системы, вызывая атеросклероз, стабильную стенокардию, нестабильную стенокардию, инфаркт миокарда или внезапную сердечную смерть 5,6. В ответ на патологический стеноз коронарных артерий компенсаторно ускоренное физиологическое сердцебиение удовлетворяет кровоснабжение самого сердца или жизненно важных органов организма за счет увеличения выхода левого желудочка7. Если длительный коронарный стеноз вовремя не устранить, в определенных областях сердца могут развиться обширные новые кровеносные сосуды8. В настоящее время клиническое лечение ИБС часто принимает медикаментозный тромболизис или хирургический механический тромболизис и экзогенное бионическое сосудистое шунтирование с частыми лекарствами и большой хирургической инвалидностью9. Поэтому функциональное исследование физиологической активности коронарных артерий по-прежнему является актуальным прорывом при сердечно-сосудистых заболеваниях10.

Отсутствуют доступные технические средства для определения коронарной физиологической активности, за исключением беспроводных телеметрических систем, которые могут динамически регистрировать in vivo коронарное давление, сосудистое напряжение, насыщение крови кислородом и значения рН11. Поэтому, учитывая текстурную тайну и сложность коронарных артерий, точная идентификация и изоляция коронарных артерий, несомненно, являются лучшим выбором для изучения нескольких механизмов ИБС in vitro4.

Серия мультимиографных систем, в частности проводной микрофотоскулярный детектор микрососудистого напряжения (см. Таблицу материалов), является очень зрелым рыночным устройством для регистрации изменений напряжения тканей in vitro малых сосудистых, лимфатических и бронхиальных трубок с характеристиками высокоточной и непрерывной динамической записи12. Указанная система широко используется для регистрации характеристик натяжения тканей in vitro полостных структур диаметром от 60 мкм до 10 мм. Непрерывный нагрев особенностей платформы проволочной микрофотографии в значительной степени компенсирует стимуляцию неблагоприятной внешней среды. Между тем, постоянные входы газовой смеси и значения рН позволяют получить более точные данные о сосудистом напряжении в аналогичном физиологическом состоянии13. Однако, учитывая сложность анатомической локализации коронарных артерий крыс (рисунок 1), ее изоляция вызывает недоумение и ограничивает исследование механизма диверсифицированных сердечно-сосудистых заболеваний и разработку лекарств. Поэтому настоящий протокол подробно вводит анатомическое расположение и процесс разделения коронарной артерии крысы с последующим измерением напряжения на платформе проволочной микрофотографии14.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол для животных был рассмотрен и одобрен Управляющим комитетом из Университета традиционной китайской медицины Чэнду (запись No 2021-11). Для настоящего исследования использовались самцы крыс Sprague Dawley (SD) (260-300 г, 8-10 недель). Крыс держали в камере для животных и могли свободно пить и есть во время эксперимента.

1. Приготовление раствора

  1. Готовят физиологический солевой раствор (PSS), растворяя 118 мМ NaCl, 4,7 мМ K+, 2,5 мМ CaCl2, 1,2 мМ KH2PO4, 1,2 мМ MgCl2∙6H2O, 25 мМ NaHCO3, 11 мМ D-глюкозы и 5 мМ HEPES (см. Таблицу материалов).
  2. Готовят раствор соли с высоким содержанием K+ , растворяя 58 мМ NaCl, 60 мМ K+, 2,5 мМ CaCl2, 1,2 мМ KH2PO4, 1,2 мМ MgCl2∙6H2O, 25 мМ NaHCO3, 11 мМ D-глюкозы и 5 мМ HEPES.
  3. Насытить два вышеуказанных раствора и пузырьком со смешанным газом 95%O2 и 5% CO2. Между тем, поддерживайте значения рН раствора между 7,38 и 7,42 с 2 мМ NaOH.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробной информации о приготовлении раствора, пожалуйста, смотрите ссылку15.

2. Рассечение коронарной артерии крысы

  1. Обезболивают крысу путем вдыхания 2% изофлурана. Подтвердите глубокую анестезию щипкой пальцев ног и, при необходимости, введите дополнительные анестетики. Затем немедленно откройте грудную полость, чтобы обнажить сердце на переносном операционном столе после ранее опубликованного отчета12.
  2. После диссоциации и удаления сердца дренируют остаточную кровь из всех камер сердца, слегка сдавливая медицинскими пластическими щипцами. Быстро поместите предварительно обработанное сердце в чашку Петри, содержащую 95% O2 + 5% CO2 насыщенного PSS при 4 °C, имея значение рН 7,40.
  3. Чтобы точно определить анатомическое положение коронарных артерий, скорректируйте положение изолированного сердца под световым микроскопом по принципиальной схеме (рисунок 2А).
    ПРИМЕЧАНИЕ: На фронтальном снимке правая ушная раковина и легочная артерия находились в верхнем левом и правом верхнем углу соответственно.
    1. Срежьте левую и правую желудочковую полости вдоль межжелудочковой перегородки от корня легочной артерии хирургическими ножницами и пинцетом (рисунок 2В).
  4. Чтобы отделить левую и правую коронарные артерии от ткани миокарда, рассекните правый желудочек под оптическим анатомическим микроскопом, чтобы тщательно обнажить правую ветвь коронарной артерии. Затем определите положение левой коронарной артерии, повернув сердечную ткань на 45° по часовой стрелке (рисунок 2D).
  5. После удаления окружающей липкой ткани миокарда явно различают пульсирующие левую (около 5 мм) и правую (около 5 мм) коронарные артерии. Немедленно отделите коронарные артерии посередине и полностью погрузите в ПСС при 4 °C. Приобретите артериальное кольцо размером около 2 мм, вертикально разрезав отделившуюся артерию анатомическими ножницами для регистрации сосудистого напряжения при различных раздражителях (рисунок 2Е).

3. Суспензия и фиксация артериального кольца

ПРИМЕЧАНИЕ: Подробную информацию об этом шаге см. в ссылке14.

  1. Подготовьте две проволоки из нержавеющей стали по 2 см (см. Таблицу материалов) и предварительно замочите в растворе PSS при температуре 4 °C, насыщенном 95% O2 + 5% CO2. Пропустите оба провода параллельно через артериальное кольцо вместе с направлением сосуда под оптическим анатомическим микроскопом и с проводами одинаковой длины, выставленными на обоих концах сосудистой полости.
  2. Зафиксируйте артериальное кольцо стальной проволокой спереди и сзади в ванне из проволоки на микрофотографии, заполненной пузырящейся ПСС с 95% O2 + 5% CO2. Поверните горизонтальную винтовую ручку для соответствующего переднего и заднего расстояния так, чтобы два провода были горизонтальными, а артериальное кольцо находилось в естественном состоянии расслабления.
  3. После установки ванны DMT на термостатический аппарат откройте программное обеспечение для сбора данных (см. Таблицу материалов), чтобы убедиться, что был записан соответствующий сигнал пути. Установите следующие параметры: калибровка окуляра (мм/дел): 0,36; целевое давление (кПа): 13,3; IC1/IC100: 0,9; время онлайн-усреднения: 2 с; время задержки: 60 с. Этапы фиксации артериального кольца показаны на рисунке 3.

4. Стандартизация сосудистого напряжения в артериальном кольце крыс

ПРИМЕЧАНИЕ: Для различных образцов полостей для поддержания исключительной активности in vitro сосудам требовалось оптимальное начальное натяжение. Более подробную информацию см. в ссылке15.

  1. Достигните оптимального начального натяжения артериального кольца, применяя разумное напряжение по диаметру сосуда.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На основе предыдущего исследования16 максимальное напряжение, вызванное агонистами, было достигнуто при значении коэффициента k 0,90 при начальном растяжении 1,16 ± 0,04 мН/мм (контрольные значения для различных образцов сосудов: значение k, 0,90-0,95; начальное напряжение, 1,16-1,52 мН/мм).
  2. В этот момент установите отображаемое значение сосудистого напряжения равным нулю. После этого нанесите стимул 3 мН на артериальное кольцо, вращая спиральную ось ванны.
  3. После инкубации в течение 1 ч в насыщенном кислородом PSS буфере при 37 °C, рН 7,40, снова установите значение натяжения 0 мН на панели управления натяжением проволочной микрофотографии. Процесс установки начального натяжения артериального кольца показан на рисунке 4.

5. Определение реактивности коронарного кольца

  1. Выполняют сократительную активность коронарного кольца с помощью проводного миографа по методике14 и проверяют в трех отдельных операциях, стимулируя 60 мМ раствора К+ в течение 10 мин каждая.
  2. После каждой стимуляции промывайте ванну насыщенным кислородом ПСС до тех пор, пока тонус сосудов не вернется в исходное состояние.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Только когда флуктуация напряжения трех параллельных измерений составляла менее 10%, а амплитуда каждого сокращения превышала 1 мН/мм, для дальнейших экспериментов можно было использовать квалифицированные и высокоактивные артериальные кольца. Проверка активности коронарного кольца крысы показана на рисунке 5.

6. Послеоперационное лечение

  1. После операции усыплите животных в соответствии с институционально утвержденными протоколами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для настоящего исследования животные были усыплены путем вдыхания избытка изофлурана.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Анатомически расположенные коронарные артерии крыс, распределенные и скрытые глубоко в ткани миокарда, были нелегко распознаны. Путем сравнения коронарных артерий человека (Рисунок 1А) и крыс (Рисунок 1В) было проведено быстрое и точное разделение коронарных артерий крыс в соответствии с процессом отбора проб на Рисунке 2. После точного определения местоположения правой ушной раковины, легочной артерии и вершины спереди под оптическ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нарушение коронарной микроциркуляции, в котором участвует широкий круг пациентов с ИБС, было постепенно признано и касалось основы адекватной перфузии миокарда. Учитывая серьезные осложнения внезапной ишемической болезни сердца и сердечно-сосудистых заболеваний, своевременная медикаментозная профилактика и лечение крайне важны для клинического человека с ИБС17. Неизбежно секретность анатомии коронарной артерии и сложность ее физиологического строения серьезно ограничили рациональную и научную оцен...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Ключевым научно-исследовательским проектом Плана науки и техники провинции Сычуань (2022YFS0438), Национальным фондом естественных наук Китая (82104533), Китайским постдокторским научным фондом (2020M683273) и Департаментом науки и техники провинции Сычуань (2021YJ0175).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ApigeninSangon Biotech Co., Ltd., Шанхай, Китай150731
CaCl2Sangon Biotech Co., Ltd., Шанхай, КитайA501330
D-глюкозаSangon Biotech Co., Ltd., Шанхай, КитайA610219
HEPESXiya Reagent Co., Ltd., Шаньдун, КитайS3872
KClSangon Biotech Co., Ltd., Шанхай, КитайA100395
KH2PO4Sangon Biotech Co., Ltd., Шанхай, КитайA100781
LabChart Professional версии 8.3 ADInstruments, Австралия—
MgCl2· 6H2OSangon Biotech Co., Ltd., Шанхай, КитайA100288
Мультимиографическая система Danish Myo Technology, Орхус, Дания620M
NaClSangon Biotech Co., Ltd., Шанхай, КитайA100241
NaHCO3Sangon Biotech Co., Ltd., Шанхай, КитайA100865
Стальные проволокиDanish Myo Technology, Орхус, Дания400447
U46619Sigma, СШАD8174

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Malakar, A. K., et al. A review on coronary artery disease, its risk factors, and therapeutics. Journal of Cellular Physiology. 234 (10), 16812-16823 (2019).
  2. Murray, C., et al. national age-sex specific all-cause and cause-specific mortality for 240 causes of death, 1990-2013: A systematic analysis for the global burden of disease Study 2013. The Lancet. 385 (9963), 117-171 (2015).
  3. Zhang, Y., et al. Adenosine and adenosine receptor-mediated action in coronary microcirculation. Basic Research in Cardiology. 116 (1), 22(2021).
  4. Allaqaband, H., Gutterman, D. D., Kadlec, A. O. Physiological consequences of coronary arteriolar dysfunction and its influence on cardiovascular disease. Physiology. 33 (5), 338-347 (2018).
  5. Minelli, S., Minelli, P., Montinari, M. R. Reflections on atherosclerosis: Lesson from the past and future research directions. Journal of Multidisciplinary Healthcare. 13, 621-633 (2020).
  6. Alvarez-Alvarez, M. M., Zanetti, D., Carreras-Torres, R., Moral, P., Athanasiadis, G. A survey of sub-saharan gene flow into the mediterranean at risk loci for coronary artery disease. European Journal of Human Genetics. 25 (4), 472-476 (2017).
  7. LaCombe, P., Tariq, M. A., Lappin, S. L. Physiology, Afterload Reduction. StatPearls [Internet]. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2022).
  8. Gutterman, D. D., et al. The human microcirculation: regulation of flow and beyond. Circulation Research. 118 (1), 157-172 (2016).
  9. Wang, G., Li, F., Hou, X. Complementary and alternative therapies for stable angina pectoris of coronary heart disease: A protocol for systematic review and network meta-analysis. Medicine. 101 (7), 28850(2022).
  10. Markousis-Mavrogenis, G., et al. Coronary microvascular disease: the "meeting point" of cardiology. European Journal of Clinical Investigation. 52 (5), 13737(2021).
  11. Allison, B. J., et al. Fetal in vivo continuous cardiovascular function during chronic hypoxia. The Journal of Physiology. 594 (5), 1247-1264 (2016).
  12. Wenceslau, C. F., et al. Guidelines for the measurement of vascular function and structure in isolated arteries and veins. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 321 (1), 77-111 (2021).
  13. Liu, L., et al. Comparison of Ca2+ handling for the regulation of vasoconstriction between rat coronary and renal arteries. Journal of Vascular Research. 56 (4), 191-203 (2019).
  14. Sun, J., et al. Isometric contractility measurement of the mouse mesenteric artery using wire myography. Journal of Visualized Experiments. (138), e58064(2018).
  15. Guo, P., et al. Coronary hypercontractility to acidosis owes to the greater activity of TMEM16A/ANO1 in the arterial smooth muscle cells. Biomedicine & Pharmacotherapy. 139, 111615(2021).
  16. Ping, N. N., Cao, L., Xiao, X., Li, S., Cao, Y. X. The determination of optimal initial tension in rat coronary artery using wire myography. Physiological Research. 63 (1), 143-146 (2014).
  17. Niccoli, G., Scalone, G., Lerman, A., Crea, F. Coronary microvascular obstruction in acute myocardial infarction. European Heart Journal. 37 (13), 1024-1033 (2016).
  18. Mumma, B., Flacke, N. Current diagnostic and therapeutic strategies in microvascular angina. Current Emergency and Hospital Medicine Reports. 3 (1), 30-37 (2015).
  19. Lanza, G. A., Parrinello, R., Figliozzi, S. Management of microvascular angina pectoris. American Journal of Cardiovascular Drugs. 14 (1), 31-40 (2014).
  20. Zhu, T. Q., et al. Beneficial effects of intracoronary tirofiban bolus administration following upstream intravenous treatment in patients with ST-elevation myocardial infarction undergoing primary percutaneous coronary intervention: The ICT-AMI study. International Journal of Cardiology. 165 (3), 437-443 (2013).
  21. Huang, D., et al. Restoration of coronary flow in patients with no-reflow after primary coronary intervention of acute myocardial infarction (RECOVER). American Heart Journal. 164 (3), 394-401 (2012).
  22. Fu, W. J., et al. Anti-atherosclerosis and cardio-protective effects of the Angong Niuhuang Pill on a high fat and vitamin D3 induced rodent model of atherosclerosis. Journal of Ethnopharmacology. 195, 118-126 (2017).
  23. Li, J., et al. Chinese medicine She-Xiang-Xin-Tong-Ning, containing moschus, corydalis and ginseng, protects from myocardial ischemia injury via angiogenesis. The American Journal of Chinese Medicine. 48 (1), 107-126 (2020).
  24. Wu, W., et al. Three dimensional reconstruction of coronary artery stents from optical coherence tomography: Experimental validation and clinical feasibility. Scientific Reports. 11 (1), 1-15 (2021).
  25. Liu, M., et al. Janus-like role of fibroblast growth factor 2 in arteriosclerotic coronary artery disease: Atherogenesis and angiogenesis. Atherosclerosis. 229 (1), 10-17 (2013).
  26. Hu, G., Li, X., Zhang, S., Wang, X. Association of rat thoracic aorta dilatation by astragaloside IV with the generation of endothelium-derived hyperpolarizing factors and nitric oxide, and the blockade of Ca2+ channels. Biomedical reports. 5 (1), 27-34 (2016).
  27. Guo, Y., et al. Anticonstriction effect of MCA in rats by danggui buxue decoction. Frontiers in Pharmacology. 12, 749915(2021).
  28. Jing, Y., et al. Apigenin relaxes rat intrarenal arteries, depresses Ca2+-activated Cl− currents and augments voltage-dependent K+ currents of the arterial smooth muscle cells. Biomedicine & Pharmacotherapy. 115, 108926(2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи