Method Article

Чувствительный визуальный метод обнаружения бактерий, продуцирующих сероводород

DOI:

10.3791/64201

⸱

June 27th, 2022

 , 
1Department of Microbiology, School of Life Science and Technology, China Pharmaceutical University, 2National Experimental Teaching Demonstration Center of Biopharmaceuticals, China Pharmaceutical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протокол для обнаружения бактерий, продуцирующих сероводород, с модифицированным протоколом, используемым для осаждения сульфида висмута (BS). Ключевые преимущества этого метода заключаются в том, что он легко поддается оценке и не требует специализированного оборудования.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сероводород (H2S) представляет собой токсичный газ, образующийся бактериями при протеолизе серосодержащих аминокислот и белков, который играет важную роль в здоровье человека. Производственный тест H2S является одним из важных тестов на биохимическую идентификацию бактерий. Традиционные методы не только утомительны и трудоемки, но и склонны к торможению роста бактерий из-за токсического действия солей тяжелых металлов в серосодержащей среде, что часто приводит к негативным результатам. Здесь мы разработали простой и чувствительный метод обнаружения H2S в бактериях. Этот метод представляет собой модифицированную версию осаждения сульфида висмута (BS), в которой используются 96-луночные прозрачные микротитровальные планшеты. Бактериальную культуру объединяли с раствором висмута, содержащим L-цистеин, и культивировали в течение 20 мин, в конце которого наблюдался черный осадок. Предел визуального обнаружения для H 2 S составлял0,2мМ. На основе визуального изменения цвета может быть достигнуто простое, высокопроизводительное и быстрое обнаружение бактерий, продуцирующих H2S. Таким образом, этот метод может быть использован для идентификации продукции H2S в бактериях.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Бактерии, продуцирующие сероводород, могут использовать серосодержащие аминокислоты и белки для производства сероводорода (H2S). ПродукцияH2S обычно происходит у грамотрицательных бактерий семейства Enterobacteriaceae, а также у членов Citrobacter spp., Proteus spp., Edwardsiella spp. и Shewanella spp.1. Эти бактерии обладают способностью восстанавливать сульфат до сероводорода (H2S) для получения энергии. Сероводород участвует в развитии бактериальной лекарственной устойчивости. H2S защищает бактерии от токсичности активных форм кислорода (АФК), тем самым противодействуя антибактериальному действию антибиотиков 2,3. H2S также оказывает важное физиологическое влияние на поддержание гомеостаза. Было показано, что на супрафизиологическом уровнеH2S глубоко токсичен для организма. В организме человекаH2S играет еще одну роль в качестве газовой сигнальной молекулы, которая участвует во множестве физиологических и патологических процессов. H2Sможет регулировать систолическую функцию сердца и играет важную физиологическую роль в расслаблении кровеносных сосудов, ингибировании ремоделирования сосудов и защите миокарда 4,5. H2Sтакже играет важную роль в регуляции нервной системы и пищеварительного тракта 6,7. Было обнаружено, что при воздействии бактерицидных антибиотиков бактерии продуцируют летальные активные формы кислорода (АФК), что приводит к гибели клеток 8,9,10,11.

Как распространенный биохимический тест на микробиологических лабораторных курсах, сероводородный тест является важным экспериментом по идентификации бактерий, особенно бактерий семейства Enterobacteriaceae. В настоящее время испытание сероводородом обычно проводится на большом количестве серосодержащих аминокислот и среде ацетата свинца, инокулированных тестируемыми бактериями. После периода инкубации (2-3 дня) результаты оцениваются путем наблюдения за тем, не почернела ли питательная среда или бумажная полоска из ацетата свинца из-за образования ацетатасвинца 11. Однако эти традиционные методы не только утомительны и трудоемки, но и склонны к торможению роста бактерий из-за токсического действия солей тяжелых металлов в серосодержащей среде, что часто приводит к негативным результатам. Разработан метод на основе висмута для обнаружения H2 S12,13. H2S может реагировать с висмутом с образованием осаждения черного сульфида висмута. Для того, чтобы провести реформу этого биохимического теста, необходимо создать простой и быстрый метод без побочных эффектов на рост бактерий. Здесь мы разработали простой метод обнаружения бактерий, продуцирующих сероводород, выращенных в среде in vitro, с использованием сульфида висмута в качестве субстрата в формате 96-луночного микротитровального планшета.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Бактериальные штаммы

ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого эксперимента использовали девять стандартных штаммов, включая Salmonella paratyphi A, Salmonella paratyphi B, Fusobacterium nucleatum, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa PAO1, Aeromonas hydrophila YJ-1, Proteus vuigaris и Klebsiella pneumoniae (таблица 1). Salmonella paratyphi A, Fusobacterium nucleatum, Pseudomonas aeruginosa и Proteus vuigaris могут продуцировать H2S, как описано в предыдущей литературе1.

  1. Подготовка бактериального посева
    1. Перенесите одну бактериальную колонию Salmonella paratyphi A, Salmonella paratyphi B, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa PAO1, Aeromonas hydrophila YJ-1 и Klebsiella pneumoniae из агаровой пластины Лурия-Бертани (LB) в 100 мл среды LB и культивируйте при 37 ° C в течение 12-16 ч до тех пор, пока бактериальная концентрация не составит около 1 x 109 клеток / мл (как указано OD600 = 1).
    2. Перенесите одну бактериальную колонию Fusobacterium nucleatum и Proteus vuigaris из агаровых пластин из триптиказного соевого бульона (TSB) в 100 мл среды TSB и культивируйте при 37 °C анаэробно в течение 24 ч до тех пор, пока бактериальная концентрация не составит около 1 x10,9 клеток/мл (как указано OD600 = 1).

2. Анализ обнаружения H2S

  1. Испытание на производство сероводорода
    1. Смешайте 100 мкл бактериальной культуры со 100 мкл вновь приготовленного раствора висмута (рН 8,0; 10 мМ хлорида висмута (III), 0,4 М триэтаноламина-HCl, 20 мМ пиридоксаль-5-фосфата моногидрата, 20 мМ ЭДТА и 40 мМ L-цистеина) в 96-луночных микротитровальных планшетах и культуре в течение 20 мин при 37 °C. Для каждого бактериального штамма проводите анализ в трех экземплярах.
    2. Через 20 минут проверьте, не изменилось ли цвет. Если цвет раствора меняется со светло-желтого на черный, это указывает на то, что бактерии способны продуцировать H2S. Повторите это измерение 3 раза.
  2. Чувствительность метода
    1. Определяют чувствительность метода, используя различные концентрации гидросульфида натрия (NaHS): 2 мМ, 1 мМ, 0,8 мМ, 0,6 мМ, 0,4 мМ, 0,2 мМ, 0,1 мМ и 0 мМ, смешанные с раствором BS 14.
    2. Определите наличие HS−/S2−, наблюдая за образованием черного осадка BS. Оцените цвет лунок, используя визуальную шкалу от отсутствия цветообразования (-) до получения самого темного черного цвета (++++++).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Обнаружение бактерий, продуцирующих сероводород
Эффективность теста H2S была исследована с использованием чистых культур выбранных бактериальных штаммов, как указано в таблице 1. Результаты показали, что Salmonella paratyphi B, Fusobacterium nucleatum, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa и Proteus vuigaris могут продуцироватьH2S с черным осадком BS, в то время как Salmonella paratyphi A, Staphylococcus au...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Тест на производство сероводорода является одним из традиционных фенотипических тестов для идентификации и дифференциации бактериальных штаммов. Многие виды бактерий могут производить сероводород в своей естественной среде, например, в водной воде. Эти виды бактерий включают Salmonella sp., Citrobacter sp., Proteus sp., Pseudomonas sp., некоторые штаммы Klebsiella sp., Escherichia coli и некоторые виды анаэробных Clostridia15,16

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано Приоритетной академической программой развития высших учебных заведений провинции Цзянсу (PAPD) и Исследовательским проектом по реформе преподавания Китайского фармацевтического университета (2019XJYB18).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Хлорид висмута (III)Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd7787-60-2
EDTANanjing Chemical Reagent Co., Ltd60-00-4
Enterococcus faecalis  ATCC 19433
Fusobacterium  nucleatum  ATCC 25586
Klebsiella pneumoniae  ATCC 43816
L-цистеинAmresco52-90-4
Proteus  vuigaris  CMCC 49027
Salmonella paratyphi ACMCC50001
Salmonella paratyphi BCMCC50094
Staphylococcus  Ауреус ATCC 25923
Триэтаноламин-HClШанхайская биохимическая технология Аладдин Ко., Лтд.637-39-8

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thompson, L. S. The group of hydrogen sulphide producing bacteria. Journal of Medical Research. 42 (184), 383-389 (1921).
  2. Ono, K., et al. Cysteine hydropersulfide inactivates β-lactam antibiotics with formation of ring-opened carbothioic s-acids in bacteria. ACS Chemical Biology. 16 (4), 731-739 (2021).
  3. Mironov, A., et al. Mechanism of H2S-mediated protection against oxidative stress in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (23), 6022-6027 (2017).
  4. Shen, Y., Shen, Z., Luo, S., Guo, W., Zhu, Y. The cardioprotective effects of hydrogen sulfide in heart diseases: From molecular mechanisms to therapeutic potential. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2015, 925167(2015).
  5. Salloum, F. N. Hydrogen sulfide and cardioprotection-mechanistic insights and clinical translatability. Pharmacology & Therapeutics. 152, 11-17 (2015).
  6. Wallace, J. L., Wang, R. Hydrogen sulfide-based therapeutics: Exploiting a unique but ubiquitous gasotransmitter. Nature Reviews. Drug Discovery. 14 (5), 329-345 (2015).
  7. Wu, D., et al. Role of hydrogen sulfide in ischemia-reperfusion injury. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. , 186908(2015).
  8. Truong, D. H., Eghbal, M. A., Hindmarsh, W., Roth, S. H., O'Brien, P. J. Molecular mechanisms of hydrogen sulfide toxicity. Drug Metabolism Reviews. 38 (4), 733-744 (2006).
  9. Shatalin, K., et al. Inhibitors of bacterial H2S biogenesis targeting antibiotic resistance and tolerance. Science. 372 (6547), 1169-1175 (2021).
  10. Frávega, J., et al. Salmonella Typhimurium exhibits fluoroquinolone resistance mediated by the accumulation of the antioxidant molecule H2S in a CysK-dependent manner. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 71 (12), 3409-3415 (2016).
  11. Luhachack, L., Nudler, E. Bacterial gasotransmitters: An innate defense against antibiotics. Current Opinion in Microbiology. 21, 13-17 (2014).
  12. Yoshida, A., et al. Hydrogen sulfide production from cysteine and homocysteine by periodontal and oral bacteria. Journal of Periodontology. 80 (11), 1845-1851 (2009).
  13. Basic, A., Blomqvist, S., Carlén, A., Dahlén, G. Estimation of bacterial hydrogen sulfide production in vitro. Journal of Oral Microbiology. 7, 28166(2015).
  14. Rosolina, S. M., Carpenter, T. S., Xue, Z. L. Bismuth-based, disposable sensor for the detection of hydrogen sulfide gas. Analytical Chemistry. 88 (3), 1553-1558 (2016).
  15. Barton, L. L., Fauque, G. D. Biochemistry, physiology and biotechnology of sulfate-reducing bacteria. Advances in Applied Microbiology. 68, 41-98 (2009).
  16. Shatalin, K., Shatalina, E., Mironov, A., Nudler, E. H2S: A universal defense against antibiotics in bacteria. Science. 334 (6058), 986-990 (2011).
  17. Schnabel, B., Caplin, J. L., Cooper, I. R. Modification of the H2S test to screen for the detection of sulphur- and sulphate-reducing bacteria of faecal origin in water. Water Supply. 21 (1), 59-79 (2021).
  18. Netzer, R., Ribičić, D., Aas, M., Cavé, L., Dhawan, T. Absolute quantification of priority bacteria in aquaculture using digital PCR. Journal of Microbiological Methods. 183, 106171(2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hydrogen Sulfide DetectionH2S Producing BacteriaBismuth Sulfide PrecipitationVisual Detection MethodMicrotiter Plate AssayBacterial Biochemical IdentificationSulfur Amino Acid MetabolismBlack Precipitate FormationHigh Throughput ScreeningBacterial Culture Assay

Related Articles