Методическая статья

Рассечение клеточно-автономной функции хрупкого белка умственной отсталости X в слуховой цепи с помощью электропорации In Ovo

DOI:

10.3791/64187

⸱

6 июля 2022 г.

 ,  ,  , 
1Division of Histology & Embryology, Key Laboratory for Regenerative Medicine of the Ministry of Education, College of Medicine, Jinan University, 2Department of Clinical Pathology, First Affiliated Hospital of Jinan University, 3Program in Neuroscience, Department of Biomedical Sciences, College of Medicine, Florida State University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Используя электропорацию ово , мы разработали метод селективной трансфекции слухового внутреннего уха и кохлеарного ядра у куриных эмбрионов для достижения специфического для клеточной группы нокдауна хрупкого белка умственной отсталости X в течение дискретных периодов сборки цепи.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Хрупкий белок умственной отсталости X (FMRP) является мРНК-связывающим белком, который регулирует локальную трансляцию белка. Потеря или дисфункция FMRP приводит к аберрантной нейрональной и синаптической активности при синдроме хрупкого X (FXS), который характеризуется умственной отсталостью, сенсорными аномалиями и проблемами социальной коммуникации. Исследования функции FMRP и патогенеза FXS в основном проводились с нокаутом Fmr1 (ген, кодирующий FMRP) у трансгенных животных. Здесь мы сообщаем о методе in vivo для определения клеточно-автономной функции FMRP в период сборки цепи и синаптического образования с использованием куриных эмбрионов. Этот метод использует стадийную, участковую и направленную электропорацию векторной системы, индуцируемой лекарственным средством, содержащей небольшую шпильковую РНК Fmr1 (шРНК) и репортер EGFP. С помощью этого метода мы достигли селективного нокдауна FMRP в слуховом ганглии (AG) и в одной из его мишеней ствола мозга, ядре magnocellularis (NM), тем самым обеспечивая компонентно-специфическую манипуляцию в цепи AG-NM. Кроме того, мозаичный рисунок трансфекции позволяет проводить внутри животных контроль и сравнение соседних нейронов / волокон для повышения надежности и чувствительности при анализе данных. Индуцируемая векторная система обеспечивает временной контроль начала редактирования генов, чтобы свести к минимуму накапливающиеся эффекты развития. Сочетание этих стратегий обеспечивает инновационный инструмент для препарирования клеточно-автономной функции FMRP в синаптическом и схемном развитии.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Синдром хрупкой Х (FXS) — это расстройство нервного развития, характеризующееся умственной отсталостью, сенсорными аномалиями и аутистическим поведением. В большинстве случаев FXS вызван глобальной потерей хрупкого белка умственной отсталости X (FMRP; кодируется геном Fmr1), начиная с ранних эмбриональных стадий1. FMRP представляет собой РНК-связывающий белок, который обычно экспрессируется в большинстве нейронов и глиальных клеток головного мозга, а также ворганах чувств 2,3,4. В мозге млекопитающих FMRP, вероятно, связан с сотнями мРНК, которые кодируют белки, важные для различных нейронных активностей5. Исследования обычных нокаутирующих животных Fmr1 показали, что экспрессия FMRP особенно важна для сборки и пластичности синаптической нейротрансмиссии6. Несколько условных и мозаичных нокаутных моделей дополнительно продемонстрировали, что действия и сигналы FMRP варьируются в разных областях мозга, типах клеток и синаптических участках во время нескольких событий развития, включая аксональную проекцию, дендритный паттерн и синаптическую пластичность 7,8,9,10,11,12,13,14 . Острая функция FMRP в регуляции синаптической передачи изучалась внутриклеточной доставкой ингибирующих антител FMRP или самой FMRP в срезах мозга или культивируемых нейронах 15,16,17,18. Эти методы, однако, не дают возможности отслеживать последствия, вызванные неправильной экспрессией FMRP, во время развития. Таким образом, разработка методов in vivo для исследования клеточно-автономных функций FMRP очень необходима и, как ожидается, поможет определить, являются ли зарегистрированные аномалии у пациентов с FXS прямыми последствиями потери FMRP в ассоциированных нейронах и цепях или вторичными последствиями, полученными из общесетевых изменений во время развития19.

Слуховой ствол мозга куриных эмбрионов предлагает уникально выгодную модель для углубленного функционального анализа регуляции FMRP в цепном и синапсовом развитии. Легкий доступ к эмбриональному куриному мозгу и хорошо зарекомендовавшая себя техника электропорации в ово для генетических манипуляций в значительной степени способствовали нашему пониманию развития мозга на ранних эмбриональных стадиях. В недавно опубликованном исследовании этот метод был объединен с передовыми молекулярными инструментами, которые позволяют временно контролировать неправильную экспрессию FMRP20,21. Здесь усовершенствована методология индуцирования селективных манипуляций с пресинаптическими и постсинаптическими нейронами по отдельности. Этот метод был разработан в слуховой цепи ствола мозга. Акустический сигнал обнаруживается волосковыми клетками в слуховом внутреннем ухе, а затем передается в слуховой ганглий (AG; также называемый спиральным ганглием у млекопитающих). Биполярные нейроны в АГ иннервируют волосковые клетки своими периферическими отростками и, в свою очередь, посылают центральную проекцию (слуховой нерв) в ствол мозга, где они заканчиваются двумя первичными кохлеарными ядрами, ядром magnocellularis (NM) и ядром angularis (NA). Нейроны в НМ структурно и функционально сопоставимы со сферическими кустистыми клетками антеровентрального кохлеарного ядра млекопитающих. В NM, слуховые нервные волокна (ANF) синапс на соматах nm нейронов через большую конечную бульбу Held terminals22. Во время развития нейроны NM возникают из ромбомеров 5 и 6 (r5/6) в заднем мозге23, в то время как нейроны AG получены из нейробластов, находящихся в отоцисте24. Здесь мы описываем процедуру селективного сбивания экспрессии FMRP в пресинаптических нейронах AG и в постсинаптических нейронах NM по отдельности.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Яйца и куриные эмбрионы обрабатывались с осторожностью и уважением в соответствии с протоколами для животных, утвержденными Комитетом по уходу и использованию животных Университета Цзинань.

1. Препарат яиц и плазмид

  1. Приготовление яиц
    1. Получите свежие оплодотворенные куриные яйца (Gallus gallus) из Южно-Китайского сельскохозяйственного университета и храните при температуре 16 °C перед инкубацией. Для оптимальной жизнеспособности поместите все яйца на инкубацию в течение недели после прибытия.
    2. Поместите яйца горизонтально и инкубируйте при 38 °C в течение 46-48 ч до стадии Гамбургера и Гамильтона (HH) 1225 для трансфекции нервной трубки или в течение 54-56 ч до HH13 для трансфекции отоцисты. Поскольку животная шеста яйца легче, чем растительный полюс, горизонтальное размещение помещает эмбрион в верхнюю часть яйца для легкой манипуляции. Соблюдайте осторожность, чтобы держать яйцо горизонтальным в этом и всех последующих шагах.
    3. Расположение эмбриона проявляется в виде темной области на яичной скорлупе при отбрасывании света со дна яйца с помощью фонарика. На нужных этапах HH используйте этот метод фонарика, чтобы отметить местоположение эмбриона на яичной скорлупе карандашом.
    4. Протрите яйца марлей, содержащей 75% этанола. Просверлите отверстие в заостренном конце яиц кончиком ножниц и удалите 2 мл альбумина шприцем из иглы 18 г. Убедитесь, что отверстие достаточно большое, чтобы можно было вставить иглу. Протрите любой протекающий альбумин марлей и заклейте отверстие прозрачной лентой.
    5. Чтобы свести к минимуму трещины и предотвратить падение обломков скорлупы во время окон, накройте верхнюю часть яиц прозрачной лентой, центрируясь на темной области, отмеченной карандашом.
  2. Экстракция плазмидной ДНК
    1. Клонирование куриной ШРНК Fmr1 с использованием транспозонной системы Tet-on, как описано ранее20. Эта система содержит три плазмиды: pCAGGS-T2TP, pT2K-CAGGS-rtTA-M2 и pT2K-BI-TRE-EGFP-Fmr1 шРНК, обеспечивая индуцируемую лекарственным средством векторную систему, с помощью которой экспрессия шРНК Fmr1 и EGFP заглушается после трансфекции и может быть включена индукции доксициклина (Dox).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти плазмиды в настоящее время недоступны в репозитории. Авторы соглашаются предоставить плазмиды по разумной просьбе.
    2. Экстрагируйте плазмидные ДНК с помощью безэндотоксинов в соответствии с инструкцией производителя и выпадайте в осадок, добавляя 1/15 объема 7,5 М ацетата натрия и 1 объем 100% изопропанола.
    3. Осадки плазмиды при -20 °C в течение ночи и центрифуга при 13 000 х г в течение 10 мин. Растворить гранулу с помощью буфера Tris-EDTA, предусмотренного в комплекте, до конечной концентрации 4-5 мкг/мкл. Плазмиды можно хранить при -20 °C в течение 12 месяцев без снижения эффективности трансфекции.
    4. В день электропорации тщательно перемешайте 2 мкл каждой плазмиды в стерильной центрифужной трубке с помощью наконечника пипетки. Полученного объема плазмидной смеси в 6 мкл достаточно для электропорации трех десятков яиц. Чтобы помочь визуализировать плазмиду во время электропорации, добавьте 1 мкл 0,1% быстрого зеленого (приготовленного в стерильном ddH2O) на каждые 6 мкл смеси ДНК26, что превращает плазмидную смесь в синий цвет.

2. В ово электропорация

  1. Вскрытие яйцеклеток и идентификация эмбрионов
    1. В день электропорации извлеките яйца из инкубатора, по дюжине яиц за раз. Удержание яиц вне инкубатора более 1 ч приводит к изменениям в развитии и снижает жизнеспособность.
    2. Протрите все хирургические инструменты марлей, содержащей 75% этанола.
    3. Поместите каждое яйцо в изготовленный на заказ держатель для пены. Протрите покрытую лентой область 75% этанолом и вырежьте окно (1-2 см2) по окружности карандашной метки с помощью небольшой пары ножниц (рисунок 1А). При резке держите ножницы плоскими, чтобы не повредить эмбрион под ними.
    4. Поместите оконное яйцо под стереомикроскоп с 10-кратным окуляром и 2-кратным зумом и идентифицируйте эмбрион. Отрегулируйте угол и яркость источника света для лучшей визуализации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Требуется практика и опыт, чтобы визуализировать эмбрион и идентифицировать нервную трубку на этом этапе.
      1. Для начинающих используйте следующую дополнительную инъекцию чернил, чтобы облегчить идентификацию эмбриона. Заранее приготовьте 10% раствор индийских чернил в 0,01 М фосфат-буферного физиологического раствора (PBS) и автоклаве. Заполните шприц объемом 1 мл раствором чернил, а затем поместите иглу 27G. Согните иглу под углом 45° щипцами.
      2. Под микроскопом аккуратно ткните от края области опаки и вставьте иглу под эмбрион. Вводят ~50 мкл чернил, которые будут диффундировать ниже области пеллюцида для визуализации эмбриона. Чернила образуют темный фон для четкой визуализации эмбриона.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Выталкивайте воздух из шприца перед введением и впрыском. При умении визуализации избегайте этапа инъекции чернил, так как это снижает выживаемость.
  2. Инъекция нервной трубки и электропорация
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура выполняется в HH12 для трансфекции нейронов NM в стволе мозга.
    1. Втяните стеклянные капилляры (~1 мм в диаметре и 100 мм в длину) в пипетки с помощью съемника пипетки. Под рассекающим микроскопом осторожно откройте кончик капиллярной иглы до 10-20 мкм в диаметре щипцами. Храните пипетки (обычно по 5-10 за один раз) в ящике для хранения до использования.
    2. Наполните капиллярную пипетку 0,5-1 мкл плазмидной смеси, применяя отрицательное давление через резиновую трубку на конце пипетки. Это может быть достигнуто с помощью шприца или воздушного насоса.
    3. Поместите яйцеклетку под микроскоп так, чтобы эмбрион был вертикально ориентирован с хвостом рядом с вами (или горизонтально для введения капиллярных пипеток с помощью трехосевого манипулятора). Держите капиллярную пипетку одной рукой или трехосевым манипулятором и наведите кончик пипетки на r5/6 в направлении хвост к голове.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Самая передняя область заднего мозга составляет r1, а каждая последующая выпуклость вдоль нервной трубки представляет собой отдельный ромбомер. R5/6 находится на том же переднезаднем уровне, что и отоциста, которая представляет собой легко узнаваемую чашеобразную структуру (рисунок 1B-C).
    4. Осторожно просуните наконечник через вителлиновую мембрану в спинную нервную трубку, а затем немного выньте пипетку, чтобы наконечник находился в просвете нервной трубки. Впрыскивайте плазмидную смесь, применяя давление воздуха до тех пор, пока тонированная плазмида полностью не диффундирует в r5/6 и не распространится на r3 и r4.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нет необходимости делать прорезь на мембране вителлина для инъекций.
    5. Проверьте успешную инъекцию, которая достигается, когда раствор синей плазмиды быстро диффундирует вниз по нервной трубке без утечки (рисунок 1B-C). Когда происходит утечка, синий быстро исчезает.
    6. Сразу после инъекции поместите платиновый биполярный электрод по обе стороны нервной трубки (рисунок 1D). Подайте два импульса длительностью 12 В и 50 мс с помощью электропоратора. Наблюдайте пузырьки воздуха на концах биполярного электрода, с большим количеством на отрицательной стороне.
    7. Проверьте успешную электропорацию, которая достигается, когда тонированная плазмидная смесь попадает в ткань нервной трубки вблизи положительной стороны электрода. После электропорации осторожно извлеките биполярный электрод.
    8. Накройте окно на яичной скорлупе куском прозрачной пленки, который предварительно разрезают на 2 квадрата и опрыскивают 75% этанолом. Поместите яйцо обратно в инкубатор.
    9. Очистите биполярный электрод, подав 10-20 импульсов длительностью 12 В и 50 мс в физиологическом растворе, прежде чем перейти к следующему яйцу.
  3. Инъекция отоцистов и электропорация
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура выполняется в HH13 для трансфекции волосковых клеток и нейронов AG во внутреннем ухе.
    1. В HH13 (который является ~ эмбриональным днем 2,5) эмбрион повернулся так, что правая сторона головы обращена вверх. Под микроскоп поместите яйцеклетку так, чтобы эмбрион был вертикальным, с хвостом рядом с вами. Зажмите капиллярную пипетку и аккуратно ткните правую отоцисту в дорсолатеральном направлении (рисунок 2А).
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этой стадии отоциста проявляется в виде небольшой круглой структуры на верхней части тела на том же переднезаднем уровне, что и r5/6.
    2. Вводят плазмидную смесь давлением воздуха до тех пор, пока отоциста не наполнится синим раствором27. Проверьте успешную инъекцию, которая достигается, когда синяя плазмидная смесь ограничена отоцистой и не протекает.
    3. Сразу после инъекции поместите биполярный электрод на отоцисту, как показано на рисунке 2B. Расположите положительную и отрицательную стороны спереди и сзади к отоцисте соответственно. Подайте два импульса длительностью 12 В и 50 мс с помощью электропоратора.
    4. Проверьте успешность электропорации, которая достигается, когда смешение синей плазмиды попадает в ткань отоцисты вблизи положительной стороны электрода. После электропорации осторожно извлеките биполярный электрод. Накройте окно на яичной скорлупе прозрачной пленкой и верните яйцо в инкубатор.

3. Введение Dox для инициирования и поддержания транскрипции плазмид

  1. Приготовление раствора Dox
    1. Отмерьте 100 мг порошка Dox под химическим капотом и растворите его в 100 мл стерильного PBS, чтобы получить 1 мг / мл рабочего раствора. Отфильтруйте раствор фильтром 0,22 мкм и сохраните 1 мл аликвоты при -20 °C. Защита от света 20,28.
  2. Администрация Dox
    1. Для полноценного редактирования генов за 24 часа до желаемого возраста разморозьте аликвоту Dox на льду. Капля 50 мкл Dox непосредственно на хориоаллантоидную мембрану яйца с помощью шприца, проникающего в прозрачную пленку. Запечатайте отверстие иглы прозрачной пленкой или лентой после инъекции.
    2. Чтобы сохранить эффект нокдауна, вводите Докс через день до сбора ткани на желаемой стадии развития.

4. Рассечение и сечение тканей

  1. Ствол мозга
    1. Для эмбрионов на эмбриональной стадии 3 (Е3) и Е6 откройте яичную скорлупу и перережьте связанную с ней мембрану ножницами. Выложите эмбрион и погрузите его в 4% параформальдегид (PFA) в 0,1 М фосфатного буфера.
    2. Для эмбрионов E9 откройте яичную скорлупу, обезглавите эмбрион ножницами и перенесите голову на пластину с кремниевым дном, заполненную PBS. Прожмите голову вниз по орбитам и разрежьте верхнюю часть черепа на части. Осторожно поместите щипцы под мозг с обеих сторон и поднимите весь мозг от черепа плечами щипцов. Погрузите мозг в 4% PFA.
    3. Для эмбрионов E15 и E19 откройте яичную скорлупу, обезглавите эмбрион ножницами и поместите голову на пластину с кремниевым дном, заполненную PBS. Отрежьте кожу на верхней части головы, чтобы обнажить череп.
    4. Прорезайте череп вертикально бритвой, чтобы разделить передний мозг и каудальный мозг. Погрузите каудальный блок в PBS, удалите верхнюю часть черепа, а затем снимите мозг с черепа.
    5. Зафиксируйте мозг через оптическую долю и разделите мозжечок и ствол мозга. Следите за тем, чтобы не повредить слуховой ствол мозга, который расположен прямо под мозжечком. Удалите как можно больше твердой мозговой оболочки из ствола мозга, а затем погрузите его в 4% PFA.
    6. Держите эмбрионы и ткани мозга в 4% PFA при 4 °C в течение ночи, за исключением стволов мозга E19, которые должны храниться в том же состоянии в течение 24 ч.
    7. После фиксации обезвоживают ткань в PBS, содержащую 30% сахарозы, пока она не осядет, что обычно занимает 1-3 дня, в зависимости от возраста.
    8. Разрезание ствола мозга (E15 и E19) на 30 мкм в корональной плоскости с помощью скользящего микротома. Соберите срезы в PBS и храните при 4 °C перед иммуноокрашиванием.
    9. Для эмбрионов E3 и E6 и стволов мозга E9 сечение составляет 50 мкм поперечно. Собирайте секции в PBS и храните при температуре 4 °C. Установите секции на предметные стекла микроскопа с желатиновым покрытием перед иммуноокрашиванием. Сбор более толстых участков для этих возрастов облегчает обработку тканей.
  2. Слуховой канал
    1. После удаления стволов мозга из эмбрионов E9, E15 и E19 слуховой проток, который встроен в височную кость, легко идентифицируется, лежа под черепом, а височная кость легко отделяется от окружающего черепа. Для эмбрионов E9 зафиксируйте всю височную кость в 4% PFA. Для пожилых эмбрионов удалите костную структуру височной кости, чтобы изолировать слуховой проток и зафиксировать слуховой проток в 4% PFA.
    2. Держите все височные кости и слуховые протоки в 4% PFA при 4 °C в течение ночи до встраивания ткани.
    3. Выполните встраивание тканей, как описано. Приготовьте раствор для встраивания следующим образом: Замочите 10% желатин (из кожи крупного рогатого скота) в холодной воде до тех пор, пока желатиновые гранулы не набухнут и не осядут (около 30 мин). Нагрейте смесь до ~50 °C, чтобы растворить желатин, добавьте 20% сахарозы в желатиновый раствор и перемешайте, чтобы растворить. Хранить желатино-сахарозный раствор при 4 °C до месяца.
    4. Для применения разогрейте желатино-сахарозный раствор при 37 °C. Замочите височные кости/слуховые протоки в теплом растворе желатино-сахарозы на 96-луночной пластине при 37 °C до тех пор, пока они не осядут, обычно 30-60 мин.
    5. Выровняйте дно колодцев 12-луночной плитой полоской прозрачной пленки. Добавить слой теплого желатино-сахарозного раствора и подождать, пока он затвердеет. Перенесите височную кость/слуховой проток в каждую лунку.
    6. Имплантировать в ткань второй слой теплого желатино-сахарозного раствора. Отрегулируйте положение ткани так, чтобы она находилась в центре геля, а слуховой проток был ориентирован горизонтально. Осторожно переместите пластину в холодильник с температурой 4 °C и подождите, пока гель не станет твердым.
    7. Потяните прозрачную пленочную полоску, чтобы переместить блок гелевой ткани из колодца. Обрежьте дополнительный гель в квадратный блок и срежьте угол блока, чтобы определить ориентацию. Оберните желатиновый блок кусочком фольги, заморозьте на сухом льду, а затем храните при -80 °C до секционирования.
    8. Секционирование блока на 20 мкм по долготе слухового протока криостатом. Установите секции непосредственно на предметные стекла микроскопа с желатиновым покрытием. Храните слайды при температуре -80 °C перед иммуноокрашиванием.
    9. Перед иммуноокрашиванием погрузите слайды в предварительно подогретый PBS (45 °C) на 5 мин, чтобы растворить желатин, а затем промыть слайды 3x с комнатной температурой PBS для удаления остаточного желатина.

5. Иммуноокрашивание и микроскопическая визуализация

ПРИМЕЧАНИЕ: Два типа иммуноокрашивания выполняются в зависимости от того, установлены ли секции на слайдах или свободно плавают в PBS.

  1. Иммуноокрашивание на слайдах
    1. Мойте слайды 3x в течение 10 минут каждый с PBS. Обведите область, содержащую секции, масляной ручкой, чтобы предотвратить утечку жидкости во время окрашивания. Накрыть участки блокирующим раствором, содержащим 5% нормальную козью сыворотку в ПБС и инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре.
    2. Разбавляют первичные антитела (конечную концентрацию используют в Таблице материалов) в ПБС, содержащих 0,3% TritonX-100 и 5% нормальной козьей сыворотки. Удалите блокирующий раствор и затем накройте участки раствором первичного антитела. Инкубируйте горки при 4 °C в течение ночи в коробке, содержащей слой дистиллированной воды на дне.
    3. Промойте слайды 3x в течение 10 минут с помощью PBS. Применяют флуоресцентные вторичные антитела, разведенные при 1:500 в PBS, содержащие 0,3% TritonX-100, на слайдах. Инкубировать горки при комнатной температуре в течение 4 ч, экранированные от света.
    4. Мойте слайды 3x с помощью PBS. Осторожно опустите две капли монтажного носителя на слайды и накройте секции чехлами. Следите за тем, чтобы не образовывать пузырьки воздуха между крышкой и слайдом.
  2. Иммуноокрашивание цельных эмбрионов и свободно плавающих секций
    1. Промывайте эмбрионы/срезы PBS 3x в течение 10 мин каждый в луночной пластине. Разбавляют первичные антитела в PBS, содержащие 0,3% TritonX-100 и 5% нормальной козьей сыворотки в центробежных пробирках. Перенесите каждый эмбрион/секцию в трубку со стеклянным крючком и инкубируйте на шейкере со скоростью 60 оборотов в минуту в течение ночи при 4 °C.
    2. Промывайте эмбрионы/секции 3x PBS в течение 10 мин каждый в луночной пластине. Перенесите каждый эмбрион/участок в темную центробежную трубку, заполненную флуоресцентным раствором вторичных антител, и инкубируйте при комнатной температуре в течение 4 ч на шейкере.
    3. Промыть эмбрионы/секции 3x PBS в луночной пластине. Используйте щетку для крепления секций на предметные стекла микроскопа с желатиновым покрытием в 15-сантиметровой чашке, содержащей PBS. После того, как горки слегка высохнут (~5 мин), нанесите две капли монтажного материала и поместите крышку. Следите за тем, чтобы не образовывать пузырьки воздуха между крышкой и слайдом. Храните все ткани крепления в PBS для визуализации.
  3. Отображение
    1. Изобразите целые ткани крепления в PBS в чашке с кремниевым дном, содержащим углеродный порошок, который обеспечивает черный фон. Захватывайте и обрабатывайте изображения с помощью коммерческого программного пакета Olympus для обработки изображений, как описано ранее29.
    2. Изобразите участки на слайдах с помощью конфокального микроскопа, как описано ранее20. Изображайте участки в одной фокальной плоскости с 10-кратными, 20-кратными и 63-кратными целями. Захватите все изображения одного и того же животного, используя одни и те же параметры. Позаботьтесь о том, чтобы отрегулировать уровень лазера и настройки сбора изображений, чтобы избежать насыщения сигнала.
    3. Выполняйте обработку изображений с помощью программного обеспечения Fiji. Для иллюстрации отрегулируйте яркость, контрастность и гамму изображения с помощью профессионального программного обеспечения для редактирования изображений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Выполняя электропорацию ово на разных участках и на разных стадиях развития, мы добились селективного нокдауна FMRP либо на слуховой периферии, либо в слуховом стволе мозга.

Нокдаун FMRP в NM
Малая шпилька РНК (шРНК) против курицы Fmr1 была разработана и клонирована в векторную систему Тет-Он, как описано ранее20. Установка для электропорации in ovo показана на рисунке 1A. Плазмидную ДНК, окраш...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для определения клеточно-автономной функции FMRP необходимо манипулировать его экспрессией в отдельных клеточных группах или типах клеток. Поскольку одной из основных функций FMRP является регулирование синаптического образования и пластичности, избирательное манипулирование каждым синаптическим компонентом определенной схемы является необходимым условием для полного понимания механизма FMRP в синаптической связи. Используя в овоэлектропорации куриных эмбрионов, мы продемонстриро...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано: грантом Национального фонда естественных наук Китая (No 32000697); Научно-техническая программа Гуанчжоу (202102080139); Гуандунский фонд естественных наук (2019A1515110625, 2021A1515010619); Фонды фундаментальных исследований центральных университетов (11620324); Исследовательский грант Ключевой лаборатории регенеративной медицины, Министерство образования, Университет Цзинань (No. ZSYXM202107); Фонды фундаментальных исследований для центральных университетов Китая (21621054); и Фонд медицинских научных исследований китайской провинции Гуандун (20191118142729581). Благодарим медицинский экспериментальный центр Университета Цзинань. Мы благодарим доктора Терру Брэдли за тщательное редактирование рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Инкубация яиц
16 ° C холодильникомМАГАТИспользуется для хранения оплодотворенных яиц.
Инкубатор для яицSHANGHAI BOXUNGZX-9240MBE
Оплодотворенные яйцаФерма Южно-Китайского сельскохозяйственного университетаЯйца необходимо использовать в течение одной недели для оптимальной жизнеспособности.
<сильно>Плазмидный препарат
центрифугаSigma10016
Fast greenSolarbioG1661Сделайте 0,1% рабочий раствор в дистиллированной воде и автоклаве.
Набор для приготовления плазмиды Maxi-prepQIAGEN12162Растворить плазмидную ДНК в буфере Tris-EDTA (TE); набор для препаратов без эндотоксинов
Sodium AcetateSigma-AldrichS2889Приготовить 7,5М рабочий раствор в воде без нуклазы.
<сильно>Электропорация и введение доксициклина
ЭлектропораторBTXECM399
1 мл / 5 мл ШприцГУАНЧЖОУ КАНФУЛАЙ
Препарирующий микроскопCNOPTECSZM-42
ДоксциклинSigma-AldrichD9891Используйте свежие аликвоты для каждой дозы и храните при температуре -20 & deg;C.
Стеклянный капиллярBEIBOBOMEIRD09100,9-1,1 мм*100 мм
Лабораторная парапленкаPARAFILMPM996прозрачная пленка
Съемник пипеткиCHENGDU INSTRUMENT FACTORYWD-2Условие вытягивания: 500 градусов; C для 15 с
Платиновые электродатчикиСамодельного изготовлениядиаметром 0,5 мм, интервалом 1,5 мм.
Резиновая трубкаSigma-AldrichA5177
Tissue Dissection and Fixation
ЩипцыRWDF11020-11Размер наконечника: 0,05*0,01 мм
Другие хирургические инструментыRWD
ПараформальдегидSigma-Aldrich158127Свежеприготовленный 4% раствор PFA в фосфатно-солевом буфере может храниться при температуре 4° C на срок до 1 недели.
SYLGARD 184 Silicone Elastomer KitDOW01673921Для черных фоновых пластин применяется пищевой углеродный порошок.
Sectioning
CryostatLEICACM1850
ЖелатинSigma-AldrichG9391Из бычьей кожи.
Скользящий микротомLEICASM2010
<сильный>Иммуноокрашивающий
Alexa Fluor 488 козий анти-мышиныйAbcamab1501131:500 разведение, RRID: AB_2576208
Alexa Fluor 555 козий анти-кроликAbcamab1500781:500 разведение, RRID: AB_2722519
DAPIAbcamab2853901:1000 разбавитель
Fluoromount-G монтажная средаЮжная  Biotech Sb-0100-01
FMRP антителоY. Wang, Университет штата Флорида#82631:1000 разведение, RRID: AB_2861242
Islet-1 антителоDSHB39.3F71:100 разведение, RRID: AB_1157901
Netwell plateCorning3478
Нейрофиламентное антителоSigma-AldrichN41421:1000 разведение, RRID: AB_477272
Антитело к парвальбуминуSigma-AldrichP3088разведение 1:10000, RRID: AB_477329
антитело SNAP25Abcamab66066разведение 1:1000, RRID: AB_2192052
Imaging
Adobe photoshopпрограммное обеспечение для редактирования изображенийADOBE
Конфокальный микроскопLEICASP8
Флуоресцентный стереомикроскопOLYMPUSMVX10
Olympus Image-Pro Plus 7.0OlYMPUSКоммерческий программный комплекс для обработки изображений

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hagerman, R. J., et al. Fragile X syndrome. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17065(2017).
  2. Hinds, H. L., et al. Tissue specific expression of FMR-1 provides evidence for a functional role in fragile X syndrome. Nature Genetics. 3 (1), 36-43 (1993).
  3. Frederikse, P. H., Nandanoor, A., Kasinathan, C. Fragile X Syndrome FMRP co-localizes with regulatory targets PSD-95, GABA receptors, CaMKIIalpha, and mGluR5 at fiber cell membranes in the eye lens. Neurochemical Research. 40 (11), 2167-2176 (2015).
  4. Zorio, D. A., Jackson, C. M., Liu, Y., Rubel, E. W., Wang, Y. Cellular distribution of the fragile X mental retardation protein in the mouse brain. Journal of Comparative Neurology. 525 (4), 818-849 (2017).
  5. Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
  6. Bakker, C. E., Oostra, B. A. Understanding fragile X syndrome: insights from animal models. Cytogenetic and Genome Research. 100 (1-4), 111-123 (2003).
  7. Hanson, J. E., Madison, D. V. Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).
  8. Deng, P. Y., Sojka, D., Klyachko, V. A. Abnormal presynaptic short-term plasticity and information processing in a mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 31 (30), 10971-10982 (2011).
  9. Patel, A. B., Hays, S. A., Bureau, I., Huber, K. M., Gibson, J. R. A target cell-specific role for presynaptic Fmr1 in regulating glutamate release onto neocortical fast-spiking inhibitory neurons. Journal of Neuroscience. 33 (6), 2593-2604 (2013).
  10. Patel, A. B., Loerwald, K. W., Huber, K. M., Gibson, J. R. Postsynaptic FMRP promotes the pruning of cell-to-cell connections among pyramidal neurons in the L5A neocortical network. Journal of Neuroscience. 34 (9), 3413-3418 (2014).
  11. Higashimori, H., et al. Selective deletion of astroglial FMRP dysregulates glutamate transporter GLT1 and contributes to Fragile X syndrome phenotypes in vivo. Journal of Neuroscience. 36 (27), 7079-7094 (2016).
  12. Hodges, J. L., et al. Astrocytic contributions to synaptic and learning abnormalities in a mouse model of Fragile X syndrome. Biological Psychiatry. 82 (2), 139-149 (2017).
  13. Gonzalez, D., et al. Audiogenic seizures in the Fmr1 knock-out mouse are induced by Fmr1 deletion in subcortical, VGlut2-expressing excitatory neurons and require deletion in the inferior colliculus. Journal of Neuroscience. 39 (49), 9852-9863 (2019).
  14. Bland, K. M., et al. FMRP regulates the subcellular distribution of cortical dendritic spine density in a non-cell-autonomous manner. Neurobiology of Disease. 150, 105253(2021).
  15. Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. Fragile X mental retardation protein induces synapse loss through acute postsynaptic translational regulation. Journal of Neuroscience. 27 (12), 3120-3130 (2007).
  16. Pfeiffer, B. E., et al. Fragile X mental retardation protein is required for synapse elimination by the activity-dependent transcription factor MEF2. Neuron. 66 (2), 191-197 (2010).
  17. Deng, P. Y., et al. FMRP regulates neurotransmitter release and synaptic information transmission by modulating action potential duration via BK channels. Neuron. 77 (4), 696-711 (2013).
  18. Yang, Y. M., et al. Identification of a molecular locus for normalizing dysregulated GABA release from interneurons in the Fragile X brain. Molecular Psychiatry. 25 (9), 2017-2035 (2020).
  19. Razak, K. A., Dominick, K. C., Erickson, C. A. Developmental studies in fragile X syndrome. Journal of Neurodevelopmental Disorders. 12 (1), 13(2020).
  20. Wang, X., Zorio, D. A. R., Schecterson, L., Lu, Y., Wang, Y. Postsynaptic FMRP regulates synaptogenesis in vivo in the developing cochlear nucleus. Journal of Neuroscience. 38 (29), 6445-6460 (2018).
  21. Wang, X., et al. Temporal-specific roles of fragile X mental retardation protein in the development of the hindbrain auditory circuit. Development. 147 (21), (2020).
  22. Rubel, E. W., Fritzsch, B. Auditory system development: primary auditory neurons and their targets. Annual Review of Neuroscience. 25, 51-101 (2002).
  23. Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. Embryonic origins of auditory brain-stem nuclei in the chick hindbrain. Developmental Biology. 224 (2), 138-151 (2000).
  24. Chervenak, A. P., Hakim, I. S., Barald, K. F. Spatiotemporal expression of Zic genes during vertebrate inner ear development. Developmental Dynamics. 242 (7), 897-908 (2013).
  25. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
  26. Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem. Journal of Visualized Experiments. (124), e56628(2017).
  27. Evsen, L., Doetzlhofer, A. Gene transfer into the chicken auditory organ by in ovo micro-electroporation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53864(2016).
  28. Schecterson, L. C., Sanchez, J. T., Rubel, E. W., Bothwell, M. TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis. Journal of Neuroscience. 32 (40), 14000-14009 (2012).
  29. Wang, X. Y., et al. High glucose environment inhibits cranial neural crest survival by activating excessive autophagy in the chick embryo. Scientific Reports. 5, 18321(2015).
  30. Yu, X., Wang, X., Sakano, H., Zorio, D. A. R., Wang, Y. Dynamics of the fragile X mental retardation protein correlates with cellular and synaptic properties in primary auditory neurons following afferent deprivation. Journal of Comparative Neurology. 529 (3), 481-500 (2021).
  31. Li, H., et al. Islet-1 expression in the developing chicken inner ear. Journal of Comparative Neurology. 477 (1), 1-10 (2004).
  32. Carr, C. E., Boudreau, R. E. Central projections of auditory nerve fibers in the barn owl. Journal of Comparative Neurology. 314 (2), 306-318 (1991).
  33. Sandell, L. L., Butler Tjaden, N. E., Barlow, A. J., Trainor, P. A. Cochleovestibular nerve development is integrated with migratory neural crest cells. Developmental Biology. 385 (2), 200-210 (2014).
  34. Cramer, K. S., Bermingham-McDonogh, O., Krull, C. E., Rubel, E. W. EphA4 signaling promotes axon segregation in the developing auditory system. Developmental Biology. 269 (1), 26-35 (2004).
  35. Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1. Journal of Neuroscience. 33 (9), 3879-3890 (2013).
  36. Curnow, E., Wang, Y. New animal models for understanding FMRP functions and FXS pathology. Cells. 11 (10), 1628(2022).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

FMRPEGFPnucleus magnocellularis

Похожие статьи