Методическая статья

Техника инъекции эмбриона для редактирования генов у черноногого клеща, Ixodes scapularis

DOI:

10.3791/64142

⸱

13 сентября 2022 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Nevada, Reno, 2Insect Transformation Facility, University of Maryland Institute for Bioscience and Biotechnology Research, 3Department of Agriculture, Veterinary, and Rangeland Sciences, University of Nevada, Reno

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Настоящий протокол описывает метод инъекции эмбрионов клещей. Инъекция эмбриона является предпочтительным методом генетических манипуляций для создания трансгенных линий.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клещи могут передавать различные вирусные, бактериальные и простейшие патогены и поэтому считаются векторами медицинского и ветеринарного значения. Несмотря на растущее бремя клещевых заболеваний, исследования клещей отстают от переносчиков болезней насекомых из-за проблем с применением инструментов генетической трансформации для функциональных исследований уникальной биологии клещей. Генетические вмешательства привлекают внимание к сокращению заболеваний, переносимых комарами. Однако разработка таких вмешательств требует стабильной трансформации зародышевой линии путем инъекции эмбрионов. Такая техника инъекции эмбриона отсутствует для хелицератов, в том числе клещей. Несколько факторов, таких как внешний толстый слой воска на эмбрионах клещей, твердый хорион и высокое внутриовальное давление, являются некоторыми препятствиями, которые ранее препятствовали развитию протокола инъекции эмбриона у клещей. Настоящая работа преодолела эти препятствия, и здесь описана техника инъекции эмбриона для черноногого клеща, Ixodes scapularis . Этот метод может быть использован для доставки компонентов, таких как CRISPR / Cas9, для стабильных преобразований зародышевой линии.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клещи являются переносчиками медицинского и ветеринарного значения, способными передавать различные вирусные, бактериальные, простейшие патогены и нематоды 1,2. В восточной части Соединенных Штатов черноногий клещ, Ixodes scapularis, является важным переносчиком патогена болезни Лайма (LD), спирохеты Borrelia burgdorferi. Более 400 000 случаев ЛД регистрируются каждый год в Соединенных Штатах, что делает его главным трансмиссивным инфекционным заболеванием в США1. В дополнение к B. burgdorferi, шесть других микроорганизмов передаются I. scapularis, включая четыре бактерии (Anaplasma phagocytophilum, B. mayonii, B. miyamotoi и Ehrlichia muris eauclarensis), один простейший паразит (Babesia microti) и один вирус (вирус Powassan), что делает этот вид клещей серьезной проблемой общественного здравоохранения3 . В то время как клещевые заболевания стали более распространенными в последние годы, исследования клещей отстали от других переносчиков членистоногих, таких как комары, из-за уникальной биологии клещей и проблем, связанных с применением генетических и функциональных геномных инструментов 4,5.

Методы редактирования генов, в частности CRISPR/Cas9, в настоящее время сделали возможными исследования функциональной геномики на немодельных организмах. Для создания наследственных мутаций в организме инъекция эмбриона остается предпочтительным методом доставки конструкций для изменения зародышевой линии 6,7,8,9. Однако до недавнеговремени 4 яйца клещей считались слишком сложными или даже невозможными для инъекции, не убивая эмбрион10,11. Толстый слой воска на яйцах, твердый хорион и высокое внутриовальное давление были одними из основных препятствий, которые препятствовали инъекции эмбриона клещам. Взрослые, питающиеся кровью I. scapularis откладывают одну кладку до 2000 яиц12 в течение 3-4 недель (примерно 100 яиц в день). Яйца откладываются поодиночке, и каждое яйцо покрывается воском, который выделяется выпячиванием или «рогами» железистого органа Гене 13,14,15 матери. Этот воск защищает яйца от высыхания и содержит антимикробные соединения15. Чтобы успешно ввести яйца клещей, важно удалить слой воска, смягчить хорион и высушить яйцеклетки, чтобы уменьшить внутриовальное давление, чтобы инъекция необратимо не повредила яйцеклетку. Понимая критическую важность инъекций эмбрионов для успешной трансформации зародышевой линии, разработан протокол для I. scapularis, который может быть использован для создания конструкции CRISPR / Cas9 и генерации стабильных мутаций зародышевой линии4. В дополнение к его вкладу в исследования I. scapularis, этот протокол также может быть оптимизирован для других видов клещей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Взрослые особи Ixodes scapularis были либо приобретены в Университете штата Оклахома (OSU), либо выращены в Университете Невады, Рино (UNR) (протокол IACUC #21-001-1118).

1. Подготовка самок клещей к сбору эмбрионов

ПРИМЕЧАНИЕ: Для сбора яиц соответствующего возраста важно синхронизировать яйцекладку. Хотя сигналы откладывания яиц у клещей остаются неясными, в стандартных инсектарных условиях (температура 27 ° C и относительная влажность >90% (RH)), самки I. scapularis начинают откладывать яйца примерно через 8 дней после отделения хозяина. Эта временная шкала может быть удлинена путем хранения обильных самок при 4 °C. Мы храним кормлецов кровью при температуре 4 °C до 8 недель без какого-либо негативного влияния на яйцекладку. Эти условия, возможно, потребуется модифицировать для каждого инсектария.

  1. Храните всех изобилующих самок при 4 °C с относительной влажностью >90% в 6-квартовой пластиковой коробке, выстланной влажной фильтровальной бумагой, до тех пор, пока она не будет использована для микроинъекций.
  2. За неделю до инъекций переведите самок с 4 °C в инкубатор 27 °C для начала яйцекладки.
  3. Когда самки начнут откладывать яйца (через 3-4 дня после их перемещения до 27 ° C), удалите все яйца с помощью кисти с мелким наконечником и подготовьте самок к абляции органа Жене (восковой железы).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Орган Гене простирается от области между скутумом и капитулом (дорсальное основание ротовых частей), ротовые части изгибаются над поверхностью вентрального тела (параллельно поверхности), а расширенный орган Гена покрывает яйца, как только яйца откладываются (рисунок 1). Яйца, отложенные до удаления органа жене или опорожнения воска, будут иметь восковое покрытие и не подходят для инъекций и должны быть выброшены.
  4. Чтобы удалить или опорожнить орган Джине, используйте глину, чтобы расположить набухшую самку на стеклянном предметном стекле под микроскопом, ориентированным так, чтобы ротовые части были видны как на вентральной, так и на спинной сторонах (рисунок 1B, C).
    1. Осторожно проткните область точно между скутумом и ротовой частью, используя тонкие щипцы и вольфрамовые иглы, изготовленные в лаборатории с использованием вольфрамовой проволоки в соответствии с ранее опубликованным протоколом16 (иглы также можно приобрести в коммерческих целях и прикрепить к микродиссекции зонда, см. Таблицу материалов).
    2. Прокладывая путь внутрь вольфрамовой иглой, вытащите восковую железу наружу (рисунок 1D,E). Удаление железы может занять несколько минут. Протрите любую жидкую секрецию воска с помощью лабораторных салфеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Железа также может быть удалена с вентральной стороны прямо под ротовыми частями; потянувшись в спину к скутуму иглой и щипцами. Нанесение силиконового клея вокруг ротовых частей также блокирует выворот органа Гена и может использоваться вместо удаления или опорожнения воска (личное общение с доктором Ладиславом Симо, INRAE, Франция). Набухшие клещи не останутся на двусторонней ленте. Использование глины для «пеленания» клеща помогает удерживать их на месте во время манипуляции. Используйте щипцы для удержания клеща и вольфрамовую иглу для рассечения. Вентральную часть легче прокалывать иглой и предпочитают авторы.
  5. Чтобы опорожнить железу, расположите гравидный клещ, как указано в шаге 1.4. Осторожно проколите область за ротовыми частями на спинной стороне и надавите на вентральную сторону с помощью щипцов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы нет необходимости удалять восковую железу; опорожнения железы от воска хватит на несколько дней. Самки-яйцекладущие имеют белую область вокруг частей рта, которая указывает на расположение восковой железы и может быть использована в качестве эталона.
    1. Поместите край безворсовой лабораторной салфетки и удалите жидкий воск, выходящий из места прокола. Следите за тем, чтобы избежать секреции гемолимфы, которая представляет собой прозрачную жидкость по сравнению со слегка желтоватым вязким воском. Это может занять 5-10 минут, пока большая часть воска не будет удалена.
  6. После манипуляции поместите самок в инкубатор при 27 °C (>90% относительной влажности) и дайте им восстановиться в течение 1-2 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обработанным самкам обычно требуется 1-2 дня, чтобы восстановиться и снова начать откладывать яйца.
  7. Когда самки снова начнут откладывать яйца, используйте тонкую кисть, чтобы собрать свежеотложенные яйца (0-18 ч после откладки яиц) и поместите их в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании яиц одной и той же самки с течением времени эту процедуру необходимо повторить через 4-5 дней яйцекладки, если железы не были удалены.

2. Лечение эмбрионов при микроинъекциях

  1. Добавьте ~200 мкл (или достаточный объем для покрытия яиц, в зависимости от количества яиц) 5% (вес/объем) бензалкония хлорида/воды (см. Таблицу материалов) в пробирку, содержащую яйца возрастом 0-18 ч. Осторожно закрутите яйца кистью в течение 5 минут, чтобы яйца не осели на дне трубки (подробнее см. Шарма и др.4). Удалите супернатант с помощью микропипетки, оставив яйца в пробирке.
    ВНИМАНИЕ: Бензалкония хлорид разъедает кожу и глаза, носите перчатки и защиту глаз.
  2. Добавьте ~ 200 мкл дистиллированной (DI) воды в трубку, содержащую яйца, закрутите кистью и удалите воду из трубки микроцентрифуги с помощью микропипетки. Повторите стирку водой DI еще раз.
  3. После промывки водой DI добавьте ~200 мкл 5% (мас./об.) хлорида натрия (NaCl) и аккуратно закрутите кистью в течение 5 мин. Выньте раствор из тюбика через 5 мин и дважды вымойте яйца водой DI.
  4. Добавьте ~100 мкл 1% (мас./об.) раствора NaCl в микроцентрифужную трубку, содержащую яйца. Хранить яйца в 1% (мас./об.) растворе NaCl до тех пор, пока они не будут использованы для инъекций.
  5. Начинают микроинъекции примерно через час. Эта временная шкала помогает в правильном высыхании яиц и предотвращает их разрыв.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Яйца можно хранить в 1% (мас./об.) растворе NaCl в течение 7-8 ч без существенного влияния на выживаемость. Если яйца трудно вводить или лопать, то яйца недостаточно высушены и могут быть дополнительно обработаны 5% (мас./об.) NaCl в течение дополнительных 5 мин.

3. Подготовка инъекционных игл

  1. Вставьте алюмосиликатное капиллярное стекло (с нитью накаливания, см. Таблицу материалов) в съемник иглы в соответствии с инструкциями производителя.
  2. Отрегулируйте съемник иглы на следующие настройки: Тепло: 575, Тяга: 20, Скорость: 50, Время: 200 и Давление: 700.
  3. Активируйте функцию вытягивания съемника иглы и повторите процесс для дополнительных игл.
  4. Храните вытащенные иглы, втыкая их в линии глины моделиста в чистую чашку Петри.
  5. Загрузите иглу инъекционной смесью с помощью наконечника микрозагрузчика (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сравнение игл, используемых для инъекций эмбриона клеща и комара, показано на рисунке 2.

4. Настройка слайдов для микроинъекций

  1. Используя двустороннюю ленту, склейте два предметных стекла микроскопа вместе, оставив зазор около 0,5 см для поддержки выравнивания яйцеклеток и предотвращения их переворачивания во время инъекций (рисунок 3A).
  2. Нанесите кусочек прозрачной пленки (см. Таблицу материалов) на двустороннюю ленту в зазор между слайдами. Убедитесь, что пленка идеально выровнена с зазором.

5. Микроинъекции эмбриона

  1. Выровняйте 8-10 яиц за раз на слайде (выше) с помощью одноволосой кисти.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Яйца, выровненные по более длинной оси перпендикулярно (рисунок 3B) краю слайда, легче вводить, чем яйца, продольная ось которых выровнена параллельно краю (рисунок 3C). Яйца в перпендикулярной ориентации (рисунок 3B) могут лучше выдерживать инъекции, что приводит к более высокой выживаемости.
  2. Поместите слайд с выровненными яйцами на ступень сложного микроскопа. Используйте кусочек безворсовой салфетки, чтобы удалить 1% раствор NaCl, в котором они хранятся.
  3. Прикрепите заполненную инъекционную иглу к микроинжектору, подключенному к микроманипулятору (см. Таблицу материалов).
  4. Откройте иглу, осторожно потирая ее о поверхность яйца, используя настройку высокого давления на микроинжекторе (>5000 гПа).
  5. После того, как игла открыта, уменьшите давление (1 000-2 500 гПа) микроинжектора в зависимости от отверстия иглы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Небольшое отверстие потребует сравнительно более высокого давления, в то время как большее отверстие потребует более низкого давления. Это делается для управления объемом вводимой конструкции. В зависимости от размера отверстия иглы объем инъекции будет варьироваться в пределах 1-5 пл.
  6. Как можно быстрее введите все яйца на горку под углом 10°-15° и сразу же переместите горку в условия повышенной влажности в чашку Петри, выстланную влажной бумагой. Как только яйца вводятся, они начинают высыхать.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инъекция небольшого количества яйцеклеток за один раз увеличивает успех инъекции и вероятность выживания. Иглы засоряются рефлюксом эмбриона. Если кончик все еще острый, чтобы очистить забитые иглы, переместите иглу в небольшую капельку 1% NaCl, добавленную к краю слайда. Капиллярное действие вытеснит небольшой засор. Если игла уже тупая, поменяйте ее.

6. Послеинъекционный уход за эмбрионами

  1. Поместите слайд, содержащий введенные эмбрионы, в большую чашку Петри, выстланную влажной фильтровальной бумагой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно не беспокоить яйца в течение как минимум 5-6 ч. Это позволяет правильно запечатать инъекционную рану. Инъекционная рана может открыться при возбуждении, и цитоплазма может начать сочиться, что приводит к гибели яйцеклеток.
  2. Через 5-6 ч добавьте небольшую каплю воды DI в прозрачную пленочную повязку с прикрепленными эмбрионами. Используя кисть, аккуратно вытесните яйца. Переложите яйца в небольшую чашку Петри (10 см) и погрузите их в воду DI.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пленочная повязка позволяет легко удалять яйцеклетки после инъекций. В тот момент, когда капля воды будет добавлена в пленочную повязку, яйца начнут двигаться вместе с водой.
  3. Держите яйца погруженными в воду и поместите чашку Петри в 6-квартовую пластиковую коробку в инкубаторе при 27 °C и >90% относительной влажности.
  4. Проверяйте яйца регулярно, ежедневно в течение первых нескольких дней, а затем каждые 3-4 дня, пока личинки не начнут вылупляться.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если большое количество яиц повреждено во время микроинъекций, осторожное слив воды DI через неделю предотвратит грибковый рост на мертвых яйцах.
  5. Когда личинки начнут вылупляться из введенных эмбрионов (через 21-25 дней после инъекции для настоящей лабораторной установки), ежедневно проверяйте их и переносите любых вылупившихся личинок в стеклянные флаконы с экраном сверху. Личинки могут вылупляться под водой и выживать в течение ~1-2 недель.
  6. Скрининг личинок4 , если яйца были введены с конструкцией, которая может привести к видимому фенотипу.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Успешный протокол инъекции эмбриона для I. scapularis описан в этой статье. Самок яйцекладущих держали при высокой влажности, чтобы избежать высыхания частично вощеных яиц. Восковой слой удаляли для введения эмбрионов клещей путем абляции органа гена (восковой железы) гравидной самки (рисунок 1A-E). Мы использовали иглы из алюмосиликатного стекла с более коротким горлышком (рисунок 2). Эта форма идеально подходила для и...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это первый протокол, разработанный для успешного введения ранних эмбрионов клещей. Была достигнута выживаемость ~4%-8%, что сопоставимо с инъекцией эмбриона в других хорошо зарекомендовавших себя моделях насекомых5.

Поскольку это первоначальный протокол, ожидается, что этот протокол будет дополнительно усовершенствован и специализирован для отдельных видов клещей. В частности, сроки инъекций будут варьироваться от вида к виду, в зависимости от эмбриогенеза, особенно от ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы выражают признательность Чанне Алувихаре и Йонусу Гебермикале, ITF, UMD, за понимание и поддержку на начальном этапе разработки протокола. Вольфрамовые иглы были щедрым подарком от Дэвида О'Брохты, ITF, UMD. Мы благодарны доктору Ладиславу Симо за тестирование этого протокола на I. ricinus и за проницательные дискуссии. Этот проект финансировался NIH-NIAID R21AI128393 и Plymouth Hill Foundation, NY to MG-N, стартовыми фондами от Университета Невады до AN, грантом Национального научного фонда No 2019609 MG-N и AN и грантом Peer-to-Peer от IGTRCN до AS.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Капилляры из силиката алюминия, с нитьюSutter instrumentsAF100-64-10Инъекция эмбриона
Бензалкония хлорид 50% в воде, 25 гTCI-AmericaB0414Лечение эмбриона, 25 г примерно 25 мл
Фильтровальная бумагаВатман1001-090Постинъекционный уход
ЩипцыThomas Scientific300-101Орган гена манипуляция
Лабораторные салфеткиGenesee Scientific88-115
Наконечники микрозагрузчикаEppendorf930001007Загрузка вытянутых игл
МикроманипуляторИнструменты SutterROE-200Инъекция эмбриона
Микроскопические слайды - гладкие, шлифованные краяGenesee Scientific29-100Выравнивание эмбрионов, предпочтительны шлифованные края, скошенные края могут скрыть яйцеклетки от взгляда
NaClResearch Products InternationalS23020-500.0Обработка эмбрионов
Needle PullerSutter InstrumentsP-1000
Перманентная двусторонняя лентаСкотч34-8716-3417-5Выравнивание
эмбрионов Пластины Петри GeneseeScientific32-107GУход после инъекции
Tegaderm/ Прозрачный пленочная повязка3M Healthcare1628Выравнивание эмбриона
Вольфрамовые иглыFine Science Tools10130-10Манипуляции с органами Гена
Вольфрамовая проволокаAmazonB08DNT7ZK3Манипуляции с органами
Гена XenoWorks Цифровой микроинъектор ИнструментыSutterMPC-200Инъекция эмбриона

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

CRISPR Cas9

Похожие статьи