Method Article

Выделение условно увековеченных мышиных клубочковых эндотелиальных клеток с флуоресцентными митохондриями

DOI:

10.3791/64147

⸱

September 13th, 2022

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Division of Nephrology, The Icahn School of Medicine at Mount Sinai

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В статье описан способ выделения условно увековеченных клубочковых эндотелиальных клеток из почек трансгенных мышей, экспрессирующих термолабильный обезьяний вирус 40 и фотоактивируемых митохондрий,иссекенных PhAM. Описана процедура выделения клубочков из цельных почек с помощью шариков, стадий пищеварения, посева и культивирования GECs-CD31-положительных.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Дисфункция клубочковых эндотелиальных клеток (GEC) может инициировать и способствовать разрушению клубочкового фильтрационного барьера. Повышенный митохондриальный окислительный стресс был предложен в качестве механизма, приводящего к дисфункции GEC в патогенезе некоторых клубочковых заболеваний. Исторически изоляция ГЭС от моделей in vivo была, как известно, сложной задачей из-за трудностей в выделении чистых культур из клубочков. GEC имеют сложные требования к росту in vitro и очень ограниченную продолжительность жизни. Здесь мы описываем процедуру выделения и культивирования условно увековеченных ГЭС с флуоресцентными митохондриями, позволяющими отслеживать события деления и синтеза митохондрий. GEC были выделены из почек двойной трансгенной мыши, экспрессирующей термолабильный SV40 TAg (из Immortomouse), условно способствующий пролиферации и подавлению дифференцировки клеток, и фотоконвертируемый флуоресцентный белок (Dendra2) во всех митохондриях (от фотоактивируемых митохондрий [PhAMиссеченной] мыши). Полученная стабильная клеточная линия позволяет дифференцировать клетки после инактивации увековечивающего гена SV40 TAg и фотоактивации подмножества митохондрий, вызывая переключение флуоресценции с зеленого на красный. Использование mitoDendra2-GEC позволяет в реальном времени визуализировать события распределения, слияния и деления флуоресцентных митохондрий без окрашивания клеток.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клубочек имеет решающее значение для фильтрации крови, ограничивая прохождение крупных молекул через клубочковый фильтрационный барьер 1,2. Клубочек содержит четыре типа клеток: теменные эпителиальные клетки, подоциты (висцеральные эпителиальные клетки), клубочковые эндотелиальные клетки (GEC) и мезангиальные клетки3. Клубочковый эндотелий характеризуется уникальной сосудистой структурой, в соответствии с наличием фенестр, необходимых для больших объемов фильтрации4. Апикальная поверхность клубочкового эндотелия покрыта отрицательно заряженным слоем гликокаликса и оболочкой, называемой поверхностным слоем эндотелия, которая создает пространство между эндотелием и кровью. Эта структура обеспечивает высокую селективность заряда, ограничивая прохождение отрицательно заряженных молекул, таких как альбумин, и предотвращая адгезию лейкоцитов и тромбоцитов5.

ГЭС очень чувствительны к метаболическим изменениям, таким как гипергликемия, связанная с диабетической средой. Действительно, сахарный диабет приводит к усилению циркуляции вредных веществ, насыщению путей метаболизма глюкозы, нарушению клеточного окислительно-восстановительного баланса 3,6. Кроме того, увеличение активных форм кислорода вызывает митохондриальную дисфункцию, которая влияет на функцию эндотелия7.

Общей целью текущего протокола является выделение увековеченных клубочковых эндотелиальных клеток с флуоресцентными митохондриальными особенностями. Действительно, клеточная культура первичных ГЭС имеет ограниченный пролиферативный цикл и раннее старение8. Кроме того, наличие флуоресцентных митохондрий помогает исследовать события деления и слияния в ответ на гипергликемию или любое другое лечение. В качестве альтернативного метода другие лаборатории использовали h-TERT для увековечения клеток in vitro9.

Описанный здесь способ позволяет выделить условно увековеченные клубочковые эндотелиальные клетки mitoDendra2 у 4-6-недельных животных (рисунок 1). Этот подробный протокол описывает использование трансгенных мышей (H-2K b-tsA58), содержащих ген крупного опухолевого антигена обезьяны 40 (SV40 TAg)10,11 для генерации термолабильных условно увековеченных клеток. Продукт гена tsA58 TAg функционирует при разрешительной температуре 33 °C под контролем индуцируемого 5'-флангового промотора мышиного гена H-2Kb, который увеличивается выше базальных уровней при воздействии интерферона гамма (IFNγ), поэтому поддерживается условный фенотип пролиферации12. H-2Kb быстро деградирует при непермиссивной температуре 37 °C в отсутствие IFNγ, удаляя увековечивающую функцию tsA58Tag в клетках и позволяя клеткам развивать более дифференцированный фенотип 13,14,15. Необязательное скрещивание трансгенных мышей H-2Kb-tsA58 с мышами PhAM, которые экспрессируют митохондриально-специфическую (субъединицу VIII цитохром-с-оксидазы) Dendra2-green, позволяет вживую обнаружить флуоресцентные митохондрии16. Зеленая флуоресценция Dendra2 переключается на красную флуоресценцию после воздействия 405 нм лазера16. Когда митохондрии сливаются после переключения фотографий, они образуют вытянутые формы, которые кажутся желтыми от обмена зеленым и желтым материалом или кажутся красными, когда они подвергаются делению 7,17. MitoDendra2-GECs являются отличным инструментом для изучения клеточных реакций митохондрий GEC на различные стимулы.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры для животных, описанные здесь, были одобрены IACUC в Медицинской школе Икана на горе Синай. Мы использовали трех самцов мышей (трансгенных мышей H-2Kb-tsA58 с фотоактивируемыми митохондриями [PhAM]), купленных в лаборатории Джексона и придерживавшихся нормальной диеты чау.

1. Условия труда и подготовка

  1. Очистите рабочее пространство внутри ламинарной вытяжки, используя 70% этанола и ультрафиолетового света.
  2. Подготовьте буферы для мытья шариков. Делают буфер-1 с использованием 0,1 М фосфата натрия при рН 7,4-8,0, буфер-2 с использованием 1x фосфат-буферного физиологического раствора (PBS) без кальция и магния с добавлением 0,1% бычьего сывороточного антигена (BSA), 3 мМ ЭДТА, рН 7,4 и буфера-3, используя 0,2 М Трис с 0,1% BSA, рН 8,5.

2. Концентратор магнитных частиц

  1. Приготовление магнитных шариков
    1. В микроцентрифужной трубке объемом 1,5 мл аккуратно смешайте 200 мкл магнитных шариков (4 х 108 бусин) с 200 мкл буфера-1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте 200 мкл магнитных шариков на мышь за 1 день до сбора ткани. Бусины будут использоваться для сбора клубочков.
    2. Поместите трубку в концентратор магнитных частиц на 1 мин, затем осторожно аспирируйте супернатант. Снимите трубку с магнита и повторно суспендируйте промытые шарики в 200 мкл буфера-1.
    3. Поместите трубку, содержащую магнитные шарики, в концентратор магнитных частиц на 1 мин и осторожно аспирируйте супернатант.
    4. Инактивируют свободные тозиловые группы путем промывки магнитных шариков по 2x, 5 мин каждая, используя 200 мкл буфера-2 путем помещения трубки в концентратор магнитных частиц и отбрасывания буфера.
    5. Инкубируют магнитные шарики в 200 мкл буфера-3 в течение 24 ч при 4 °C или в течение 4 ч при 37 °C, чтобы инактивировать оставшиеся свободные тозиловые группы. Поместите трубку в магнитный концентратор на 1 мин, аккуратно аспирируйте супернатант и выбросьте его.
    6. Промыть магнитные шарики 1x с 200 мкл буфера-2 в течение 5 мин при 4 °C. Поместите трубку обратно в магнитный концентратор на 1 мин и осторожно аспирируйте супернатант. Извлеките трубку из магнитного концентратора и повторно суспендируйте магнитные шарики в 200 мкл буфера-2 для получения 4 х 108 бусин/мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе можно оставить бусины при 4 °C на срок до 15 дней.

3. Выделение клубочковых клеток почек мыши

  1. Подготовьте перфузионный материал: шприц 30 мл, игла бабочки 25 г. Подготовьте изоляционный материал: стерильную 10 см тарелку, скальпель, концентратор магнитных частиц, клеточный сетчатый фильтр 40 мкм, клеточный сетчатый фильтр 100 мкм.
  2. Приготовьте 100 мл 1x сбалансированного солевого раствора Хэнка (HBSS), дополненного 1% антибиотиками, и отрегулируйте рН до 7,35. Отфильтруйте раствор фильтром 0,2 мкм и держите его под капотом, чтобы избежать загрязнения.
  3. Смешайте 200 мкл магнитных шариков со стадии 2.1.6 с 20 мл 1x HBSS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждой мыши потребуется 200 мкл бусин, разведенных в 20 мл HBSS 1x.
  4. Готовят 1 мл аликвоты коллагеназы II типа (125 ХДС/мг) по 1 мг/мл в 1 растворе HBSS, рН 7,35. Предварительно нагрейте RPMI с 10% fcS средой на водяной бане при 37 °C. Предварительно нагрейте среду культивирования эндотелиальных клеток при 37 °C (подробнее см. Таблицу материалов ).
    ПРИМЕЧАНИЕ: RPMI будет использоваться для нейтрализации коллагеназы.
  5. Предварительно покрывать две лунки 6-луночной пластины 2 мл 10 мкг/мл коллагена IV (1 мл/лунка) в течение 45 мин при комнатной температуре. Вымойте пластину 3x с 1x PBS, чтобы удалить уксусную кислоту, используемую для разбавления коллагена. Немедленно используйте пластины с покрытием или храните их при температуре 2-8 °C в течение 4 недель.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Уплотнение пластины (пластин) прозрачной пленкой предпочтительно для предотвращения высыхания. Коллагеновое покрытие облегчает прикрепление клеток к пластине.
  6. Очистите и стерилизуйте все хирургические инструменты на рисунке 2 , используя 70% этанола и впоследствии автоклавируя их в течение 30 минут. Очистите хирургическое рабочее пространство 70% этанолом.
  7. Анестезируют мышей внутрибрюшинной инъекцией кетамина/ксилазина (10 мг/мл кетамина и 1 мг/мл ксилазина). Чтобы подтвердить, что животное полностью обезболено, проверьте рефлекс защемления пальца ноги.
  8. Зафиксируйте лапы мыши иглами 19 G, чтобы удерживать ее на месте на платформе для рассечения. Очистите грудь и живот 70% этанолом, а живот вдоль груди раскройте ножницами (рисунок 2).
  9. Вставьте иглу бабочки в левый желудочек (рисунок 3А) и введите около 100 мкл бусинчатого раствора (из стадии 1.2) для расширения кровообращения.
  10. Осторожно разорвите нижнюю полую вену ниже почек иглой 19 Г (рисунок 3А). Продолжайте перфузию, начатую на шаге 3.9.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, мини-насос можно использовать на скорости: 18,0 +, время: 5 мин. Хорошая перфузия важна для сбора большого количества клубочков, несущих магнитные шарики. Это процедура, не связанная с выживанием / терминальная процедура.
  11. Аккуратно удалите жировую ткань пинцетом и иссекните обе почки тонкими хирургическими ножницами c (рисунок 2) и поместите их в пластину с 1 мл 1x HBSS на льду. Измельчите почки ножницами b (Рисунок 2), затем стерильным скальпелем до 1 мм небольшими кусочками, как показано на рисунке 3B.
  12. Далее инкубируют измельченную почку с 1 мл коллагеназы II типа со стадии 3,4 в течение 35 мин при 37 °C с мягким наклоном с помощью горизонтального шейкера. Ткань должна быть полностью переварена после этой стадии, как показано на рисунке 3C.
  13. Добавьте 4 мл RPMI с 10% FBS (из шага 3.4) для нейтрализации коллагеназы. Отфильтруйте переваренную ткань через стерильный клеточный сетчатый фильтр 100 мкм в пробирку объемом 50 мл. Используйте дно стерильной микроцентрифужной трубки объемом 1,5 мл, чтобы перемешать переваренную ткань против ситечка, чтобы позволить клубочкам пройти.
  14. Промыть клеточный сетчатый фильтр 15 мл 1x HBSS, а затем центрифугировать проточный фильтр при 200 x g в течение 5 мин при комнатной температуре. В этот момент гранула содержит три слоя; шарики с клубочками видны в среднем слое трубки, верхний слой состоит из более мелких структур, таких как канальцы, а нижний слой представляет собой мусор (рисунок 3D).
  15. Тщательно аспирируйте супернатант и верхний белый слой. Оставшаяся гранула содержит бусины, несущие клубочки и мусор (рисунок 3D). Повторно суспендировать гранулы с 1,5 мл 1x HBSS и переложить в трубку 2 мл.
  16. Поместите трубку в магнитный концентратор (рисунок 3Е), аспирируйте супернатант, а затем промыть шарики 2x 1 мл 1x HBSS; на этом этапе поместите 20 мкл клеточной суспензии на слайд, чтобы проверить наличие клубочков под микроскопом (рисунок 3F; клубочек [черная стрелка] и некоторые бусины [желтые стрелки] в суспензии).
  17. Осторожно аспирируйте супернатант, повторно суспендируйте гранулу в среде для роста эндотелиальных клеток (Таблица материалов) и переложите ее в чистую трубку объемом 2 мл. Добавьте 2 мкл IFNγ (100 Ед/мл) в трубку и нанесите ячейки на одну лунку 6-луночной пластины. Инкубируют клетки при 33 °C.
  18. После 3 дней посева тщательно меняют среду, пипетируя 1 мл среды и заменяя ее 1 мл свежей среды. На этом этапе клетки неоднородны со смесью клубочковых клеток (рисунок 4G).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В вырастающей культуре будет смесь клубочковых клеток и некоторых магнитных шариков (рисунок 4G). Обратите внимание, что все клетки должны показывать зеленые, флуоресцентные митохондрии.
  19. После 7 дней посева полностью аспирировать среду и заменить ее свежими 2 мл среды роста эндотелиальных клеток, дополненной IFNγ (100 Ед/мл). На этом этапе клетки начинают пролиферировать, но все еще гетерогенны (рисунок 4A).
  20. После 10 дней культивирования, когда клетки достигнут ~ 80% конфлюзии, пройдите клетки с использованием трипсина, как описано на этапе 5.1, а затем переместите их в колбу T25, покрытую коллагеном IV.
  21. Через 1 неделю (всего ~21 день посева) проведите клетки в колбу Т75, покрытую коллагеном IV.

4. Подготовка шариков для выделения эндотелиальных клеток

  1. Начните с покрытия овец против крысиных шариков антителом CD31против крыс 3,18,19. Используйте 10 мкл бусин для каждой колбы T75.
  2. Промыть 10 мкл бусин 3x с 200 мкл 1x PBS с добавлением 0,1% BSA, 2 мМ ЭДТА, 1% пенициллина/стрептомицина. Поместите трубку в магнит концентратора, чтобы каждый раз пипетку промывочного буфера.
  3. Повторное суспендирование шариков в 200 мкл PBS, 1% BSA, 2 мМ ЭДТА, 1% пенициллина/стрептомицина. Добавьте 4,8 мкл антимышечного антитела против мыши CD31 7,18,19, поместите трубку на горизонтальный шейкер и осторожно перемешайте в течение 1 ч при комнатной температуре, а затем держите трубку при 4 °C в течение ночи.

5. Выделение клубочковых эндотелиальных клеток шариками, покрытыми CD31

  1. Добавьте 3 мл 0,25% трипсина в колбу T75 и инкубируйте клетки при 37 °C в течение 5 мин. Нейтрализуют трипсин 3 мл эндотелиальной питательной среды, переносят клетки в трубку объемом 15 мл, а затем центрифугу при 200 х г в течение 5 мин.
  2. Аспирировать супернатант и промыть клетки в 1 мл PBS, содержащего 1% BSA, 2 мМ ЭДТА, 1% пенициллина/стрептомицина. Центрифуга при 200 х г в течение 5 мин.
  3. Повторно суспендируют гранулу в 200 мкл покрытых оболочкой шариков, приготовленных на стадии 4, и добавляют 800 мкл PBS, содержащих 1% BSA, 2 мМ ЭДТА, 1% пенициллина/стрептомицина. Инкубировать клетки в течение 45 мин с непрерывным встряхиванием при 37 °C, 5% CO2.
  4. Поместите трубку в магнитный концентратор и промыть ячейки 4x с 1x PBS, содержащим 1% BSA, 2 мМ ЭДТА, 1% пенициллина/стрептомицина. Повторно суспендируют клетки в 3 мл эндотелиальной питательной среды, дополненной 100 Ед/мл IFNγ.
  5. Пластина 1,5 мл клеток /лунка в коллагеновых скважинах, покрытых IV, на 6-луночной пластине. Культивировать клетки в разрешительных условиях при 33 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изолированные клетки экспрессируют вирус обезьяны 40 (SV40) большого Т-антигена tsA58, что позволяет активировать непрерывную пролиферацию при 33 °C (разрешительное состояние).
  6. Через 4 дня в культуре удаляют 750 мкл среды и заменяют ее тем же объемом свежей среды, дополненной 100 Ед/мл IFNγ.
  7. После 10-14 дней культивирования проверьте наличие растущих CD31-положительных колоний GECs (рисунок 4C), которые экспрессируют флуоресцентные митохондрии, используя эпифлуоресцентный микроскоп с фильтром 488 нм.
  8. После 21 дня культивирования клетки могут достичь 80-90% слияния; переложите их в колбу T25. После достижения слияния клетки могут поддерживаться с помощью питательной среды RPMI и 10% FCS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Прежде чем достичь слияния, клетки могут выглядеть неоднородными (рисунок 4B). Однако, как только они сливаются, они приобретают булыжно-каменную морфологию.
  9. На этом этапе клетки могут быть криоконсервированы. При достижении 80% слияния добавляют в клетки 3 мл 0,25% трипсина и инкубируют их при 37 °C в течение 5 мин. Нейтрализуют трипсин равным объемом питательной среды, дополненной 10% FBS.
  10. Центрифуга при 200 х г в течение 5 мин. Откажитесь от супернатанта и повторно суспендируйте клетки в 3 мл морозильной среды (RPMI, 20% FBS, 10% DMSO). Аликвотирование клеток в криотрубки и хранение их при температуре паров жидкого азота.

6. Культивирование mitoDendra2-GEC

  1. Разморозьте клетки из криоаликоты со стадии 5,10 на водяной бане при 37 °C и переложите их в 15 мл трубку с 10 мл предварительно нагретой эндотелиальной питательной среды.
  2. Центрифугировать суспензию при 200 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Удалите среду и переложите гранулу в коллагеновую колбу для культивирования клеток T25см2 с предварительно нагретой средой для роста эндотелиальных клеток, дополненной 100 ЕД/мл IFNγ и инкубирующей при 33 °C.
  3. Смените среду на следующий день. Когда клетки достигнут 70%-80% сливания, обычно через 5 дней перенесут их в колбу для культивирования клеток Т75см2 .
  4. Чтобы дифференцировать клетки по эндотелиальному фенотипу, переведите клетки в неразрешающие условия при 37 °C в средах роста без IFNγ.

7. Прохождение mitoDendra2-GEC

  1. Удалить среду, промыть клетки PBS и добавить 3 мл теплого 0,25% раствора трипсина-ЭДТА (T75см2 колбы), инкубировать при 37 °C в течение 5 мин.
  2. Когда клетки отсоединятся, добавьте 5 мл питательной среды и пипетку вверх и вниз. Центрифугируют суспензию при 200 х г в течение 5 мин при комнатной температуре и переносят ячейки в новую коллагеновую колбу или пластину, покрытую IV.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пассаж следует проводить один раз в неделю в соотношении 1:4.

8. Характеристика mitoDendra2-GEC

  1. Выполняют иммунофлуоресцентное окрашивание cd31 на дифференцированных клетках 7,18,19,20 (рисунок 4D). Используйте другие маркеры, такие как vWF и isolectin-B4, а также20.
  2. Чтобы подтвердить митохондриальную специфичность Dendra2, маркируют клетки митохондриально-специфическими маркерами путем инкубации клеток в среде роста, содержащей 100 нМ митохондриального трекера, в течение 30 мин при 37 °C, 5% CO2.
  3. Удалите среду и аккуратно промойте клетки предварительно нагретой средой без фенольного красного цвета для выполнения живой визуализации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативно, клетки могут быть зафиксированы с помощью формальдегидных фиксаторов (4%) в течение 30 мин с последующей промывкой несколько раз в PBS. Фиксированные ячейки могут храниться при 4 °C в 1x PBS до использования. Также возможно подтверждение с помощью проточной цитометрии: этикеточные клетки с анти-CD31, анти-PECAM, анти-CD45. GECs должны окрашиваться отрицательно для маркеров подоцитов (синаптоподин, Nphs1, Podxl), маркеров мезангиальных клеток (PDGFRβ, ангиотензиноген) и канальцевых клеточных маркеров (Aquaporin, Aminopeptidase-N). Эти маркеры служат негативным контролем. Из-за митохондриально-специфической экспрессии Dendra2 этих клеток избегайте использования канала FITC.

9. Визуализация живых клеток структурных изменений митохондрий в ответ на окислительный стресс или высокий уровень глюкозы

  1. Пластина 1 x 105 GEC на тарелке со стеклянным дном толщиной 35 мм, покрытой коллагеном IV с использованием среды для роста эндотелиальных клеток (Таблица материалов). Через 24 ч изменить на средний без фенола красного цвета. Клетки имеют зеленые, флуоресцентные митохондрии.
  2. Установите экологическую камеру при 37 °C, влажности 5% и 5%CO2 за 1 ч до начала эксперимента.
  3. Под конфокальным микроскопом используйте объектив 40x/1,2 Вт, чтобы настроить фокус и выбрать интересующую область. Инкубируют клетки с 2 мл 5 мМ или 25 мМ глюкозы в течение 60 мин.
  4. Подвергайте клетки воздействию лазера 405 нм (мощность лазера 4%) для фотопреобразования субпопуляции митохондрий из зеленого в красный (рисунок 5A-B, D-E).
  5. Используйте лазер 561 нм для возбуждения Dendra2 в неконвертированном состоянии для визуализации красной флуоресценции. Смотрите подробный протокол переключения фотографий, как описано ранее16. События синтеза проявляются в виде желтой флуоресценции через несколько минут из-за слияния зеленой матрицы и красной матрицы (рисунок 4C, F).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной статье описан подробный протокол выделения условно увековеченных клубочковых эндотелиальных клеток со стабильными флуоресцентными митохондриями (mitoDendra2-GECs) (рисунок 1). Использование молодых 6-10-недельных мышей имеет важное значение для получения значительного количества здоровых клеток. После 3 дней культивирования клетки начинают медленно расти из изолированных клубочков, как показано на рисунке 3G. Через 7 дней клетки становятся гетерогенными...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Митохондрии имеют решающее значение для клеточного метаболизма, гомеостаза и стрессовых реакций, и их дисфункция связана со многими заболеваниями, включая заболевания почек. Митохондрии играют роль в патологической генерации избыточных активных форм кислорода (АФК), регуляции внутриклеточных уровней кальция, путей гибели клеток и динамики цитоскелета 21,22,23.

Изоляция мышиных GEC является сложной зад...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют конкурирующих финансовых интересов для декларирования.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарят профессора Сицзян Хэ и доктора Фу Цзя за их понимание изоляции эндотелиальных клеток мышей и благодарят профессора Моне Заиди за предоставлениеPhAM иссекенных мышей и ценные дискуссии. Авторы также хотели бы поблагодарить Microscopy CORE в Медицинской школе Икана на горе Синай и сотрудников за руководство, которое мы получили. Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения R01DK097253 и грантом МИНИСТЕРСТВА обороны CDMRP E01 W81XWH2010836 для I.S.D.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100 &микро; m клеточное ситечкоFisher22-363-549
1мл инсулиновые шприцыBD329424
25г бабочкаBD367298
3 мм ножницы с режущей кромкойF.S.T15000-00
30 мл шприцBD Biooscience309650
40 &микро; m клеточное сетчатое фильтрFisher22-363-547
40 &микро; m нейлоновая сетка
Bonn НожницыF.S.T14184-09
Бычья сыворотка альбуминFisherBP1600-100
CD31 abcamab7388
Коллагеназа типа ICorning354236
Коллагеназа типа IISIGMAC6885125CDU/mg
Коллаген типа IVSIGMAC5533-5M
Dnase-IQiagen79254
Dynabeads 450Thermofisher Scientific14013
Среда для роста эндотелиальных клетокLonzacc-3156
Очень тонкие щипцыF.S.T11150-10
FBSGemini100-106Фибронектин инактивированный при нагревании
Thermofisher33016015
Тонкие щипцыF.S.T DumontE6511
HBSSGIBCO14065-056
IFNgCell ScienceCRI001B
ImmortomouseJackson laboratory32619Tg(H2-K1-tsA58)6Kio/LicrmJ
L-глютамин 100xThermofisher Scientific25030081
Концентратор магнитных частицThermofisher Scientific12320D
митотрекерThermofisher ScientificM7512
PBS 1XCorning46-013-CM
пенециллин стрептомицин 100xThermofisher Scientific10378016
мышиPhaM Jackson laboratory18397B6; 129S-Gt(ROSA)26Sortm1.1(CAG-COX8A/Dendra2)Dcc/J
Протеаза (10 мг/мл)SIGMAP6911
RPMIGIBCO3945
Пируват натрия 100mMThermofisher Scientific11360070
Стандартные щипцы  F.S.T11000-12
Хирургические ножницы - острые-тупыеF.S.T14008-14
синаптоподинSanta Cruzsc-515842
Трипсин 0,05%Thermofisher Scientific25300054

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Daehn, I. S., Duffield, J. S. The glomerular filtration barrier: A structural target for novel kidney therapies. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (10), 770-788 (2021).
  2. Fu, J., Lee, K., Chuang, P. Y., Liu, Z., He, J. C. Glomerular endothelial cell injury and cross talk in diabetic kidney disease. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 308 (4), 287-297 (2015).
  3. Lassen, E., Daehn, I. S. Molecular mechanisms in early diabetic kidney disease: Glomerular endothelial cell dysfunction. International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9456(2020).
  4. Haraldsson, B., Jeansson, M. Glomerular filtration barrier. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 18 (4), 331-335 (2009).
  5. Yilmaz, O., Afsar, B., Ortiz, A., Kanbay, M. The role of endothelial glycocalyx in health and disease. Clinical Kidney Journal. 12 (5), 611-619 (2019).
  6. Giacco, F., Brownlee, M. Oxidative stress and diabetic complications. Circulation Research. 107 (9), 1058-1070 (2010).
  7. Daehn, I. S. Glomerular endothelial cell stress and cross-talk With podocytes in early [corrected] diabetic kidney disease. Frontiers in Medicine. 5, 76(2018).
  8. Satchell, S. C., et al. Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF. Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).
  9. Wieser, M., et al. hTERT alone immortalizes epithelial cells of renal proximal tubules without changing their functional characteristics. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 295 (5), 1365-1375 (2008).
  10. Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb- tsA58 transgenic mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (12), 5096-5100 (1991).
  11. Jat, P. S., Sharp, P. A. Cell lines established by a temperature-sensitive simian virus 40 large- T-antigen gene are growth restricted at the nonpermissive temperature. Molecular and Cellular Biology. 9 (4), 1672-1681 (1989).
  12. Israel, A., Kimura, A., Fournier, A., Fellous, M., Kourilsky, P. Interferon response sequence potentiates activity of an enhancer in the promoter region of a mouse H-2 gene. Nature. 322 (6081), 743-746 (1986).
  13. Mundel, P., et al. Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines. Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).
  14. Ohse, T., et al. Establishment of conditionally immortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture. Journal of the American Society of Nephrology. 19 (10), 1879-1890 (2008).
  15. Rops, A. L., et al. Isolation and characterization of conditionally immortalized mouse glomerular endothelial cell lines. Kidney International. 66 (6), 2193-2201 (2004).
  16. Pham, A. H., McCaffery, J. M., Chan, D. C. Mouse lines with photo-activatable mitochondria to study mitochondrial dynamics. Genesis. 50 (11), 833-843 (2012).
  17. Archer, S. L. Mitochondrial dynamics--Mitochondrial fission and fusion in human diseases. The New England Journal of Medicine. 369 (23), 2236-2251 (2013).
  18. Casalena, G. A., et al. The diabetic microenvironment causes mitochondrial oxidative stress in glomerular endothelial cells and pathological crosstalk with podocytes. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 105(2020).
  19. Qi, H., et al. Glomerular endothelial mitochondrial dysfunction is essential and characteristic of diabetic kidney disease susceptibility. Diabetes. 66 (3), 763-778 (2017).
  20. Akis, N., Madaio, M. P. Isolation, culture, and characterization of endothelial cells from mouse glomeruli. Kidney International. 65 (6), 2223-2227 (2004).
  21. Schuler, M. H., et al. Miro1-mediated mitochondrial positioning shapes intracellular energy gradients required for cell migration. Molecular Biology of the Cell. 28 (16), 2159-2169 (2017).
  22. Tang, C., et al. Mitochondrial quality control in kidney injury and repair. Nature Reviews. Nephrology. 17 (5), 299-318 (2020).
  23. Daniel, R., Mengeta, A., Bilodeau, P., Lee, J. M. Mitochondria tether to Focal Adhesions during cell migration and regulate their size. bioRxiv. , 827998(2019).
  24. Dylewski, J. F., et al. Isolation, purification, and conditional immortalization of murine glomerular endothelial cells of microvascular phenotype. MethodsX. 7, 101048(2020).
  25. Drexler, H. G., Uphoff, C. C. Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention. Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Glomerular Endothelial CellsFluorescent MitochondriaMitochondrial FissionMitochondrial FusionCell IsolationMagnetic Bead SeparationCollagen IV CoatingEndothelial Cell CultureCD31 Antibody SelectionLive Cell Imaging

Related Articles