Методическая статья

Характеристика нейронального лизосомного интерактома с протеомикой бесконтактной маркировки

DOI:

10.3791/64132

⸱

23 июня 2022 г.

 ,  , 
1Department of Chemistry, The George Washington University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол протеомики по маркировке близости нейронных лизосом описан здесь для характеристики динамического лизосомального микроокружения в индуцированных человеком плюрипотентных нейронах, полученных из стволовых клеток. Лизосомальные мембранные белки и белки, которые взаимодействуют с лизосомами (стабильно или временно), могут быть точно количественно определены в этом методе с отличным внутриклеточным пространственным разрешением в живых нейронах человека.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Лизосомы часто общаются с различными биомолекулами для достижения деградации и других разнообразных клеточных функций. Лизосомы имеют решающее значение для функции человеческого мозга, поскольку нейроны являются постмитотическими и в значительной степени зависят от аутофагии-лизосомного пути для поддержания клеточного гомеостаза. Несмотря на достижения в понимании различных лизосомальных функций, захват высокодинамических связей между лизосомами и другими клеточными компонентами является технически сложным, особенно с высокой пропускной способностью. Здесь представлен подробный протокол для недавно опубликованного эндогенного (knock-in) лизосомного бесконтактного мечения протеомным методом в нейронах, полученных из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC).

Как лизосомальные мембранные белки, так и белки, окружающие лизосомы в радиусе 10-20 нм, могут быть уверенно идентифицированы и точно количественно определены в живых нейронах человека. Каждый шаг протокола подробно описан, т.е. культура hiPSC-нейронов, бесконтактная маркировка, сбор нейронов, флуоресцентная микроскопия, обогащение биотинилированного белка, переваривание белка, анализ LC-MS и анализ данных. Таким образом, этот уникальный эндогенный лизосомальный метод бесконтактной маркировки протеомики обеспечивает высокопроизводительный и надежный аналитический инструмент для изучения высокодинамной лизосомальной активности в живых нейронах человека.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Лизосомы представляют собой катаболические органеллы, которые разлагают макромолекулы через лизосомально-аутофагический путь1. Помимо деградации, лизосомы участвуют в различных клеточных функциях, таких как сигнальная трансдукция, восприятие питательных веществ и секреция 2,3,4. Возмущения в лизосомальной функции были вовлечены в лизосомальные нарушения хранения, рак, старение и нейродегенерацию 3,5,6,7. Для постмитотических ....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры были одобрены комитетом по биобезопасности и этике Университета Джорджа Вашингтона. Составы сред и буферов, используемых в этом протоколе, приведены в таблице 1. Информация о коммерческом продукте, используемая здесь, приведена в Таблице материалов.

1. Культура нейронов человека, полученная из iPSC

  1. Человеческая культура iPSC и интеграция зонда LAMP1-APEX (7 дней)
    1. Разморозьте раствор матригеля в ведре со льдом при 4 °C на ночь, аликвотируйте 500 мкл раствора в холодных стерильных трубках и храните аликвоты при −80°C. Приготовьте 50 мл раствора для покрытия, до....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование протеомики, маркирующей близость лизосом, было проведено в нейронах человека, полученных из iPSC, для захвата динамического лизосомального микроокружения in situ в живых нейронах. Клеточные морфологии hiPSCs и нейронов, полученных hiPSC, в разные моменты времени проиллюстрированы на рисунке 2A. Человеческие ИПСК растут колониями в среде E8. Дифференцировка инициируется окрашиванием иПСК в доксициклинсодержащую среду индукции нейронов. Расширения нейритов становятся .......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Используя этот зонд LAMP1-APEX, белки на лизосомальной мембране и рядом с ней биотинилируются и обогащаются. Учитывая типичный диаметр лизосомы 100-1 200 нм, этот метод обеспечивает отличное внутриклеточное разрешение с радиусом маркировки 10-20 нм. LAMP1 является обильным лизосомальным мембранным белком и классическим маркером для лизосом, служащим отличным белком-приманкой для лизосомальной маркировки APEX на уровне эндогенной экспрессии. Однако ограничения также существуют при использовании LAMP1 для нацеливания на ли.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование поддерживается грантом NIH (R01NS121608). A.M.F. признает стипендию ARCS-Metro Washington Chapter Scholarship и стипендию Фонда Бурбона Ф. Скрибнера. Мы благодарим лабораторию Майкла Уорда в Национальном институте неврологических расстройств и инсульта (NINDS) за поддержку молекулярной биологии и разработку технологии i3Neuron.

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
10% (масс./об.) раствор сапонинаAcros Organics419231000флуоресцентная микроскопия
AccutaseLife TechnologiesA1110501раствор для отслойки клеток, клеточная культура
B27 ДобавкаFisher Scientific17504044клеточная культура, кортикальная нейронная среда
BDNFPeproTech450-02, кортикальная нейронная среда
Борная кислотаSigma-AldrichB6768Клеточная культура, боратный буфер
Бычья сыворотка АльбуминМиллипор SigmaA8806Для изготовления стандартных растворов для измерения общих концентраций белка
Brainphys нейрональная средаSTEMCELL Technologies5790Клеточная культура, кортикальная нейронная среда
CD45R (B220) Антитело Alexa Fluor 561Thermo Fisher Scientific505-0452-82Флуоресцентная микроскопия
Chroman1 Ингибитор ROCKTocris716310Cell Culture
cOmplete mini Ингибитор протеазыRoche4693123001ингибитор коктейля в лизисе Буфер
DC Protein Assay Kit IIBio-Rad5000112Для определения концентрации общего белка клеточного лизата
Диметилсульфоксида (ДМСО)Sigma-AldrichD8418Реакция близости-мечения
Среда DMEM/F12 ThermoFisher Scientific11320082Клеточная культура, Покрытие чашки
DMEM/F12 среда с HEPESThermo Fisher Scientific11330057Клеточная культура, Индукционная среда Сыворотка
ослаSigma-AldrichD9663Флуоресцентная микроскопия
Доксициклин гиклат, ≥ 98% (ВЭЖХ)Sigma-AldrichD9891-1GКлеточная культура, индукционная среда
Essential 8 Medium ThermoFisher ScientificA1517001Cell Culture
Essential 8 Добавка (50x)Thermo Fisher ScientificA1517101Клеточная культура
Планшет для экстракции вакуумный коллекторВодаWAT097944Для пептидного обессоливания
муравьиной кислоты (FA)Fisher ScientificA11750Для анализа LC-MS
GDNFPeproTech450-10Клеточная культура, кортикальный нейрон Medium
Hoechst красительThermo Fisher Scientific62239Флуоресцентная микроскопия
ВЭЖХ марки метанолаFisherScientific A452Для пептидной обессоливания
воды ВЭЖХ классаFisherScientific W5Для пептида Обессоливание
индуцированных плюрипотентных стволовых клеток ИнститутаКорриеллаGM25256Клеточная культура
Перекись водорода, ACS, 29-32% по мас.мас.Thermo Fisher ScientificAA33323ADреакция близости-мечения
Йодоацетамид (IAA)Millipore SigmaI6125Для переваривания белка
ЛамининFisher Scientific23017015Клеточная культура, кортикальный нейрон Среда
LC-MS класса Ацетонитрил FisherScientificA955Для анализа LC-MS
Вода класса LC-MSFisher ScientificW64Для анализа ЖХ-МС
L-глутаминFisher Scientific25-030-081Культура клеток, индукционная среда
MatrigelThermo Fisher Scientific08-774-552матрица базальной мембраны, клеточная культура, покрытие тарелки
мышиное античеловеческое LAMP1 моноклональное антителоИсследования развития Hybridoma Bankh4a3Флуоресцентная микроскопия
N-2 Добавка ( 100x)Fisher Scientific17-502-048Клеточная культура, индукционная среда
нитроцеллюлозная мембрана, предварительно разрезанная, 0,45 &; m, 7 x 8,5 смBio-Rad1620145Для проведения дот-блоттинга для титрования гранул
Заменимые аминокислоты (NEAA)Fisher Scientific11-140-050Клеточная культура, индукционная среда
NT-3PeproTech450-03Клеточная культура, кортикальный нейрон Среда
Oasis HLB 96-луночная твердофазная экстракционная пластинаВоды186000309Для обессоливания пептидов
Блокирующий буфер Odyssey (TBS)LI-COR Biosciences927-50000Для проведения анализа точечных блоттингов для титрования гранул
Параформальдегиднаяэлектронная микроскопия Sciences15710Флуоресцентная микроскопия
Фенол Биотин (1,000x стоковый)Adipogen41994-02-9Реакция мечения по близости
Фосфатно-солевой буфер (PBS) без кальция или магнияGibco10010049Клеточная культура, реакция близости-мечения, флуоресцентная микроскопия
Пирс количественный колориметрический пептидный анализThermo Fisher23275анализ концентрации пептидов
поли-L-орнитин (PLO)Миллипоры сигмаp3655клеточная культура, покрытие чашки
аскорбат натриясигма-олдричA4034близость-мечение гашительный буфер, лизисный буфер
натрия азидSigma-AldrichS8032Proximity-Labeling Гашение Буфер, Лизисный буфер, Флуоресцентная микроскопия
Хлорид натрияThermo Fisher ScientificS271500Клеточная культура, Боратный буфер
Додецилсульфат натрия (SDS)Thermo Fisher ScientificBP1311220Лизисный буфер, Буфер для дот-блоттинга, Буфер для промывки шариков
Гидроксид натрияSigma-Aldrich415413Клеточная культура, Боратный буфер
Тетраборатнатрия Сигма-Олдрич221732Клеточная культура, Боратный буфер
SpeedVac Концентраторвакуумный концентратор
Стрептавидин Магнитные сефарозные шарикиЦитива (формальный GE)28-9857-99Обогащение биотинилированных белков
Стрептавидин, Alexa Fluor 680 КонъюгатThermo Fisher ScientificS32358Для проведения дот-блоттинга для титрования шариков
термомиксеррегулируемой температурой
смеситель Трифлюоуксусная кислота (ТФК)Миллипор Sigma302031Для обессоливания пептидов
Трис(2-карбоксиэтил)фосфина гидрохлорид (TCEP)Миллипор SigmaC4706Для переваривания белка
Tris-HClThermo Fisher ScientificBP152500Буфер для лизиса, Буфер для анализа блот-блота, Буфер для промывки шариков
Triton-XThermo Fisher ScientificBP151500Буфер для промывки бусин
TROLOXSigma-Aldrich648471Буфер для гашения с близостью-мечением, Буфер для лизиса
Trypsin/Lys-C Mix, Масс-Spec GradePromegaV5073для переваривания белка
TWEEN  20миллипор SigmaP1379Буфер для блоттинга
мочевинаThermo Fisher ScientificBP169500Промывка бусин и буфер для пищеварения на бусинах
ВитронектинSTEMCELL Technologies7180Клеточная культура, покрытие для чашки
Y-27632 ROCK ингибиторSelleckS1049Клеточная культура
: с

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. De Duve, C., Wattiaux, R. Functions of lysosomes. Annual Review of Physiology. 28 (1), 435-492 (1966).
  2. Ballabio, A., Bonifacino, J. S. Lysosomes as dynamic regulators of cell and organismal homeostasis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (2), 101-118 (....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи