Цыпленок является экономически эффективным, доступным и широко доступным модельным организмом для различных исследований. Здесь подробно описан ряд протоколов, чтобы понять молекулярные механизмы, лежащие в основе развития и регенерации внутреннего уха птиц.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
В методах Ovo и Ex Ovo для изучения развития внутреннего уха птиц
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Внутреннее ухо воспринимает звук и поддерживает равновесие с помощью улитки и преддверия. Он делает это, используя специальный тип механосенсорных клеток, известный как волосковая клетка. Фундаментальные исследования во внутреннем ухе привели к глубокому пониманию того, как функционируют волосковые клетки, и как дисрегуляция может привести к потере слуха и головокружению. Для этого исследования мышь была выдающейся модельной системой. Однако мыши, как и все млекопитающие, утратили способность заменять волосковые клетки. Таким образом, при попытке понять клеточную терапию для восстановления функции внутреннего уха, дополнительные исследования на других видах позвоночных могут дать дальнейшее понимание. Слуховой эпителий птиц, базилярный сосочек (АД), представляет собой лист эпителия, состоящий из механосенсорных волосковых клеток (ГК), интеркалированных поддерживающими клетками (СК). Хотя анатомическая архитектура базилярного сосочки и улитки млекопитающих отличается, молекулярные механизмы развития внутреннего уха и слуха схожи. Это делает базилярный сосочек полезной системой не только для сравнительных исследований, но и для понимания регенерации. Здесь мы описываем методы рассечения и манипуляции для внутреннего уха курицы. Методика показывает генетические методы и методы ингибирования малых молекул, которые предлагают мощный инструмент для изучения молекулярных механизмов развития внутреннего уха. В этой статье мы обсуждаем методы электропорации ovo для генетического возмущения базилярного сосочка с использованием делеций CRIPSR-Cas9 с последующим рассечением базилярного сосочки. Мы также демонстрируем культуру органов АД и оптимальное использование культуральных матриц, чтобы наблюдать за развитием эпителия и волосковых клеток.
Введение
Внутреннее ухо всех позвоночных получено из простого эпителия, известного как отический плакод 1,2. Это приведет к появлению всех структурных элементов и типов клеток, необходимых для передачи механосенсорной информации, связанной со слухом и восприятием равновесия. Волосковые клетки (ГК), реснитчатый датчик внутреннего уха, окружены поддерживающими клетками (СК). ГК передают информацию слуховому заднему мозгу через нейроны восьмого черепного нерва. Они также генерируются из otic placode3. Первичная трансдукция звука достигается на апикальной поверхности слухового HC, через механически ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Протоколы, касающиеся закупки, культивирования и использования оплодотворенных куриных яиц и невылупившихся эмбрионов, были одобрены Институциональным комитетом по этике животных Национального центра биологических наук, Бангалор, штат Карнатака.
1. В ово электропорации слуховых предшественников цыплят
- Проектирование и клонирование sgRNA для нокаута гена CRISPR/Cas9
- Для создания нокаутов генов разработайте направляющие РНК, чтобы разрушить экзонные области гена, предпочтительно ближе к 5'-концу кодирующей области.
- Выберите потенциальные направляющие РНК с помощью веб-инструмента CRISPOR
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В электропорационной установке позиционирование электрода может играть роль в области трансфекции. Положительный электрод помещают под желток, а отрицательный над эмбрионом (рисунок 1А). Это приводит к более высокой экспрессии GFP в большей части внутреннего уха и как вестибулярных органов (рисунок 1B), так и слухового базилярного сосочка (рисунок 1C, D), подтверждая трансфекцию.
При оцен.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Цыпленок является экономически эффективным и удобным дополнением к модельным организмам, которые лаборатория может использовать для исследования внутреннего уха. Методы, описанные здесь, обычно используются в нашей лаборатории и дополняют текущие исследования во внутреннем ухе млекопитающих. В ово электропорация используется для введения генетических манипуляций в геном цыпленка. Электропорация также может быть использована для введения конструкций, которые кодируют флуоресцентные белки, нацеленные на определенн.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конкурирующих интересов для раскрытия.
Благодарности
Мы с благодарностью признаем поддержку со стороны NCBS, TIFR, Infosys-TIFR Leading Edge Research Grant, DST-SERB и Королевского национального института для глухих. Мы хотели бы поблагодарить Центральную организацию развития птицеводства и Учебный институт, Хесарагатта, Бангалор. Мы благодарны CIFF и EM и лабораторной поддержке в NCBS. Мы благодарим Йошико Такахаси и Коити Каваками за конструкции Tol2-eGFP и T2TP, а также Гая Ричардсона за антитела HCA и G19 Pcdh15. Мы благодарны членам Earlab за их постоянную поддержку и ценные отзывы о протоколе.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 488 Фаллоидин | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Alexa Fluor 647 Фаллоидин | Thermo Fisher Scientific | A22287 | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3 | Интегрированные технологии ДНК | 1081061 | Высокоточный белок Cas9 |
| Антитела к GFP | Abcam | ab290 | Кролик поликлональный к GFP |
| Сыворотка крупного рогатого скота Альбумин | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Дигидрат хлорида кальция | Thermo Fisher Scientific | Q12135 | |
| Коллаген I, крысиный хвост | Thermo Fisher Scientific | A1048301 | |
| Сушилка для критических точек Leica EM CPD300 | Leica | ||
| CUY-21 Электропоратор | Непаген | ||
| диметилсульфоксид (ДМСО) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DM5000B широкопольный микроскоп | Leica | ||
| DMEM, высокий уровень глюкозы, добавка GlutaMAX, пируват | Thermo Fisher Scientific | 10569010 | |
| Dumont #5 Щипцы | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Щипцы Dumont #55 | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Fluoroshield | Sigma-Aldrich | F6182 | |
| FLUOVIEW 3000 Лазерный сканирующий микроскоп | Olympus | ||
| Глутаральдегид (25 %) | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| козье антитело против мыши IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
| Козий антимышиный IgG вторичный Антитело, Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A-11032 | |
| Вторичное антитело против кролика IgG у козы, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| Сыворотка для коз стерильная фильтрованная | HiMedia | RM10701 | Heat инактивированный |
| сбалансированный раствор соли Хэнкса (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
| LSM980 Airyscan Микроскоп | Zeiss | ||
| Millicell Cell Culture Вкладыш, 30 мм, гидрофильный ПТФЭ, 0,4 и микро; m | Sigma-Aldrich | PICM03050 | |
| MVX10 Стереомикроскоп | Olympus | ||
| MYO7A антитело | DSHB | 138-1 | Мышиный моноклональный к нетрадиционному миозину-VIIa |
| MZ16 Препарирующий микроскоп | Leica | ||
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Noyes Ножницы, 14 см (5,5' ') | World Precision Instruments | 501237 | |
| Тетраоксид осмия (4%) | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| Параформальдегид | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PC-10 Puller | Narishige | ||
| pcU6_1sgRNA | Addgene | 92395 | Мини-вектор с модифицированным куриным промотором U6 |
| Пенициллин G Натриевая соль | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| фосфатный буферный раствор (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36934 | |
| SMZ1500 Препарирующий микроскоп | Nikon | ||
| Буфер какодилата натрия, 0,2 М | Электронная микроскопия Sciences | 11652 | |
| Натрий хлорид | HiMedia | GRM853 | |
| Sputtre Coater K550X | Стандарт Emitech | ||
| Стеклянные капилляры 3 дюйма, наружный диаметр 1,0 мм, без нити | Precision Instruments | 1B100-3 | |
| Сахароза | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| MERLIN Compact VP | Zeiss | ||
| Тиокарбогидразид | Alfa Aesar | L01205 | |
| TWEEN 20 | Сигма-Олдрич | P1379 |
Ссылки
- Sai, X., Ladher, R. K. Early steps in inner ear development: induction and morphogenesis of the otic placode. Frontiers in Pharmacology. 6, 19(2015).
- Groves, A. K., Fekete, D. M. Shaping sound in space: the regulation of inner ear patterning. Dev....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
