Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Митохондриальный перенос из мезенхимальных стволовых клеток, полученных из жировой ткани мыши, в состарившиеся ооциты мышей

1.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/64217

⸱

6 января 2023 г.

 ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, the Third Affiliated Hospital, Soochow University, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Nanjing First Hospital, Nanjing Medical University, 3Center for Reproductive Medicine and Obstetrics and Gynecology, Nanjing Drum Tower Hospital, Nanjing University Medical School

В этой статье

Краткое содержание

В этой статье мы описываем выделение митохондрий из мезенхимальных стволовых клеток, полученных из жира мыши, а затем перенос митохондрий в состаренные ооциты мышей для улучшения качества ооцитов.

Аннотация

Из-за снижения количества и качества ооцитов, связанного с возрастом, фертильность женщин старше 35 лет резко снизилась. Молекулярные механизмы, поддерживающие качество ооцитов, остаются неясными, поэтому в настоящее время трудно увеличить рождаемость женщин старше 35 лет. Ооциты содержат больше митохондрий, чем любой тип клеток в организме, и любая митохондриальная дисфункция может привести к снижению качества ооцитов. В 1990-х годах перенос цитоплазматических ооцитов привел к большим успехам в репродукции человека, но сопровождался этическими спорами. Ожидается, что аутологичная митохондриальная трансплантация станет полезным методом для повышения качества ооцитов, которое уменьшилось из-за возраста. В настоящем исследовании мы использовали стволовые клетки, полученные из жировой ткани от старых мышей, в качестве донора митохондрий для повышения качества ооцитов старых мышей. Дальнейшее развитие технологии аутологичного митохондриального переноса обеспечит новый и эффективный метод лечения бесплодия у пожилых женщин.

Введение

Одним из важных факторов, влияющих на женскую фертильность, является старение ооцитов; Снижение качества ооцитов является основной причиной бесплодия у женщин пожилого возраста. Тем не менее, основная причина старения ооцитов и молекулярный механизм, регулирующий качество ооцитов, до сих пор неясны. Предыдущие исследования показали, что как количество, так и качество митохондрий участвуют в контроле качества ооцитов и эмбриональном развитии 1,2,3. Уменьшение количества и качества митохондрий тесно связано со старением3.

Было предпринято множество попыток улучшить функцию митохондрий в стареющих ооцитах, включая пищевую добавку митохондрий и перенос митохондрий. Хорошо известные, эффективные пищевые добавки митохондрий включают коэнзим Q10 (CoQ10), альфа-липоевую кислоту (α-LA) и ресвератрол (RSV)4. Исследования показали, что добавки с коэнзимом Q10 могут не только улучшить возрастное снижение количества и качества ооцитов, но и способствовать нормальному развитию и овуляции ооцитов5. α-ЛК замедляет снижение качества ооцитов, связанное со старением и метаболическим фенотипом пациенток с синдромом поликистозных яичников (СПКЯ)6,7. Ресвератрол может уменьшать количество ооцитов с аномальными веретенами и неправильным выравниванием хромосом, увеличенным у стареющих мышей, при этом влияя на эмбриональное развитие дозозависимымобразом. Однако, поскольку клинический эффект пищевых добавок митохондрий не достиг ожидаемого уровня, необходимо изучить другие эффективные методы лечения.

Первая попытка переноса митохондрий была предпринята в 1997 году. Перенос цитоплазмы молодого донора в состаренные ооциты реципиента улучшил качество ооцитов у пациентов в возрасте, которые успешно родили здоровыхдетей9, что и послужило обоснованием использования данной методики. Однако аллогенный цитоплазматический перенос ооцитов не может быть применен в клинической практике по двум основным причинам – проблеме генетической гетерогенности и регуляторным вопросам, вызванным трансплантацией донорских митохондрий. Предыдущее исследование показало, что трансплантация митохондрий аутологичных клеток может улучшить качество ооцитов, развитие эмбрионов и фертильность старых мышей10, что не имело этических проблем или проблем генетической гетерогенности и решило некоторые проблемы, вызванные переносом цитоплазмы донорских ооцитов в ооциты реципиента 10,11.

Между тем, перенос митохондрий аутологичными клетками превосходил влияние предыдущих пищевых добавок митохондрий на улучшение качестваооцитов11. Таким образом, трансплантация митохондриальных клеток с помощью аутологичных клеток является подходящим выбором для клинического применения данной технологии12. Стволовые клетки, полученные из жировой ткани (ADSC), могут быть получены с помощью минимально инвазивной технологии, их легко изолировать и культивировать, и они могут быть идеальными «семенными» клетками для регенеративной медицины. Митохондрии богаты ADSC, и функция митохондрий не снижается с возрастом, что позволяет предположить, что ADSC являются отличным источником митохондрий13,14. В этом протоколе мы представляем метод переноса митохондрий мезенхимальных стволовых клеток, полученных из жировой ткани мыши, в состаренные ооциты мышей для улучшения качества ооцитов. Это полезная модель для технологии аутологичного митохондриального переноса человеческого ADSC.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все описанные эксперименты на животных были одобрены Комитетом по этике исследований на животных Третьей аффилированной больницы Университета Сучжоу. Все операции проводятся в соответствии с соответствующими рекомендациями агентства по уходу и использованию животных и национальными руководящими принципами. Подробные сведения обо всех материалах, инструментах и реагентах, используемых в этом протоколе, см. в Таблице материалов .

1. Выделение и характеристика мезенхимальных стволовых клеток (ADSC) из жировой ткани старых мышей

  1. Принесите в жертву старейших мышей (10 месяцев, в среднем 3 года) при вывихе шейки матки под пентобарбитальной натриевой анестезией и замочите их в 75% спирте в течение 5 минут перед выделением жировой ткани.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Замачивание в 75% спирте в течение 5 минут может эффективно снизить загрязнение первичных клеток.
  2. Сделайте разрез 2 см на коже на двусторонней паховой поверхности, обнажите подкожный жир и с помощью пинцета изолируйте подкожный жир. Двусторонний паховый жир у мышей соберут с помощью стерилизованных офтальмологических ножниц (избегайте разрезания подкожной клетчатки). Поместите жировую ткань в стерильную центрифужную пробирку объемом 15 мл на льду и немедленно транспортируйте ее в лабораторию клеточных культур.
  3. Перенесите жировую ткань в 6-луночный планшет, промойте его 3 раза фосфатно-солевым буфером (PBS), содержащим 100 Ед/мл пенициллина и стрептомицина. Удалите кровеносные сосуды, жировую фасцию и соединительную ткань под жировой тканью и разрежьте их на кусочки размером ~0,5 см x 0,5 см x 0,5 см.
    Примечание: При выделении жировых стволовых клеток часто происходит контаминация эндотелиальных клеток сосудов. Удаление кровеносных сосудов из жировой ткани может уменьшить загрязнение эндотелиальных клеток сосудов.
  4. Перенесите измельченную жировую ткань в тот же объем раствора коллагеназы I типа (0,1% конечная концентрация коллагеназы I типа) и разварите при 37 °C в течение 30 минут.
  5. Добавьте равный объем полной питательной среды (среда DMEM F-12, содержащая 10% фетальной бычьей сыворотки) для нейтрализации коллагеназы типа I, центрифугируйте при 600 × г в течение 10 минут и выбросьте надосадочную жидкость и жировую ткань.
  6. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в полной питательной среде. Удалите непереваренную ткань путем фильтрации через клеточное сетчатое фильтр 40 мкм, а затем центрифугируйте при 600 × г в течение 5 минут.
  7. Повторно суспендируйте клеточную суспензию 5 мл полной питательной среды и с помощью пипетки объемом 1 мл аккуратно пипетируйте вверх и вниз с образованием одноклеточной суспензии. Проверьте клеточную суспензию под микроскопом, поместив аликвоту на гемоцитометр, чтобы подтвердить, что там есть только одиночные клетки, без каких-либо агрегатов. Добавьте суспензию одиночных клеток в колбу для клеточных культур диаметром 25см2 и культивируйте в инкубаторе с 5% содержаниемCO2 при температуре 37 °C.
  8. Смените питательную среду через 48 часов. Продолжайте менять питательную среду каждые 2-3 дня.
  9. Через 7-10 дней отделите клетки для пропускания клеток, когда их слияние достигнет 80%-90%. Удалите всю питательную среду и промойте клетки 2 мл PBS. Затем добавьте 2 мл 0,05% трипсина/ЭДТА для проведения диссоциации клеток15,16.
  10. Добавьте адипогенную индукционную среду в течение 14 дней, чтобы вызвать дифференцировку ADSC в адипокты. Добавьте остеогенную индукционную среду в течение 28 дней к ADSC, нанесенным на 24-луночные планшеты, покрытые 2% желатином, чтобы индуцировать их дифференцировку в остеобласты. Для нейронной дифференцировки культивируют ADSC с помощью нервной индукционной среды, а затем детектируют нейрон-специфичную енолазу и полипептид медиатора нейрофиламентов с помощью иммунофлуоресценции15.
    1. Зафиксируйте клетки в 4% параформальдегиде на 30 мин при комнатной температуре с последующей пермеабилизацией 0,5% Triton X-100 в PBS в течение 15 мин.
    2. После блокирования 3% БСА в PBS инкубируют клетки с первичными антителами (см. Таблицу материалов), разведенными в блокирующем растворе при 4 °C в течение ночи.
    3. Инкубируйте клетки со вторичными антителами в течение 45 минут, а затем окрашивайте их DAPI в течение 10 минут. Затем исследуйте клетки с помощью флуоресцентного микроскопа.
  11. Соберите суспензию ADSC для одиночных клеток с использованием 0,05% трипсина/ЭДТА, центрифугируйте при 600 × г в течение 5 минут при комнатной температуре и повторно суспендируйте в PBS для регулировки плотности клеток до 1 × 106/мл. Аликвотируют клеточную суспензию в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл (100 мкл/пробирку) и добавляют меченые FITC моноклональные антитела кроликов против мышей CD29, CD90, CD34 и HLA-DR с концентрацией антител 0,5 мкг/мл. Обработайте контрольную группу таким же объемом IgG FITC кролика, инкубируйте на льду в течение 30 минут и промойте PBS для удаления неконъюгированного антитела. Определение поверхностных маркеров ADSC с помощью проточной цитометрии13.

2. Выделение митохондрий из жировых стволовых клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Все операции по выделению митохондрий должны проводиться на льду.

  1. Когда ADSCs вырастут до 90% плотности, расщепляют клетки с 2 мл 0,05% трипсина/ЭДТА, центрифугируют при 600 × г в течение 5 мин, собирают и подсчитывают клетки, и берут 1 × 10-7 клеток для каждой экстракции.
  2. Ресуспендируйте клетки в 2 мл буфера для экстракции митохондрий (для приготовления буфера: 10 мл 0,1 М Трис-МОПС, 1 мл 0,1 М EGTA/Трис и 20 мл 1 М сахарозы; доведите объем до 100 мл дистиллированной водой и отрегулируйте рН до 7,4) с 1х коктейлем ингибиторов протеазы после промывания 2 мл стерильного PBS, А затем инкубировать на льду в течение 5 минут.
  3. Гомогенизируйте клетки в 20-30 раз с помощью стеклянного гомогенизатора (2,0 мл) и проверьте степень гомогенизации путем окрашивания трипановым синим.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Доля окрашенных клеток должна составлять ~80%. Чрезмерная гомогенизация повредит структуру митохондрий.
  4. Центрифугируйте гомогенат клеток при 600 × г в течение 15 мин, поместите надосадочную жидкость в новую, предварительно охлажденную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и повторите операцию один раз.
  5. Центрифугируйте надосадочную жидкость при давлении 7 500 × г в течение 15 минут и выбросьте надосадочную жидкость. Промойте митохондриальный осадок и повторно суспендируйте его, добавив ~100 мкл предварительно охлажденного митохондриального инъекционного буфера (225 мМ маннитола, 75 мМ сахарозы, 10 мМ KCl, 10 мМ Tris-HCl и 5 мМ KH2PO4, pH 7,2) в концентрации 1-5 мг/мл (общая концентрация белка). Транспортируйте митохондриальную суспензию по льду.
  6. Анализ функции и чистоты выделенных митохондрий с помощью проточного цитометрического анализа JC-1 и вестерн-блоттинга (VDAC1, β-актин и ламин В)13.
    1. Разделите выделенные митохондрии на три группы: диметилсульфоксид (ДМСО), окрашенный JC-1, и JC-1, окрашенный 30-минутной предварительной обработкой карбонилцианидом 3-хлорфенилгидразона (CCCP).
    2. После центрифугирования при 7 500 × г выбросьте надосадочную жидкость и приостановите буфер.
    3. Захват интенсивности флуоресценции мономеров JC-1 (канал FITC) и агрегатов (канал PE), которые были захвачены с помощью проточной цитометрии. Оцените потенциалы изолированных митохондриальных мембран путем измерения отношений средней интенсивности флуоресценции ПЭ-канала и канала FITC.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте вышеуказанные действия в темноте.

3. Суперстимуляция яичников

  1. Внутрибрюшинно ввести 10-месячной самке мышей C57BL/6 10 МЕ гонадотропина сыворотки крови беременной кобылы (PMSG) для суперовуляции. Через 48 ч внутрибрюшинно ввести 10 МЕ хорионического гонадотропина человека (ХГЧ).
  2. Через 13 ч после инъекции ХГЧ разорвите опухшую маточную трубу микроскопическим пинцетом. Выпустите кумулюсные комплексы из опухшей маточной трубы. Кумулюсные клетки растворить в среде М2 гиалуронидазой (0,3 мг/мл) при 37 °С.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время растворения составляет менее 5 минут. Сведите к минимуму время, в течение которого кумулюсный комплекс подвергается воздействию гиалуронидазы, так как длительное воздействие может нарушить потенциал развития ооцитов.

4. Перенос митохондрий вместе с ИКСИ

  1. Поместите сперматозоиды без хвостика в митохондриальную жидкость. Получить сперму без хвостика путем разреза с помощью ультразвука17. Поместите сперматозоиды без хвоста в митохондриальную жидкость таким образом, чтобы в 50 мкл митохондриальной жидкости было 100 сперматозоидов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку митохондриальная суспензия является слегка вязкой и нестабильной in vitro, завершите инъекцию в течение 30 минут и немедленно смените иглу для микроинъекций, как только она закупорится. Оптимальный внутренний диаметр иглы для микроинъекций составляет 5 мкм.
  2. Введите ~2 мл буфера митохондриального дыхания или митохондриальной суспензии со сперматозоидами в ооциты с помощью микроинъектора под перевернутым микроскопом (200x; см. Таблицу материалов) в течение 30 минут в соответствии с протоколом Хирамото, описанным Mehlmann и Kline10,18.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Введенная митохондриальная суспензия составляет 1%-3% от общего объема ооцитов. Контролируйте объем (1%-3%) митохондриальной суспензии в цитоплазме, чтобы обеспечить консистенцию инъекции.
  3. После инъекции оплодотворенные яйцеклетки поместить в среду М2 для уравновешивания на 15 минут, а выжившие оплодотворенные яйцеклетки перенести в культуральную среду М16.
  4. Исследуйте выжившие оплодотворенные яйца, наблюдая за гладкой морфологией, образованием пронуклеаров и выходом второго полярного тела19. Наблюдайте, фотографируйте и подсчитывайте эмбрионы в 09:00 и 18:00 каждый день в течение 4 дней. Наконец, соберите и заморозьте бластоцисты и храните их в холодильнике при температуре -80 °C для определения числа копий АТФ и мтДНК для оценки количества и улучшения митохондриальной трансплантации.
    1. Приготовьте стандартную плазмиду (плазмиду для абсолютного количественного определения, как описано ранее13) для определения числа митохондриальных копий в соответствии с числом копий 1 ×10 7, 1 × 106, 1 × 105, 1 × 104, 1 × 103, 1 × 102 и 1 × 101. Перенесите эмбрионы в стерилизационную пробирку и добавьте 20 мкл буфера для лизата, чтобы высвободить митохондриальную ДНК. Затем инактивируйте протеазу в лизате при 55 °C в течение 20 мин и 95 °C в течение 10 мин.
    2. Определить число копий мтДНК методом флуоресцентной количественной ПЦР с использованием следующей установки: 5 мкл смеси для ПЦР, 0,5 мкл праймера В6, 0,5 мкл праймера В6, 2 мкл продукта пиролиза и 2 мкл ddH2O. Соблюдайте условия ПЦР: стадия 1, 95 °С в течение 3 мин; stage2, 95 °C в течение 30 с, 58 °C в течение 30 с и 72 °C в течение 30 с; Повторите цикл 40 раз.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В этом протоколе мы выделили и охарактеризовали ADSC из мышиного жира (рис. 1). Для получения изолированных митохондрий клеточную мембрану необходимо нарушить с помощью стеклянного гомогенизатора. (Рисунок 2А). Важно получить однородную митохондриальную фракцию без больших комков, чтобы микроинъекционная трубка не блокировалась. Сначала необходимо использовать 200 μл, а затем 10 μл наконечники для пипеток для мягкой ресуспендирования гомогенатов; Наконец, игла 2...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Ооциты содержат больше митохондрий, чем любой тип клеток в организме, с числом копий ~1-5 ×10 5 мтДНК. Митохондрии необходимы для созревания ооцитов, оплодотворения и эмбрионального развития, поэтому любая митохондриальная дисфункция может привести к снижению качества ооцитов. Снижение количества и качества митохондрий тесно связано с физиологическим старением. В этом протоколе был представлен простой метод выделения митохондрий из ADSC старых мышей и переноса в старые ооциты ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Авторы выражают признательность за поддержку со стороны Национального фонда естественных наук Китая (82001629 до X.Q.S.), Проекта фундаментальных исследований Бюро науки и технологий Чанчжоу в рамках гранта No CJ20200110 (Y.J.Y.), Молодежной программы Фонда естественных наук провинции Цзянсу (BK20200116 до X.Q.S.) и Финансирования постдокторских исследований провинции Цзянсу (2021K277B to X, К.С.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,05% трипсин/ЭДТА,Gibco25300054Клеточная культура
  4% параформальдегидbeyotimeP0099иммунофлуоресценция
40 мкм; m клеточный фильтрCorning352340ADSC изоляция
адипогенная индукцияCyagenHUXXC-90031Многонаправленная дифференцировка
Ализарин красный окрашивающий растворSigmaA5533Многонаправленная дифференцировка
Антитело против CD29BD Biosciencesанализ 558741 потока
Антитело против CD34BD Biosciences560942анализ потока
Антитела против CD90BD Biosciences553016анализ потока
Антитела против HLA-DRBD Biosciences555560анализ
потока&бета;-актинаAbcamab-8226Митохондриальный функциональный тест
BSASigma V900933иммунофлуоресценция
CCCPSolarbioC6700митохондрии JC-1 анализ потока
ChamQ Universal SYBR qPCR Master MixVazymeQ711qPCR
коллагеназа типа ISigmaSCR103ADSC изоляция
DAPI InvitrogenD1306иммунофлуоресценция
DMEM-F12Gibco11320033клеточная культура
DMSOSigma276855митохондрии JC-1 анализ потока
EGTASigma324626выделение митохондрий
FBSGibco10100147клеточной культуры
Проточная цитометрияBD BiosciencesFACSКанто& торговля; IIХарактеристики
флуоресцентного микроскопаleicaDM2500иммунофлуоресцентный
желатинSigma48722разнонаправленной дифференцировки
SangonF519062Выделение митохондрий
hCGAibeiM2520Суперстимуляция яичников
гиалуронидазаSigmaH1115000Суперстимуляция яичников
  Инвертированный микроскопOlympusIMT-2Набор для микроинъекции
изолированных митохондрийSigmaCS0760Анализ потока митохондрий JC-1 JC-1
SigmaT4069Тест функции митохондрий
KClSigmaP5405Перенос митохондрий
KH2PO4SigmaP5655Перенос
митохондрийLaminBAbcamab-16048Митохондриальный функциональный тест
M16 Medium SigmaM7292эмбриональная клеточная культура
M2 MediumSigmaM7167эмбриональная клеточная культура
маннитолSigmaM9546Митохондриальный перенос
МикроинъекторOlympus+ eppendorfIX73Митохондриальный перенос
MitoTracker красныйInvitrogenM22425Окрашивание митохондрий
MOPSSigmaM1442Выделение митохондрий
медиатор нейрофиламентов полипептид (NFM)Santa Cruz Biotechnologysc-16143Многонаправленная дифференцировка
нейрогенная индукцияGibcoA1647801Многонаправленная дифференцировка
Нейрон-специфическая энолаза (NSE)Santa Cruz Biotechnologysc-292097Масло многонаправленной дифференцировки
красное O СангонE607319масло адипогенной дифференцировки
красное O растворSigmaO1516Многонаправленная дифференцировка
остеогенная индукцияCyagenHUXXC-90021Многонаправленная дифференцировка
PBS (фосфатно-солевой буфер)HycloneSH30256.LSКлеточная культура
Пенициллин и стрептомицинГиклонSV30010Клеточная культура
PMSGAibeiM2620Суперстимуляция яичников
Протеаза Коктейль ингибиторовSigmaP8340Выделение митохондрий
сахарозойSigmaV900116Выделение митохондрий
TrisSigma 648314Выделение митохондрий
Tris-HClSigma108319перенос митохондрий
Triton X-100beyotimeP0096иммунофлуоресценция
VDACAbcamab-14734Митохондриальный функциональный тест
ADSC Трубка для гомогенизации стекла

Ссылки

  1. Sheng, X., et al. The mitochondrial protease LONP1 maintains oocyte development and survival by suppressing nuclear translocation of AIFM1 in mammals. eBioMedicine. 75, 103790(2022).
  2. Qi, L., et al. Mitochondria: the panacea to improve oocyte quality. Annals of Translational Medicine. 7 (23), 789(2019).
  3. Babayev, E., Seli, E. Oocyte mitochondrial function and reproduction. Current Opinion in Obstettrics & Gynecology. 27 (3), 175-181 (2015).
  4. Bentov, Y., Esfandiari, N., Burstein, E., Casper, R. F. The use of mitochondrial nutrients to improve the outcome of infertility treatment in older patients. Fertility and Sterility. 93 (1), 272-275 (2010).
  5. Ben-Meir, A., et al. Coenzyme Q10 restores oocyte mitochondrial function and fertility during reproductive aging. Aging Cell. 14 (5), 887-895 (2015).
  6. He, Y., Wang, Y., Zhang, H., Zhang, Y., Quan, F. Alpha-lipoic acid improves the maturation and the developmental potential of goat oocytes in vitro. Reproduction in Domestic Animals. 56 (4), 545-554 (2021).
  7. Gunalan, E., Yaba, A., Yilmaz, B. The effect of nutrient supplementation in the management of polycystic ovary syndrome-associated metabolic dysfunctions: A critical review. Journal of the Turkish German Gynecological Association. 19 (4), 220-232 (2018).
  8. Liu, M., et al. Resveratrol protects against age-associated infertility in mice. Human Reproduction. 28 (3), 707-717 (2013).
  9. Cohen, J., Scott, R., Schimmel, T., Levron, J., Willadsen, S. Birth of infant after transfer of anucleate donor oocyte cytoplasm into recipient eggs. Lancet. 350 (9072), 186-187 (1997).
  10. Wang, Z. B., et al. Transfer of autologous mitochondria from adipose tissue-derived stem cells rescues oocyte quality and infertility in aged mice. Aging. 9 (12), 2480-2488 (2017).
  11. Mobarak, H., et al. Autologous mitochondrial microinjection; a strategy to improve the oocyte quality and subsequent reproductive outcome during aging. Cell & Bioscience. 9, 95(2019).
  12. Bagheri, H. S., et al. Mitochondrial donation in translational medicine; from imagination to reality. Journal of Translational Medicine. 18 (1), 367(2020).
  13. Sheng, X., et al. Mitochondrial transfer from aged adipose-derived stem cells does not improve the quality of aged oocytes in C57BL/6 mice. Molecular Reproduction & Development. 86 (5), 516-529 (2019).
  14. Arana, M., Mazo, M., Aranda, P., Pelacho, B., Prosper, F. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells: isolation, expansion, and characterization. Methods in Molecular Biology. 1036, 47-61 (2013).
  15. Yang, Y., Zhang, C., Sheng, X. Isolation and culture of three kinds of umbilical cord mesenchymal stem cells. Journal of Visualized Experiments. (186), e64065(2022).
  16. Yang, Y., et al. Transplantation of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells on a collagen scaffold improves ovarian function in a premature ovarian failure model of mice. In Vitro Cellular & Developmental Biology Animal. 55 (4), 302-311 (2019).
  17. Ward, M. A., Yanagimachi, R. Intracytoplasmic sperm injection in mice. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (1), (2018).
  18. Rinaudo, P., et al. Microinjection of mitochondria into zygotes creates a model for studying the inheritance of mitochondrial DNA during preimplantation development. Fertility and Sterility. 71 (5), 912-918 (1999).
  19. Arroyo, G., et al. Pronuclear morphology, embryo development and chromosome constitution. Reproductive Biomedicine Online. 20 (5), 649-655 (2010).
  20. Gosden, R. G., Johnson, M. H. Can oocyte quality be augmented. Reproductive Biomedicine Online. 32 (6), 551-555 (2016).
  21. Su, J., et al. Transplantation of adipose-derived stem cells combined with collagen scaffolds restores ovarian function in a rat model of premature ovarian insufficiency. Human Reproduction. 31 (5), 1075-1086 (2016).
  22. Beane, O. S., Fonseca, V. C., Cooper, L. L., Koren, G., Darling, E. M. Impact of aging on the regenerative properties of bone marrow-, muscle-, and adipose-derived mesenchymal stem/stromal cells. PLoS One. 9 (12), 115963(2014).
  23. Hartwig, S., et al. A critical comparison between two classical and a kit-based method for mitochondria isolation. Proteomics. 9 (11), 3209-3214 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Стволовые клеткипроизводные жировой тканикачество ооцитовмитохондриальная дисфункцияаутологичная трансплантация митохондрийперенос цитоплазмы ооцитовженское бесплодиестарение ооцитов

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.