Методическая статья

Модель аневризмы брюшной аорты мыши, индуцированная фосфатом кальция

DOI:

10.3791/64173

⸱

18 ноября 2022 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology and Pathophysiology, School of Basic Medical Sciences; Key Laboratory of Molecular Cardiovascular Science, Ministry of Education, Peking University, 2Department of Vascular and Endovascular Surgery, the First Medical Centre, Chinese PLA General Hospital

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает мышиную модель мышиной аневризмы брюшной аорты (ААА), индуцированную фосфатом кальция, для изучения патологических особенностей и молекулярных механизмов ААА.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Аневризма брюшной аорты (ААА) является опасным для жизни сердечно-сосудистым заболеванием, которое встречается во всем мире и характеризуется необратимым расширением брюшной аорты. В настоящее время используется несколько химически индуцированных мышиных моделей ААА, каждая из которых имитирует отдельный аспект патогенеза ААА. Модель ААА, индуцированная фосфатом кальция, является быстрой и экономически эффективной моделью по сравнению с моделями ААА, индуцированными ангиотензином II и эластазой. Применение кристаллов CaPO4 к аорте мыши приводит к деградации эластичных волокон, потере гладкомышечных клеток, воспалению и отложению кальция, связанному с расширением аорты. В этой статье представлен стандартный протокол для модели ААА, индуцированной CaPO4. Протокол включает подготовку материала, хирургическое применение CaPO4 к адвентициям инфраренальной брюшной аорты, сбор аорты для визуализации аневризм аорты и гистологические анализы у мышей.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Аневризма брюшной аорты (ААА) является смертельным сердечно-сосудистым заболеванием, характеризующимся постоянным расширением брюшной аорты, с высокими показателями смертности после разрыва. ААА связана со старением, курением, мужским полом, гипертонией и гиперлипидемией1. Было показано, что несколько патологических процессов способствуют образованию ААА, включая протеолиз волокон внеклеточного матрикса, инфильтрацию иммунных клеток и потерю гладкомышечных клеток сосудов. В настоящее время патологические механизмы ААА остаются неуловимыми, и не существует проверенных препаратов для лечения ААА1. Исследования ААА человека ограничены из-за существования небольшого количества образцов аорты человека; таким образом, было создано и широко принято несколько моделей ААА животных, индуцированных химической модификацией, включая подкожную инфузию ангиотензина II (AngII), периваскулярную или внутрипросветную инкубацию эластазы и периваскулярное применение фосфата кальция2. Широко используемой моделью мыши является применение фосфата кальция (CaPO4) к адвентиции инфраренальной брюшной аорты, что является экономически эффективным и не требует генетической модификации.

Прямое периаортальное применение CaCl2 к сонной артерии кроликов для индуцирования аневризмальных изменений первоначально сообщалось Gertz et al.3, а затем было применено к брюшной аорте мышей. Модель была разработана Yamanouchi et al. для ускорения расширения аорты с использованием кристаллов CaPO4 у мышей4. Инфильтрация CaPO4 в аорту мышей рекапитулирует многие патологические особенности, наблюдаемые в ААА человека, включая глубокую инфильтрацию макрофагов, деградацию внеклеточного матрикса и отложение кальция. Факторы риска ААА человека, такие как гиперлипидемия, также увеличивают CaPO 4-индуцированную ААА у мышей5. В отличие от AngII перфузионно-индуцированной ААА у мышей ApoE-/- или LDLR-/-, CaPO 4-индуцированная ААА встречается в инфраренальной аортальной области, которая имитирует ААА человека. В настоящее время этот метод широко применяется для оценки восприимчивости к развитию ААА у генетически модифицированных мышей и оценки анти-ААА эффектов препаратов 6,7.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследования на животных проводились в соответствии с руководящими принципами Институционального комитета по уходу за животными и их использованию Научного центра здравоохранения Пекинского университета и были одобрены Комитетом по биомедицинской этике Пекинского университета (LA2015142). Всех мышей для операции анестезировали изофлураном (1,5%-2%), а анестезию тщательно контролировали, чтобы избежать боли или дискомфорта для мышей.

1. Подготовка

  1. Вырежьте полоски резиновых перчаток и марли шириной 0,3 см.
  2. Приобретите 8-10-недельных самцов мышей C57BL/6J. Размещайте животных в кондиционированной среде с 12-часовым циклом света и темноты и свободным доступом к пище и воде.
  3. Автоклав марли, ватных тампонов, ножниц и щипцов перед операцией.
  4. Получайте бетадин, 70% этанол и антисептическое средство для мытья рук.
  5. Наденьте маску, халат и стерильные перчатки.

2. Хирургическая процедура

  1. Кормите жевательными таблетками карпрофена (доза 5 мг/кг) 8-10-недельной мыши C57BL/6J за 2-4 ч до операции. Затем поместите мышь в индукционную камеру (206 мм х 210 мм х 140 мм) с изофлураном со скоростью потока 1,5%-2%.
    1. Наблюдайте за мышью около 5 минут, пока дыхание не будет заметно замедлено. Убедитесь, что мышь не реагирует на болевую стимуляцию перед операцией.
  2. Нанесите офтальмологическую мазь на глаза и обеспечьте тепловую поддержку грелкой или одеялом. Подтверждайте глубину анестезии ущемлением пальца ноги каждые 15 минут во время хирургической процедуры.
  3. Сбрить волосы на животе мышки с помощью электрического машинки для стрижки или крема для удаления волос. Смазать и протереть выбритый участок бетадином, а затем 70% этанолом, несколько раз круговыми движениями. Меняйте перчатки, чтобы сохранить стерильность.
  4. Используйте ножницы, чтобы сделать разрез ~ 1,5 см в нижней части живота вдоль средней линии живота.
  5. Используйте стерильный ватный тампон, смоченный нормальным физиологическим раствором, чтобы осторожно удалить кишечник до тех пор, пока не будет видна инфраренальная аорта.
  6. Рассекните соединительную ткань и жир от инфраренальной аорты на участок примерно 0,5 см. Обратите внимание на мелкие сосуды к спинному борту и избегайте их разрыва. Нет необходимости отделять брюшную аорту от брюшной главной вены.
  7. Упакуйте кусочек пропитанной физиологическим раствором резиновой полоски перчаток под брюшную аорту и брюшную основную вену. Используйте ватный тампон, чтобы вытереть лишнюю жидкость.
  8. Уложить кусочек марли, пропитанный 0,5 М CaCl2 на адвентицию инфраренальной брюшной сосудистой системы в течение 10 мин. Для фиктивной мышиной группы замените 0,5 M CaCl2 обычным физиологическим раствором.
  9. Снимите марлю и упакуйте еще один кусочек марли, пропитанный раствором PBS, в течение 5 минут, чтобы получить кристаллы CaPO4 in situ в адвентиции аорты.
  10. Аккуратно снимите резиновую полоску перчатки и марлю. Сброс кишечного тракта мыши.
  11. Зашить разрез живота и кожу швом 5-0.
  12. Поместите мышь на грелку до тех пор, пока мышь не придет в сознание. Обеспечить послеоперационное восстановление боли и обезболивание, согласно местному комитету по этике животных.
  13. Разместите мышь еще на 14 дней. Внимательно следите за мышью после операции и наблюдайте не менее 1 раза каждый день впоследствии. Немедленно выполните некропсию, если в этот период погибнут мыши.

3. Сбор урожая для визуализации аорты

  1. Через 14 дней после операции принесите в жертву мышей, используя CO2.
  2. Вентрально разрезать грудную и брюшную полости мыши и разрезать правое предсердие.
  3. Перфузируйте мышей с буфером PBS через левый желудочек сердца для удаления крови в аорте, а затем перфьюируйте 4% параформальдегида, как описано ранее8.
  4. Собирают аорту под стереоскопом.
  5. Поместите заготовленную аорту в пробирки, содержащие 5 мл 4% параформальдегида, на 48 ч.
  6. Аккуратно удалите адвентициальную ткань и жир под стереоскопом и прикрепите аорту к черной восковой пластине с помощью игл насекомых.
  7. Получение изображений аорты.

4. Оценка деградации эластических волокон

  1. Разрезать ткани аневризмы аорты на серийные криосекции (толщиной 7 мкм).
  2. Проанализируйте эластичные волокна с помощью коммерческого комплекта для окрашивания эластичного фургона Gieson (EVG) в соответствии с протоколом производителя.
  3. Сортировать деградацию эластина. Степень 1: деградация <25%; степень 2: деградация от 25% до 50%; степень 3: деградация от 50% до 75%; или степень 4: деградация >75%.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Через 14 дней после применения CaPO4 самцы мышей C57BL/6J были усыплены, а их аорты были собраны и очищены. Морфология аорты была изображена для визуализации образования ААА. Как показано на фиг.1А-В, применение CaPO4 приводило к расширению инфраренальной брюшной аорты. Гистологически CaPO4 привел к резкой деградации эластических волокон, о чем свидетельствуют разрывы эластина (рисунок 1C).

<...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Периаортальное применение CaPO4 является надежным подходом к индуцированию ААА у мышей. В нескольких исследованиях использовалась модель CaPO4 и последовательно сообщалось, что это быстрый и воспроизводимый метод изучения ААА у мышей 7,9. Считается, что эта модель повторяет часть особенностей аневризмы аорты человека и дает механистическое представление о патогенезе ААА, включая воспаление и деградацию внеклеточного матрикса.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано финансированием Национального фонда естественных наук Китая (NSFC, 81730010, 91839302, 81921001, 31930056 и 91529203) и Национальной ключевой программы исследований и разработок Китая (2019YFA 0801600).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
CaCl2MECKLINC805225
NaClBiomedSH5001-01
PBSHARVEYBIOMB5051
Аппарат искусственной вентиляции легких для мелких животныхRWDH1550501-012

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kent, K. C. Abdominal aortic aneurysms. The New England Journal of Medicine. 371, 2101-2108 (2014).
  2. Patelis, N., et al. Animal models in the research of abdominal aortic aneurysms development. Physiological Research. 66 (6), 899-915 (2017).
  3. Gertz, S. D., Kurgan, A., Eisenberg, D. Aneurysm of the rabbit common carotid artery induced by periarterial application of calcium-chloride in vivo. Journal of Clinical Investigation. 81 (3), 649-656 (1988).
  4. Yamanouchi, D., et al. Accelerated aneurysmal dilation associated with apoptosis and inflammation in a newly developed calcium phosphate rodent abdominal aortic aneurysm model. Journal of Vascular Surgery. 56 (2), 455-461 (2012).
  5. Wang, Y. T., et al. Influence of apolipoprotein E, age and aortic site on calcium phosphate induced abdominal aortic aneurysm in mice. Atherosclerosis. 235 (1), 204-212 (2014).
  6. Zhao, G., et al. Unspliced xbp1 confers VSMC homeostasis and prevents aortic aneurysm formation via foxo4 interaction. Circulation Research. 121 (12), 1331-1345 (2017).
  7. Jia, Y., et al. Targeting macrophage TFEB-14-3-3 epsilon interface by naringenin inhibits abdominal aortic aneurysm. Cell Discovery. 8 (1), 21(2022).
  8. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
  9. Yu, B., et al. CYLD deubiquitinates nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4 contributing to adventitial remodeling. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (8), 1698-1709 (2017).
  10. Altobelli, E., Rapacchietta, L., Profeta, V. F., Fagnano, R. Risk factors for abdominal aortic aneurysm in population-based studies: A systematic review and meta-analysis. International Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (12), 2805(2018).
  11. Theivacumar, N. S., Stephenson, M. A., Mistry, H., Valenti, D. Diabetes mellitus and aortic aneurysm rupture: A favorable association. Vascular and Endovascular Surgery. 48 (1), 45-50 (2014).
  12. Tanaka, T., Takei, Y., Yamanouchi, D. Hyperglycemia suppresses calcium phosphate-induced aneurysm formation through inhibition of macrophage activation. Journal of the American Heart Association. 5 (3), 003062(2016).
  13. Lu, H., et al. Subcutaneous angiotensin II infusion using osmotic pumps induces aortic aneurysms in mice. Journal of Visualized Experiments. (103), e53191(2015).
  14. Urry, D. W. Neutral sites for calcium ion binding to elastin and collagen: A charge neutralization theory for calcification and its relationship to atherosclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68 (4), 810-814 (1971).
  15. Li, Z. Q., et al. Runx2 (runt-related transcription factor 2)-mediated microcalcification is a novel pathological characteristic and potential mediator of abdominal aortic aneurysm. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40 (5), 1352-1369 (2020).
  16. Kelly, M. J., Igari, K., Yamanouchi, D. Osteoclast-like cells in aneurysmal disease exhibit an enhanced proteolytic phenotype. International Journal of Molecular Sciences. 20 (19), 4689(2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи