Method Article

Подготовка и структурная оценка монослоев эпителиальных клеток в физиологически размерном микрофлюидном культуральном устройстве

DOI:

10.3791/64148

⸱

July 1st, 2022

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, School of Science and Engineering, Tulane University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представленный протокол описывает разработку и использование метода окрашивания нитчато-актинового лактина на основе фаллоидина с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM) для визуализации структуры адгезивного клеточного слоя в микрофлюидных динамических культурных каналах и традиционных стационарных камерах статического культивирования. Этот подход помогает оценить слияние клеточного слоя, образование монослоя и однородность толщины слоя.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микрофлюидные эксперименты in vitro обладают большим потенциалом для раскрытия многих идей о микрофизиологических явлениях, происходящих при таких состояниях, как острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС) и вызванное искусственной вентиляцией легких повреждение легких (ВИЛИ). Тем не менее, исследования микрофлюидных каналов с размерами, физиологически относящимися к терминальным бронхиолам легких человека, в настоящее время сталкиваются с рядом проблем, особенно из-за трудностей в установлении соответствующих условий культивирования клеток, включая скорость потока среды, в данной среде культивирования. Представленный протокол описывает основанный на изображениях подход к оценке структуры эпителиальных клеток легких человека NCI-H441, культивируемых в кислородонепроницаемом микрофлюидном канале с размерами, физиологически соответствующими терминальным бронхиолам легкого человека. Используя филлоидное окрашивание на основе филлоидина, цитоскелетные структуры клеток выявляются с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, что позволяет визуализировать как отдельные, так и слоистые клетки. Последующая количественная оценка определяет, производят ли используемые условия культивирования клеток однородные монослои, пригодные для дальнейших экспериментов. Протокол описывает методы оценки клеточных культур и слоев в микрофлюидных каналах и традиционных средах с фиксированными лунками. Это включает в себя построение канала, культуру клеток и необходимые условия, фиксацию, пермеабилизацию и окрашивание, конфокальную микроскопическую визуализацию, обработку изображений и анализ данных.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС) - это острое состояние, возникающее в результате инсульта и распространения повреждения паренхимы легкого, что приводит к отеку альвеол легких, недостаточному газообмену и последующей гипоксемии1. Это инициирует цикл высвобождения провоспалительных цитокинов, рекрутирования нейтрофилов, высвобождения токсического медиатора и повреждения тканей, что само по себе вызывает дальнейшую воспалительную реакцию2. Кроме того, легочный сурфактант, который стабилизирует дыхательные пути и предотвращает повреждение, вызванное повторяющимся набором/дерекрутированием (R/D), может быть инактивирован или иным образом дисфункционализирован химическими процессами, происходящими во время ОРДС, что приводит к дальнейшему стрессу и повреждению окружающей паренхимы3. Если получено достаточное повреждение, может потребоваться искусственная вентиляция легких для обеспечения адекватной системной оксигенации4. Однако искусственная вентиляция легких сопряжена с определенными проблемами и травмами, включая возможность поражения легких, вызванного искусственной вентиляцией легких (ВПЗ), характеризуемого как повреждение паренхимы легких, вызванное механическими нагрузками, возникающими при чрезмерном надувании (волютравма) и/или НИР границы раздела воздух-жидкость в окклюзированных жидкостью дыхательных путях (ателетравма)5. Градиент давления, испытываемый эпителиальными клетками, подвергшимися воздействию границы раздела воздух-жидкость (как в бронхиоле, окклюзированной жидкостью) в модели ателетравмы, может привести к обструктивному ответу, вызванному проницаемостью (POOR), что приводит к добродетельному циклу травмы 6,7,8.

Эксперименты in vitro могут дать представление об этих явлениях в микромасштабе, но текущие исследования в средах микрофлюидных каналов с физиологически значимыми размерами сталкиваются с несколькими проблемами9. Во-первых, оптимизация условий культивирования клеток представляет собой значительный барьер для входа в исследования клеточных культур в микрофлюидных средах, поскольку существует узкое пересечение, в пределах которого параметры потока среды, продолжительность культивирования и другие условия культивирования позволяют оптимально формировать клеточный слой. Это включает в себя ограничения диффузии, налагаемые непроницаемой для кислорода природой оболочки микрофлюидного культурального канала. Это требует тщательного рассмотрения параметров потока среды, так как низкие скорости потока могут лишить клетки кислорода, особенно те, которые находятся дальше всего от входного отверстия; С другой стороны, высокая скорость потока может вытолкнуть клетки из культурального канала или привести к неправильному или неравномерному развитию слоя. Ограничения диффузии могут быть устранены путем использования кислородопроницаемых материалов, таких как полидиметилсилоксан (ПДМС), в аппарате для культивирования раздела воздух-жидкость (ALI); однако многие традиционные каналы микрофлюидных культур, такие как каналы электрического датчика импеданса клетка-субстрат (ECIS), по своей природе непроницаемы для кислорода, учитывая природу изготовленного корпуса10. Этот протокол направлен на то, чтобы предоставить метод анализа клеточных слоев, культивируемых в непроницаемом для кислорода корпусе.

При сравнении жизнеспособности условий культивирования необходимы наблюдения за конкретными характеристиками слоя, такими как наличие монослоя, топология поверхности, слияние и однородность толщины слоя, чтобы определить, соответствует ли клеточный слой, полученный определенным набором условий культивирования, желаемым спецификациям и действительно ли они имеют отношение к экспериментальному дизайну. Ограниченная оценка может быть выполнена с помощью таких методов, как ECIS, в которых используются измерения электрического потенциала (напряжения), создаваемого сопротивлением высокочастотному переменному току (AC) (импедансу), налагаемому электрически изолирующими мембранами клеток, культивируемых на золотых электродах в массиве потока. Модулируя частоту переменного тока, приложенного к клеткам, можно нацелить и исследовать специфические частотно-зависимые клеточные свойства клеток и клеточных слоев, такие как прочность поверхностной адгезии, образование плотного соединения и пролиферация или слияние клеток11. Однако эти косвенные формы измерений довольно трудно интерпретировать в начале эксперимента, и они могут не дать количественной оценки всем соответствующим аспектам клеточного слоя. Простое наблюдение за клеточным слоем под фазово-контрастным микроскопом может выявить природу определенных качеств, таких как слияние; однако многие важные характеристики, такие как наличие монослоя и однородность толщины слоя, требуют трехмерной (3D) оценки, которая невозможна при светлом поле, фазовом контрасте или флуоресцентной микроскопической визуализации12.

Цель этого исследования состояла в том, чтобы разработать метод окрашивания нитевидного актина, позволяющий проводить верификацию монослоя на основе визуализации и оценку однородности клеточного слоя с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM). Филаментозный актин (F-актин) считался подходящей мишенью для флуорофорного конъюгата, отчасти из-за того, что F-актин плотно следует за клеточной мембраной, что позволяет визуально приблизить весь объемклетки 13. Еще одним важным преимуществом нацеливания на F-актин является способ, которым окрашивание F-актина визуально выясняет цитоскелетные нарушения или изменения, вызванные стрессами и деформациями, испытываемыми клетками. Сшивание фиксации с формальдегидом, не содержащим метанола, использовалось для сохранения морфологии клеток и клеточного слоя, поскольку дегидратирующие фиксаторы, такие как метанол, имеют тенденцию к сплющиванию клеток, грубо искажая клеточный слой и изменяя его свойства14,15.

Чтобы определить способность метода оценки слоя смягчить эти проблемы, клетки культивировали в традиционных восьмилуночных культуральных камерах, а также в микрофлюидных каналах для оценки различий, если таковые имеются, в клеточных слоях, которые были получены. Для стационарных культуральных колодцев использовались восьмилуночные камерные стеклопакеты. Для микрофлюидного культивирования проточные массивы (длина канала 50 мм, ширина 5 мм, глубина 0,6 мм) были оптимизированы для культивирования иммортализированных эпителиальных клеток легких человека (NCI-H441) в среде с размерами, физиологически соответствующими терминальным бронхиолам, присутствующим в дыхательной зоне легкогочеловека 16. Хотя этот протокол был разработан с учетом среды культивирования массивов потока ECIS, он может применяться к любой непроницаемой для кислорода среде динамического культивирования, для которой необходима оценка характеристик культивируемого клеточного слоя или условий культивирования.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для настоящего исследования была использована линия эпителиальных клеток легких человека NCI-H441 (см. Таблицу материалов).

1. Культура клеток в микрофлюидном канале

  1. Изготовьте микрофлюидный канал и выполните предварительную обработку, выполнив следующие действия.
    1. Получите одноканальный массив потока (см. Таблицу материалов) и отделите верхнюю часть от опорной плиты из поликарбоната.
    2. Получите прямоугольное покровное стекло #1.5 (толщина 0.17 мм) с размерами 60 мм x 22 мм. Очистите поверхности покровного стекла в ультразвуковой ванне и обработайте одну сторону раствором поли-D-лизина 0,1 мг / мл при комнатной температуре в течение 5 минут перед сушкой при 60 ° C в течение 30 минут.
    3. Прикрепите двусторонний клей толщиной 0,13 мм (см. Таблицу материалов), вырезанный лазером в соответствии с размерами верхней части массива потока и канала потока (длина 50 мм, ширина 5 мм), к верхней части массива потока, стараясь точно выровнять вырезыканала 17.
    4. Прикрепите к клейкой ленте майларовую прокладку толщиной 0,1 мм (см. Таблицу материалов), вырезанную лазером в соответствии с размерами верхней части проточной решетки и проточного канала, стараясь точно выровнять вырезы каналов.
    5. Повторяйте шаги 1.1.3 и 1.1.4 до тех пор, пока не будет достигнута желаемая высота канала (например, для канала высотой 0,6 мм используйте две прокладки и три клейкие полоски).
    6. Прикрепите прямоугольное покровное стекло к самой нижней клейкой полосе стороной, обработанной поли-D-лизином, обращенной к клею. После завершения сборки, как показано на рисунке 1, приложите сильное и равномерное давление к верхней и нижней части конструкции и удерживайте в течение 1 минуты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Строительство корпуса канала, включая покровное стекло, клеи, прокладки и верхнюю часть массива потока, в настоящее время завершено.
    7. Промойте канал деионизированной водой с помощью шприца, попутно проверяя наличие утечек.
    8. Стерилизуйте корпус канала в ультрафиолетовом (УФ) стерилизаторе в течение 30 мин18.
    9. Используя стерильную технику, обработайте канал 2,0 мкг/мл человеческого фибронектина (см. Таблицу материалов) в фосфатном буферном физиологическом растворе (PBS) и инкубируйте не менее 30 мин при 37 °C19.
  2. Проведите культивирование клеток в микрофлюидном канале, выполнив следующие действия.
    1. В стерильном вытяжном шкафу с ламинарным потоком используйте микропипетку для переноса равномерной суспензии клеток NCI-H441 в среду RPMI 1640 с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) (см. Таблицу материалов) для посева двух микрофлюидных каналов, каждый с клетками с поверхностной плотностью 150 000 клеток / см2.
      1. Для каналов 50 мм x 5 мм x 0,6 мм используйте 0,25 мл суспензии 2,5 x 106 ячеек/мл для заполнения каждого канала, а также части портов. Убедитесь, что клетки равномерно распределены в каналах с помощью светлопольного микроскопа.
    2. Культивируют два канала в течение 24 ч и 48 ч соответственно при 37 °C с 5% CO2 с помощью программируемого шприцевого насоса (см. Таблицу материалов), вытягивая отработанные среды из канала и свежие среды в канал из резервуара стерильной среды, прикрепленного к входному отверстию канала, состоящего из разрезанного шприца объемом 20 мл, покрытого парафиновой пленкой.
      1. После 10-минутного периода ожидания после посева клеток вводят и перекачивают свежую среду из резервуара через канал с переменной скоростью потока, начиная с 0,2 мкл / мин и увеличивая до 10 мкл / мин в течение 4 часов, поддерживая эту скорость после20.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Эта переменная скорость потока обеспечивает условия культивирования, которые позволяют клеткам (1) гравитационно оседать на поверхность культуры, (2) прилипать к поверхности культуры и (3) образовывать сливающийся монослой.
  3. Выполняют фиксацию клеток внутри микрофлюидных каналов с помощью раствора формальдегида.
    ВНИМАНИЕ: Формальдегид токсичен и должен обрабатываться в соответствующем химическом вытяжном шкафу21.
    1. В химическом вытяжном шкафу приготовьте растворы формальдегида, используя 4% формальдегида в PBS (без метанола) (см. Таблицу материалов), чтобы создать две порции по 4 мл, разбавляя первую до концентрации 1% формальдегида, а вторую до 2% формальдегида с использованием фосфатного буферного физиологического раствора Дульбекко (DPBS; с Ca2+ и Mg2 +) в качестве разбавителя. Перелейте растворы формальдегида в отдельные шприцы объемом 5 мл и наклейте соответствующую этикетку. Наберите 20 мл DPBS в отдельный шприц объемом 20 мл.
    2. Удалите микрофлюидные каналы из культивального аппарата и поместите их в химический вытяжной шкаф.
    3. Соберите аппарат фиксации и окрашивания.
      1. Прикрепите 10-сантиметровый сегмент передаточной трубки к боковому отверстию трехходового запорного крана с помощью наружного замка Luer к адаптеру зазубрины шланга (см. Таблицу материалов), затем подсоедините запорный кран к входному отверстию проточной решетки.
      2. Затем прикрепите еще один 10-сантиметровый сегмент передаточной трубки к выходному отверстию массива потока, используя адаптер для шланга того же типа.
      3. Наконец, закрепите свободные концы обеих передаточных пробирок в контейнере для отходов, соответствующих химическим веществам и биологическим опасностям, например, в пустой конической центрифужной пробирке объемом 50 мл с маркировкой.
    4. Поверните запорный кран, чтобы перекрыть входное отверстие массива потока, и промойте сливную линию с помощью DPBS. Затем поверните запорный кран, чтобы перекрыть линию слива, и медленно промойте клетки 2 мл DPBS. Повторяйте этап промывки, используя новый раствор каждый раз. В канал вводится новый раствор (или концентрация раствора).
    5. Медленно протолкните 2 мл 1% фиксирующего раствора через канал, а затем оставьте на 5 мин22.
    6. Медленно протолкните 2 мл 2% фиксирующего раствора через канал, а затем оставьте на 15 минут.
    7. Промойте клетки, медленно вводя 2 мл свежего DPBS в канал в трех отдельных случаях (по 5 минут каждый).
    8. Выполните шаги 1.3.3-1.3.7 для обоих микрофлюидных каналов параллельно.
  4. Окрашивают, проникают и добавляют монтажную среду к клеткам в микрофлюидном канале.
    1. Приготовьте 0,1% раствор сапонина, добавив 1 мг сапонина (см. Таблицу материалов) на мл DPBS для получения 4 мл раствора и осторожно перемешайте23. Наберите 8 мл DPBS в шприц объемом 20 мл.
    2. Добавьте реагент фаллоидина, окрашивающий F-актин, и реагент Хёхста, окрашивающий ядра (см. Таблицу материалов) в 0,1% раствор сапонина по две капли (0,1 мл) каждого реагента на мл раствора сапонина. Храните приготовленный раствор для окрашивания / проникновения вдали от света, накрыв алюминиевой фольгой24.
    3. Промойте линию небольшим количеством окрашивающего/пермеабилизирующего раствора (как описано на шаге 1.3.4), затем введите 2 мл раствора в микрофлюидный канал и накройте канал алюминиевой фольгой, прежде чем дать ему постоять при комнатной температуре в течение 30 минут.
    4. Дважды смойте окрашивающий/проникающий раствор 2 мл DPBS в течение 5 минут на промывку.
    5. Для лучшего качества изображения добавьте в канал подходящий монтажный носитель (с показателем преломления, точно совпадающим с маслом объектива микроскопа и покровным стеклом, см. Таблицу материалов).
      1. Используя микропипетку, вводите минимальное количество мягкого антизатухающего крепления в каждый порт микрофлюидного канала, гарантируя, что нижняя поверхность полностью покрыта и пузырьки не задерживаются в желаемой области25 изображения. Запечатайте концы канала и проверьте целостность клеточного слоя, наблюдая под микроскопом светлого поля.
    6. Выполните шаги 1.4.3-1.4.5 для обоих микрофлюидных каналов параллельно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ячейки изображения как можно скорее после окрашивания для максимального качества изображения. Если происходит фотообесцвечивание или требуется длительное хранение, можно использовать другие монтажные материалы с антибактериальными или сохранными свойствами. Обратите внимание, что жестко отверждаемые монтажные материалы будут искажать 3D-структуру ячеек и, соответственно, слой ячейки; По этой причине предпочтительнее использовать монтажные носители с плавной настройкой26.
  5. Сфотографируйте клетки в микрофлюидном канале, выполнив следующие действия.
    1. Отрегулируйте настройки конфокального микроскопа (см. Таблицу материалов), включая мощность лазера, усиление, смещение и параметры сканирования, такие как скорость сканирования, область сканирования, формат сканирования, разрешение и диаметр отверстия27.
    2. Проверяйте местоположение изображения, выполняя эталонные сканы, а также Z-стеки до тех пор, пока не будут достигнуты желаемые параметры и условия изображения. Параметры подключения на последовательно увеличенных объективах до тех пор, пока не будет достигнут и оптимизирован 40-кратный масляный иммерсионный объектив28.
    3. Используя опорную пластину массива потока в качестве эталона, построите Z-стеки в пяти местах: в предполагаемом месте расположения первого электрода на входе, на полпути между центром и предыдущим местоположением, в центре, на полпути между центром и расположением последнего электрода (на выходной стороне) и на последнем электроде, как показано на рисунке 2.
  6. Выполняйте обработку изображений и анализ данных.
    1. Экспортируйте поперечные сечения XZ и YZ с помощью программного пакета конфокального микроскопа (см. Таблицу материалов).
    2. Используя программное обеспечение для обработки изображений (см. Таблицу материалов) с возможностями обнаружения краев (пороговое значение 15,0), измерьте общую площадь изображения в пикселях с помощью инструмента «Волшебная палочка» за пределами изображения, а затем площадь, исключающую общую площадь поперечного сечения слоя ячейки в пикселях, с помощью инструмента «Волшебная палочка» в части изображения, выходящей за слойячейки 29.
    3. Используя программное обеспечение для обработки данных (см. Таблицу материалов), вычтите значение пикселя внешней площади из значения пикселя общей площади, чтобы найти значение пикселя площади поперечного сечения.
    4. Преобразуйте значения площади поперечного сечения в значения мкм2 , умножив значения пикселей на квадрат значения мкм/пиксель, как указано в программном обеспечении микроскопа для конкретного изображения (0,31 мкм/пиксель для Z-стеков, снятых с разрешением 1024p без зума на 40-кратном масляном иммерсионном объективе).
    5. Вычисление средних значений и стандартных отклонений данных и результатов графиков.

figure-protocol-1
Рисунок 1: Схема конструкции микрофлюидного канала в разобранном виде. Верхний элемент представляет собой верхнюю часть массива потока, тонкие серые элементы представляют собой клейкие полосы, тонкие синие элементы представляют собой майларовые прокладки, а нижний элемент представляет собой прямоугольное покровное стекло. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-protocol-2
Рисунок 2: Пять мест визуализации вдоль последовательно продуцирующей слой области микрофлюидного культурного канала. Места визуализации следующие: на входе, рядом с тем местом, где будет находиться первый электрод на неповрежденной матрице потока; на полпути между входом и центром канала; центр канала; На полпути между центром и расположением на выходе и на выходе, рядом с тем местом, где последний электрод будет находиться на неповрежденной матрице потока. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

2. Культура клеток в восьмикамерном покровном стекле

  1. Проведите предварительную обработку восьмикамерного покровного стекла.
    1. Получите стерильное восьмикамерное покровное стекло, изготовленное с покрытием #1.5 и обработкой поверхности, повышающей адгезию клеток (рис. 3, см. Таблицу материалов).
    2. Используя стерильную технику, обработайте поверхность культуральных лунок 2,0 мкг/мл человеческого фибронектина в PBS и инкубируйте не менее 30 мин при 37 °C19.
  2. Проведите культивирование клеток в камерном покровном стекле, выполнив следующие действия.
    1. В стерильном ламинарном колпаке перенесите 0,5 мл порции растворов клеток NCI-H441, равномерно суспендированных в среде RPMI 1640, с 10% FBS при объемной плотности 81 000, 162 000 и 324 000 клеток/мл в посевные лунки с поверхностной плотностью 45 000, 90 000 и 180 000 клеток/см2 соответственно. Убедитесь, что клетки были равномерно распределены в лунках, используя микроскоп светлого поля.
    2. Культивирование клеток в течение 24 ч, 48 ч и 96 ч при 37 ° C с 5% CO2 с ежедневной заменой среды.
  3. Выполните фиксацию формальдегида в восьмикамерном покровном стекле.
    ВНИМАНИЕ: Формальдегид токсичен и должен обрабатываться в соответствующем химическом вытяжном шкафу21.
    1. В химическом вытяжном шкафу приготовьте растворы формальдегида, сделав две порции 4% формальдегида в PBS (без метанола), разбавив первую до концентрации 1% формальдегида, а другую до 2% формальдегида с использованием фосфатного буферного физиологического раствора Дульбекко (DPBS; с Ca2+ и Mg2 +) в качестве разбавителя.
    2. Извлеките из инкубатора восьмилуночный камерный покровный стакан и поместите его в химический вытяжной шкаф.
    3. Аккуратно промойте клетки 0,5 мл DPBS с помощью микропипетки, медленно вводя жидкость вдоль верхней части угла каждой лунки.
    4. Удалите имеющуюся жидкость в каждой лунке, медленно извлекая ее из угла лунки с помощью микропипетки. Методом введения жидкости (этап 2.3.3) в каждую лунку вводят по 0,5 мл 1% фиксирующего раствора и дают ему постоять 5 мин22.
    5. Удалите существующую жидкость в каждой скважине, используя метод извлечения жидкости, упомянутый в шаге 2.3.4. Используя метод введения жидкости, упомянутый в шаге 2.3.3, введите 0,5 мл 2% фиксирующего раствора в каждую лунку и оставьте на 15 минут.
    6. Используя методы введения и экстракции жидкости (этапы 2.3.3 и 2.3.4), промывают ячейки, вводя и удаляя 0,5 мл свежего DPBS в каждую лунку в трех отдельных случаях в течение 5 мин каждый.
  4. Выполните окрашивание, пермеабилизацию и добавление монтажных сред в восьмикамерное покрытие.
    1. Приготовьте 0,1% раствор сапонина, добавив 1 мг сапонина на мл DPBS, и осторожно перемешайте23.
    2. К 0,1% раствору сапонина добавляют по две капли (0,1 мл) реагента фаллоидина, окрашивающего F-актин, и реагента Хёхста, окрашивающего ядро, на мл раствора сапонина. Храните приготовленный раствор подальше от света, накрыв алюминиевой фольгой24.
    3. Введите 0,2 мл окрашивающего/пермеабилизирующего раствора в каждую лунку и накройте камерное покровное стекло алюминиевой фольгой, прежде чем дать ему постоять при комнатной температуре в течение 30 минут.
    4. Дважды смойте окрашивающий/проникающий раствор 0,5 мл DPBS.
    5. Для лучшего качества изображения добавьте в лунки подходящую монтажную среду (с показателем преломления, точно совпадающим с маслом объектива микроскопа и покровным стеклом).
      1. Используя микропипетку, введите минимальное количество мягкого антивыцветающего крепления в каждую лунку, гарантируя, что нижняя поверхность полностью покрыта и пузырьки не задерживаются в желаемой области25 изображения. Проверьте целостность клеточного слоя, наблюдая под микроскопом светлого поля.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Ячейки изображения как можно скорее после окрашивания для максимального качества изображения. Если происходит фотообесцвечивание или требуется длительное хранение, можно использовать другие монтажные материалы с антибактериальными или сохранными свойствами. Обратите внимание, что жестко отверждаемый монтажный носитель будет искажать 3D-структуру ячеек и, соответственно, слой ячейки, поэтому предпочтительнее использовать монтажные носители с мягкой настройкой26.
  5. Выполняйте визуализацию в восьмикамерном покровном стекле.
    1. Отрегулируйте настройки конфокального микроскопа, включая мощность лазера, усиление, смещение и параметры сканирования, такие как скорость сканирования, область сканирования, формат сканирования, разрешение и диаметр отверстия27.
    2. Проверяйте местоположение изображения, выполняя эталонные сканы, а также Z-стеки до тех пор, пока не будут достигнуты желаемые параметры и условия изображения. Параметры подключения на последовательно увеличенных объективах до тех пор, пока не будет достигнут и оптимизирован 40-кратный масляный иммерсионный объектив28.
    3. Постройте Z-стеки из трех случайных мест в каждом совпадении плотности посева / продолжительности культуры.
  6. Выполняйте обработку изображений и анализ данных.
    1. Экспортируйте поперечные сечения XZ и YZ с помощью программного пакета конфокального микроскопа.
    2. Используя программное обеспечение для обработки изображений с возможностями обнаружения краев (пороговое значение 15,0), измерьте общую площадь изображения в пикселях с помощью инструмента «Волшебная палочка» за пределами изображения, а затем область, исключающую общую площадь поперечного сечения слоя ячейки в пикселях, с помощью инструмента «Волшебная палочка» в части изображения, выходящей за пределы слояячейки 29.
    3. Используя программное обеспечение для обработки данных, вычтите значение пикселя внешней области из значения пикселя общей площади, чтобы найти значение пикселя площади поперечного сечения.
    4. Преобразуйте значения площади поперечного сечения в значения мкм2 , умножив значения пикселей на квадрат значения мкм/пиксель, как указано в программном обеспечении микроскопа для конкретного изображения (0,31 мкм/пиксель для Z-стеков, снятых с разрешением 1024p без зума на 40-кратном масляном объективе).
    5. Вычисляйте средние значения и стандартные отклонения, а также результаты графиков.

figure-protocol-3
Рисунок 3: Диаграмма восьмилуночного покровного стекла, используемого для эксперимента по культивированию, окрашиванию и визуализации с фиксированной лункой, сравнивающая влияние начальной плотности посева клеток и продолжительности культивирования на формирование клеточных слоев. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представленный способ позволяет визуализировать слои эпителиальных клеток, культивируемых в каналах микрофлюидных культур, и использует демонстрацию в традиционных средах культивирования клеток с фиксированной лункой в качестве валидации. Полученные изображения будут существовать в спектре качества, интенсивности сигнала и специфичности клеточной цели. Успешные изображения будут демонстрировать высокую контрастность, что позволит анализировать изображения и количественно оценивать данные для последующей статистической оц...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В представленном протоколе описаны культивирование, сшивание, фиксация, окрашивание, пермеабилизация и конфокальная микроскопическая визуализация эпителиальных клеток легких человека NCI-H441 в динамической среде одноканального микрофлюидного проточного массива, а также в статической среде традиционного восьмилуночнокамерного покровного стекла. При любом протоколе микрофлюидного культивирования клеток условия потока среды для культивирования клеток имеют первостепенное значение, поскольку высокоскоростной поток может вым...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы выражают благодарность Алану Шепардсону за разработку схемы резки клея 3M и майларового листа, используемых в конструкции микрофлюидных каналов, а также за тестирование скорости потока среды для культивирования клеток и программирование шприцевого насоса. Финансирование было предоставлено NIH R01 HL0142702, NSF CBET 1706801 и грантом декана колледжа Ньюкомб-Тулейн.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Система конфокальных микроскопов A1R HD25NikonA1R HD25https://www.microscope.healthcare.nikon.
com/products/confocal-microscopes/a1hd25-a1rhd25/specifications
ActinGreen 488 ReadyProbes Реагент (AlexaFluor 488 фаллоидин)InvitrogenR37110
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37110 клейкая лента для переноса с двойным подкладкой3M468 МПhttps://gizmodorks.com/3m-468mp-adhesive-transfer-tape-sheet-5-pack/
Air-Tite  HSW Soft-Ject Одноразовые шприцыAir-Tite RL514-817-53https://www.fishersci.com/shop/products/air-tite-hsw-soft-ject-disposable-syringes-6/1481753#?keyword=syringe%20leur%20locking%205ml
BAISDY 4 мил (0,1 мм) Толстый майларовый листBAISDYAS022https://www.amazon.ca/Stencil-Perfect-Silhouette-Machines-BAISDY/dp/B07RJJ9BNC
Branson Ultrasonics  Ультразвуковая чистящая ванна серии MBranson Ultrasonics15-336-100https://www.fishersci.com/shop/products/m-series-ultrasonic-cleaning-bath/15336100
Corning  Фибронектин, HumanFisher ScientificCB-40008https://www.fishersci.com/shop/products/corning-fibronectin-human-3/CB40008?keyword=true
DPBS, кальций, магнийGibco14040133https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133?SID=srch-srp-14040133
ECIS Cultureware Одноразовые электродные матрицы 8 x 10 ECIS Проточная матрицаПрикладная биофизика1F8x10E PChttps://www.biophysics.com/cultureware.php#1F8x10E
Enterprise Technology Solutions Шкаф для УФ-стерилизатора, WhiteEnterprise Technology Solutions50-211-1163https://www.fishersci.com/shop/products/uv-sterilizer-cabinet-white/502111163
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Gibco26140079https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26140079
Finnpipette F2 переменного объема ПипеткиThermo Scientific4642090https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4642090
Fisherbrand 50mL Easy Reader Пластиковые центрифужные пробиркиFisher Scientific06-443-21https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-higher-speed-easy-reader-plastic-centrifuge-tubes-8/p-193269
Fisherbrand  Защитные очки: Прямоугольники (#1.5)Fisher Scientific12-544-GPhttps://www.fishersci.com/shop/products/cover-glasses-rectangles-promo-22/12544GP#coverglass
Fisherbrand  Стерильные шприцы для одноразового использованияFisher Scientific14-955-458https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955458
Gibco RPMI 1640 MediumGibco11875093 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11875093
Image-iT Fixative Solution (4% формальдегида, без метанола)InvitrogenFB002https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/FB002
ImageJ FijiImageJFijihttps://imagej.net/downloads
Immersion Oil F 30 ccNikon MXA22168https://www.microscope.healthcare.nikon.
com/products/accessories/immersion-oil/specifications
Большая емкость Reach-In CO2  Инкубатор, 821 л, полированная нержавеющая стальThermo Scientific3950https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/3950
Laxco LMC-3000 серия Светлопольный составной микроскопLaxcoLMC3BF1https://www.fishersci.com/shop/products/lmc-3000-series-brightfield-compound-microscope-system-8/LMC3BF1
фитинг Masterflex, нейлон, прямой, с наружной резьбой Luer Lock для шланга Адаптеры для заусенцев, внутренний диаметр 1/16 дюйма; 25/PKMasterflexZY-45505-31https://www.masterflex.com/i/masterflex-fitting-nylon-straight-male-luer-lock-to-hose-barb-adapters-1-16-id-25-pk/4550531?PubID=ZY&persist=true&ip=no&
gclid=Cj0KCQiA3rKQBhCNARIsAC
UEW_Zb5yXy1em6bGs0a9KFOk5k
pdlkHCvAEslHumdqcnlwSN0MdR0
udmwaAuDHEALw_wcB
Microsoft ExcelMicrosoft0016https://www.microsoft.com/en-us/download/details.aspx?id=56547
National Target Цельнопластиковые одноразовые шприцыThermo Scientific03-377-24https://www.fishersci.com/shop/products/national-target-all-plastic-disposable-syringes/0337724#tab8
NCI-H441 Эпителиальные клетки легких человекаАмериканская коллекция типовых культур (ATCC)HTB-174https://www.atcc.org/products/htb-174
NE-1600 Шестиканальный программируемый шприцевой насосновой эры Насосные системыNE-1600https://www.syringepump.com/NE-16001800.php
NIS Elements ARNikonNIS Elements ARhttps://www.microscope.healthcare.nikon.
com/products/software/nis-elements/nis-elements-advanced-research
NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342)InvitrogenR37605https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37605?SID=srch-srp-R37605
Nunc Lab-Tek Камерное защитное стеклоThermo Scientific155411https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/155361
Парапленка M Упаковочная пленкаFisherScientific S37441https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/S37441
PendoTech 3-полосный запорный кран, полисульфон, мужской/ Женский вход Люэра x Женский рукав ЛуэраPendoTechZY-19406-49https://www.masterflex.com/i/pendotech-3-way-stopcock-polysulfone-male-female-luer-inlet-x-female-luer-branch/1940649
фосфатный буферизованный раствор (PBS), pH 7,4Gibco10010023https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023
поли-D-лизинGibcoA3890401https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A3890401#/A3890401
Reynolds Алюминиевая пленка ФольгаReynolds458742928317https://www.amazon.com/Reynolds-Wrap-Aluminum-Foil-Square/dp/B00UNT0Y2M
сапонинMillipore Sigma (Sigma Aldrich)47036https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/47036
SlowFade Glass Мягкая Фиксация Антивыцветание МонтантInvitrogenS36917-5X2MLhttps://www.thermofisher.com/order/catalog/product/S36917-5X2ML
Thermo Scientific серии 1300 Класс II, тип A2 Шкаф для биологической безопасности ThermoScientific13-100-752PMhttps://www.fishersci.com/shop/products/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-package-promo/p-9049003#?keyword=biosafety%20hood
Tygon Трансферная трубка, биофарм, платиновый силикон, 1/16"ID x 1/8" OD; 50-футовыйCole-ParmerEW-95702-01https://www.coleparmer.com/i/tygon-transfer-tubing-biopharm-platinum-cured-silicone-1-16-id-x-1-8-od-50-ft/9570201?searchterm=95702-01

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Matthay, M. A., et al. Acute respiratory distress syndrome. Nature Reviews Disease Primers. 5, 18(2019).
  2. Rawal, G., Yadav, S., Kumar, R. Acute respiratory distress syndrome: An update and Review. Journal of Translational Internal Medicine. 6 (2), 74-77 (2018).
  3. Bilek, A. M., Dee, K. C., Gaver, D. P. Mechanisms of surface-tension-induced epithelial cell damage in a model of pulmonary airway reopening. Journal of Applied Physiology. 94 (2), 770-783 (2003).
  4. Modrykamien, A. M., Gupta, P. The acute respiratory distress syndrome. Baylor University Medical Center Proceedings. 28 (2), 163-171 (2017).
  5. Jacob, A. -M., Gaver, D. P. Atelectrauma disrupts pulmonary epithelial barrier integrity and alters the distribution of tight junction proteins ZO-1 and Claudin 4. Journal of Applied Physiology. 113 (9), 1377-1387 (2012).
  6. Kay, S. S., Bilek, A. M., Dee, K. C., Gaver, D. P. Pressure gradient, not exposure duration, determines the extent of epithelial cell damage in a model of pulmonary airway reopening. Journal of Applied Physiology. 97 (1), 269-276 (2004).
  7. Jacob, A. M., Gaver, D. P. An investigation of the influence of cell topography on epithelial mechanical stresses during pulmonary airway reopening. Physics of Fluids. 17 (3), 031502(1994).
  8. Gaver, D. P., et al. The POOR get POORer: A hypothesis for the pathogenesis of ventilator-induced lung injury. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 202 (8), 1081-1087 (2020).
  9. Jain, P., et al. Reconstruction of ultra-thin alveolar-capillary basement membrane mimics. Advanced Biology. 5 (8), 2000427(2021).
  10. Byrne, M. B., Leslie, M. T., Gaskins, H. R., Kenis, P. J. A. Methods to study the tumor microenvironment under controlled oxygen conditions. Trends in Biotechnology. 32 (11), 556-563 (2014).
  11. Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. Journal of Visualized Experiments. (85), e51300(2014).
  12. Jaccard, N., et al. Automated method for the rapid and precise estimation of adherent cell culture characteristics from phase contrast microscopy images. Biotechnology and Bioengineering. 111 (3), 504-517 (2013).
  13. Hagiyama, M., et al. Modest static pressure suppresses columnar epithelial cell growth in association with cell shape and cytoskeletal modifications. Frontiers in Physiology. 8, 00997(2017).
  14. Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of Nucleic Acids. The American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).
  15. Zhu, L., Rajendram, M., Huang, K. C. Effects of fixation on bacterial cellular dimensions and integrity. Iscience. 24 (4), 102348(2021).
  16. Lust, R. M. The Pulmonary System. XPharm: The Comprehensive Pharmacology Reference. , Elsevier. 1-6 (2007).
  17. EpilogueLaser. FusionSeries: Pro & Edge Laser System Manual and Original Instructions. EpilogueLaser. , Golden, CO: Author. (2022).
  18. Chitnis, D. S., Katara, G., Hemvani, N., Chitnis, S., Chitnis, V. Surface disinfection by exposure to germicidal UV light. Indian Journal of Medical Microbiology. 26 (3), 241(2008).
  19. Sandell, L., Sakai, D. Mammalian cell culture. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 5 (1), 4(2011).
  20. New Era Pump Systems. Multi-Phaser Programmable Syringe Pump: NE-1000 Series User Manual. New Era Pump Systems. , Farmingdale, NY. (2014).
  21. Thermo Fisher Scientific. Safety Data Sheet: Image-iT Fixative Solution (4% formaldehyde, methanol-free). Thermo Fisher Scientific. , Waltham, MA. (2018).
  22. Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Rao, U. K., Ranganathan, K., Elizabeth, J. Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).
  23. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Immunocytochemical Methods and Protocols. 588, 63-66 (2009).
  24. Thermo Fisher Scientific. ActinGreen 488 ReadyProbes Reagent Protocol. Thermo Fisher Scientific. , Walther, MA. (2022).
  25. Slowfade Glass soft-set Antifade Mountant. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/S36917-5X2ML?SID=srch-hj-S36917-5X2ML (2022).
  26. Ravikumar, S., Surekha, R., Thavarajah, R. Mounting media: An overview. Journal of Dr. NTR University of Health Sciences. 3 (5), 1-8 (2014).
  27. Shihan, M. H., Novo, S. G., Le Marchand, S. J., Wang, Y., Duncan, M. K. A simple method for quantitating confocal fluorescent images. Biochemistry and Biophysics Reports. 25, 100916(2021).
  28. North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
  29. Ferriera, F., Rasband, W. ImageJ User Guide. National Institutes of Health. , Bethesda, MD. (2012).
  30. Halldorsson, S., Lucumi, E., Gómez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).
  31. Smith, H. S., Riggs, J. L., Mosesson, M. W. Production of fibronectin by human epithelial cells in culture. American Association for Cancer Research. 39 (10), 4138-4144 (1979).
  32. Sieck, G. C., Mantilla, C. B., Prakash, Y. S. Volume measurements in confocal microscopy. Methods in Enzymology. 307, Academic Press. 296-315 (1999).
  33. Heijink, I. H., et al. Characterisation of cell adhesion in airway epithelial cell types using electric cell-substrate impedance sensing. European Respiratory Journal. 35 (4), 894-903 (2009).
  34. Zhang, X., Wang, W., Li, F., Voiculescu, I. Stretchable impedance sensor for mammalian cell proliferation measurements. Lab on a Chip. 17 (12), 2054-2066 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Epithelial Cell MonolayerMicrofluidic Culture DeviceHuman Lung EpithelialConfocal MicroscopyPhalloidin StainingCell Layer EvaluationMicrofluidic Channel ConstructionCell Culture ConditionsActin Cytoskeleton ImagingTransepithelial Electrical Resistance

Related Articles