Method Article

Подготовка и структурная оценка монослоев эпителиальных клеток в физиологически размерном микрофлюидном культуральном устройстве

DOI:

10.3791/64148

⸱

July 1st, 2022

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, School of Science and Engineering, Tulane University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представленный протокол описывает разработку и использование метода окрашивания нитчато-актинового лактина на основе фаллоидина с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM) для визуализации структуры адгезивного клеточного слоя в микрофлюидных динамических культурных каналах и традиционных стационарных камерах статического культивирования. Этот подход помогает оценить слияние клеточного слоя, образование монослоя и однородность толщины слоя.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микрофлюидные эксперименты in vitro обладают большим потенциалом для раскрытия многих идей о микрофизиологических явлениях, происходящих при таких состояниях, как острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС) и вызванное искусственной вентиляцией легких повреждение легких (ВИЛИ). Тем не менее, исследования микрофлюидных каналов с размерами, физиологически относящимися к терминальным бронхиолам легких человека, в настоящее время сталкиваются с рядом проблем, особенно из-за трудностей в установлении соответствующих условий культивирования клеток, включая скорость потока среды, в данной среде культивирования. Представленный протокол описывает основанный на изображениях подход к оценке структуры эпителиальных клеток легких человека NCI-H441, культивируемых в кислородонепроницаемом микрофлюидном канале с размерами, физиологически соответствующими терминальным бронхиолам легкого человека. Используя филлоидное окрашивание на основе филлоидина, цитоскелетные структуры клеток выявляются с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, что позволяет визуализировать как отдельные, так и слоистые клетки. Последующая количественная оценка определяет, производят ли используемые условия культивирования клеток однородные монослои, пригодные для дальнейших экспериментов. Протокол описывает методы оценки клеточных культур и слоев в микрофлюидных каналах и традиционных средах с фиксированными лунками. Это включает в себя построение канала, культуру клеток и необходимые условия, фиксацию, пермеабилизацию и окрашивание, конфокальную микроскопическую визуализацию, обработку изображений и анализ данных.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС) - это острое состояние, возникающее в результате инсульта и распространения повреждения паренхимы легкого, что приводит к отеку альвеол легких, недостаточному газообмену и последующей гипоксемии1. Это инициирует цикл высвобождения провоспалительных цитокинов, рекрутирования нейтрофилов, высвобождения токсического медиатора и повреждения тканей, что само по себе вызывает дальнейшую воспалительную реакцию2. Кроме того, легочный сурфактант, который стабилизирует дыхательные пути и предотвращает повреждение, вызванное повторяющимся набором/дерекрутированием (R/D), может быть инакт....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для настоящего исследования была использована линия эпителиальных клеток легких человека NCI-H441 (см. Таблицу материалов).

1. Культура клеток в микрофлюидном канале

  1. Изготовьте микрофлюидный канал и выполните предварительную обработку, выполнив следующие действия.
    1. Получите одноканальный массив потока (см. Таблицу материалов) и отделите верхнюю часть от опорной плиты из поликарбоната.
    2. Получите прямоугольное покровное стекло #1.5 (толщина 0.17 мм) с размерами 60 мм x 22 мм. Очистите поверхности покровного стекла в ультразвуковой ванне и обработайте одну сторону рас....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представленный способ позволяет визуализировать слои эпителиальных клеток, культивируемых в каналах микрофлюидных культур, и использует демонстрацию в традиционных средах культивирования клеток с фиксированной лункой в качестве валидации. Полученные изображения будут существовать в спектре качества, интенсивности сигнала и специфичности клеточной цели. Успешные изображения будут демонстрировать высокую контрастность, что позволит анализировать изображения и количественно оценивать данные для последующей статистической оц.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В представленном протоколе описаны культивирование, сшивание, фиксация, окрашивание, пермеабилизация и конфокальная микроскопическая визуализация эпителиальных клеток легких человека NCI-H441 в динамической среде одноканального микрофлюидного проточного массива, а также в статической среде традиционного восьмилуночнокамерного покровного стекла. При любом протоколе микрофлюидного культивирования клеток условия потока среды для культивирования клеток имеют первостепенное значение, поскольку высокоскоростной поток может вым.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы выражают благодарность Алану Шепардсону за разработку схемы резки клея 3M и майларового листа, используемых в конструкции микрофлюидных каналов, а также за тестирование скорости потока среды для культивирования клеток и программирование шприцевого насоса. Финансирование было предоставлено NIH R01 HL0142702, NSF CBET 1706801 и грантом декана колледжа Ньюкомб-Тулейн.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Система конфокальных микроскопов A1R HD25NikonA1R HD25https://www.microscope.healthcare.nikon.
com/products/confocal-microscopes/a1hd25-a1rhd25/specifications
ActinGreen 488 ReadyProbes Реагент (AlexaFluor 488 фаллоидин)InvitrogenR37110
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37110 клейкая лента для переноса с двойным подкладкой3M468 МПhttps://gizmodorks.com/3m-468mp-adhesive-transfer-tape-sheet-5-pack/
Air-Tite  HSW Soft-Ject Одноразовые шприцыAir-Tite RL514-817-53https://www.fishersci.com/shop/products/air-tite-hsw-soft-ject-disposable-syringes-6/1481753#?keyword=syringe%20leur%20locking%205ml
BAISDY 4 мил (0,1 мм) Толстый майларовый листBAISDYAS022https://www.amazon.ca/Stencil-Perfect-Silhouette-Machines-BAISDY/dp/B07RJJ9BNC
Branson Ultrasonics  Ультразвуковая чистящая ванна серии MBranson Ultrasonics15-336-100https://www.fishersci.com/shop/products/m-series-ultrasonic-cleaning-bath/15336100
Corning  Фибронектин, HumanFisher ScientificCB-40008https://www.fishersci.com/shop/products/corning-fibronectin-human-3/CB40008?keyword=true
DPBS, кальций, магнийGibco14040133https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133?SID=srch-srp-14040133
ECIS Cultureware Одноразовые электродные матрицы 8 x 10 ECIS Проточная матрицаПрикладная биофизика1F8x10E PChttps://www.biophysics.com/cultureware.php#1F8x10E
Enterprise Technology Solutions Шкаф для УФ-стерилизатора, WhiteEnterprise Technology Solutions50-211-1163https://www.fishersci.com/shop/products/uv-sterilizer-cabinet-white/502111163
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Gibco26140079https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26140079
Finnpipette F2 переменного объема ПипеткиThermo Scientific4642090https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4642090
Fisherbrand 50mL Easy Reader Пластиковые центрифужные пробиркиFisher Scientific06-443-21https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-higher-speed-easy-reader-plastic-centrifuge-tubes-8/p-193269
Fisherbrand  Защитные очки: Прямоугольники (#1.5)Fisher Scientific12-544-GPhttps://www.fishersci.com/shop/products/cover-glasses-rectangles-promo-22/12544GP#coverglass
Fisherbrand  Стерильные шприцы для одноразового использованияFisher Scientific14-955-458https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955458
Gibco RPMI 1640 MediumGibco11875093 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11875093
Image-iT Fixative Solution (4% формальдегида, без метанола)InvitrogenFB002https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/FB002
ImageJ FijiImageJFijihttps://imagej.net/downloads
Immersion Oil F 30 ccNikon MXA22168https://www.microscope.healthcare.nikon.
com/products/accessories/immersion-oil/specifications
Большая емкость Reach-In CO2  Инкубатор, 821 л, полированная нержавеющая стальThermo Scientific3950https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/3950
Laxco LMC-3000 серия Светлопольный составной микроскопLaxcoLMC3BF1https://www.fishersci.com/shop/products/lmc-3000-series-brightfield-compound-microscope-system-8/LMC3BF1
фитинг Masterflex, нейлон, прямой, с наружной резьбой Luer Lock для шланга Адаптеры для заусенцев, внутренний диаметр 1/16 дюйма; 25/PKMasterflexZY-45505-31https://www.masterflex.com/i/masterflex-fitting-nylon-straight-male-luer-lock-to-hose-barb-adapters-1-16-id-25-pk/4550531?PubID=ZY&persist=true&ip=no&
gclid=Cj0KCQiA3rKQBhCNARIsAC
UEW_Zb5yXy1em6bGs0a9KFOk5k
pdlkHCvAEslHumdqcnlwSN0MdR0
udmwaAuDHEALw_wcB
Microsoft ExcelMicrosoft0016https://www.microsoft.com/en-us/download/details.aspx?id=56547
National Target Цельнопластиковые одноразовые шприцыThermo Scientific03-377-24https://www.fishersci.com/shop/products/national-target-all-plastic-disposable-syringes/0337724#tab8
NCI-H441 Эпителиальные клетки легких человекаАмериканская коллекция типовых культур (ATCC)HTB-174https://www.atcc.org/products/htb-174
NE-1600 Шестиканальный программируемый шприцевой насосновой эры Насосные системыNE-1600https://www.syringepump.com/NE-16001800.php
NIS Elements ARNikonNIS Elements ARhttps://www.microscope.healthcare.nikon.
com/products/software/nis-elements/nis-elements-advanced-research
NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342)InvitrogenR37605https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37605?SID=srch-srp-R37605
Nunc Lab-Tek Камерное защитное стеклоThermo Scientific155411https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/155361
Парапленка M Упаковочная пленкаFisherScientific S37441https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/S37441
PendoTech 3-полосный запорный кран, полисульфон, мужской/ Женский вход Люэра x Женский рукав ЛуэраPendoTechZY-19406-49https://www.masterflex.com/i/pendotech-3-way-stopcock-polysulfone-male-female-luer-inlet-x-female-luer-branch/1940649
фосфатный буферизованный раствор (PBS), pH 7,4Gibco10010023https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023
поли-D-лизинGibcoA3890401https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A3890401#/A3890401
Reynolds Алюминиевая пленка ФольгаReynolds458742928317https://www.amazon.com/Reynolds-Wrap-Aluminum-Foil-Square/dp/B00UNT0Y2M
сапонинMillipore Sigma (Sigma Aldrich)47036https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/47036
SlowFade Glass Мягкая Фиксация Антивыцветание МонтантInvitrogenS36917-5X2MLhttps://www.thermofisher.com/order/catalog/product/S36917-5X2ML
Thermo Scientific серии 1300 Класс II, тип A2 Шкаф для биологической безопасности ThermoScientific13-100-752PMhttps://www.fishersci.com/shop/products/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-package-promo/p-9049003#?keyword=biosafety%20hood
Tygon Трансферная трубка, биофарм, платиновый силикон, 1/16"ID x 1/8" OD; 50-футовыйCole-ParmerEW-95702-01https://www.coleparmer.com/i/tygon-transfer-tubing-biopharm-platinum-cured-silicone-1-16-id-x-1-8-od-50-ft/9570201?searchterm=95702-01

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Matthay, M. A., et al. Acute respiratory distress syndrome. Nature Reviews Disease Primers. 5, 18(2019).
  2. Rawal, G., Yadav, S., Kumar, R. Acute respiratory distress syndrome: An update and Review. Journal of Translational Internal Medicine. 6

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Epithelial Cell MonolayerMicrofluidic Culture DeviceHuman Lung EpithelialConfocal MicroscopyPhalloidin StainingCell Layer EvaluationMicrofluidic Channel ConstructionCell Culture ConditionsActin Cytoskeleton ImagingTransepithelial Electrical Resistance

Related Articles