В этой статье мы описываем выделение митохондрий из мезенхимальных стволовых клеток, полученных из жира мыши, а затем перенос митохондрий в состаренные ооциты мышей для улучшения качества ооцитов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
В этой статье мы описываем выделение митохондрий из мезенхимальных стволовых клеток, полученных из жира мыши, а затем перенос митохондрий в состаренные ооциты мышей для улучшения качества ооцитов.
Из-за снижения количества и качества ооцитов, связанного с возрастом, фертильность женщин старше 35 лет резко снизилась. Молекулярные механизмы, поддерживающие качество ооцитов, остаются неясными, поэтому в настоящее время трудно увеличить рождаемость женщин старше 35 лет. Ооциты содержат больше митохондрий, чем любой тип клеток в организме, и любая митохондриальная дисфункция может привести к снижению качества ооцитов. В 1990-х годах перенос цитоплазматических ооцитов привел к большим успехам в репродукции человека, но сопровождался этическими спорами. Ожидается, что аутологичная митохондриальная трансплантация станет полезным методом для повышения качества ооцитов, которое уменьшилось из-за возраста. В настоящем исследовании мы использовали стволовые клетки, полученные из жировой ткани от старых мышей, в качестве донора митохондрий для повышения качества ооцитов старых мышей. Дальнейшее развитие технологии аутологичного митохондриального переноса обеспечит новый и эффективный метод лечения бесплодия у пожилых женщин.
Одним из важных факторов, влияющих на женскую фертильность, является старение ооцитов; Снижение качества ооцитов является основной причиной бесплодия у женщин пожилого возраста. Тем не менее, основная причина старения ооцитов и молекулярный механизм, регулирующий качество ооцитов, до сих пор неясны. Предыдущие исследования показали, что как количество, так и качество митохондрий участвуют в контроле качества ооцитов и эмбриональном развитии 1,2,3. Уменьшение количества и качества митохондрий тесно связано со старением3....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Все описанные эксперименты на животных были одобрены Комитетом по этике исследований на животных Третьей аффилированной больницы Университета Сучжоу. Все операции проводятся в соответствии с соответствующими рекомендациями агентства по уходу и использованию животных и национальными руководящими принципами. Подробные сведения обо всех материалах, инструментах и реагентах, используемых в этом протоколе, см. в Таблице материалов .
1. Выделение и характеристика мезенхимальных стволовых клеток (ADSC) из жировой ткани старых мышей
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
В этом протоколе мы выделили и охарактеризовали ADSC из мышиного жира (рис. 1). Для получения изолированных митохондрий клеточную мембрану необходимо нарушить с помощью стеклянного гомогенизатора. (Рисунок 2А). Важно получить однородную митохондриальную фракцию без больших комков, чтобы микроинъекционная трубка не блокировалась. Сначала необходимо использовать 200 μл, а затем 10 μл наконечники для пипеток для мягкой ресуспендирования гомогенатов; Наконец, игла 2.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Ооциты содержат больше митохондрий, чем любой тип клеток в организме, с числом копий ~1-5 ×10 5 мтДНК. Митохондрии необходимы для созревания ооцитов, оплодотворения и эмбрионального развития, поэтому любая митохондриальная дисфункция может привести к снижению качества ооцитов. Снижение количества и качества митохондрий тесно связано с физиологическим старением. В этом протоколе был представлен простой метод выделения митохондрий из ADSC старых мышей и переноса в старые ооциты .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.
Авторы выражают признательность за поддержку со стороны Национального фонда естественных наук Китая (82001629 до X.Q.S.), Проекта фундаментальных исследований Бюро науки и технологий Чанчжоу в рамках гранта No CJ20200110 (Y.J.Y.), Молодежной программы Фонда естественных наук провинции Цзянсу (BK20200116 до X.Q.S.) и Финансирования постдокторских исследований провинции Цзянсу (2021K277B to X, К.С.).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,05% трипсин/ЭДТА, | Gibco | 25300054 | Клеточная культура |
| 4% параформальдегид | beyotime | P0099 | иммунофлуоресценция |
| 40 мкм; m клеточный фильтр | Corning | 352340 | ADSC изоляция |
| адипогенная индукция | Cyagen | HUXXC-90031 | Многонаправленная дифференцировка |
| Ализарин красный окрашивающий раствор | Sigma | A5533 | Многонаправленная дифференцировка |
| Антитело против CD29 | BD Biosciences | анализ 558741 потока | |
| Антитело против CD34 | BD Biosciences | 560942 | анализ потока |
| Антитела против CD90 | BD Biosciences | 553016 | анализ потока |
| Антитела против HLA-DR | BD Biosciences | 555560 | анализ |
| потока&бета;-актина | Abcam | ab-8226 | Митохондриальный функциональный тест |
| BSA | Sigma V900933 | иммунофлуоресценция | |
| CCCP | Solarbio | C6700 | митохондрии JC-1 анализ потока |
| ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix | Vazyme | Q711 | qPCR |
| коллагеназа типа I | Sigma | SCR103 | ADSC изоляция |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | иммунофлуоресценция |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320033 | клеточная культура |
| DMSO | Sigma | 276855 | митохондрии JC-1 анализ потока |
| EGTA | Sigma | 324626 | выделение митохондрий |
| FBS | Gibco | 10100147 | клеточной культуры |
| Проточная цитометрия | BD Biosciences | FACSКанто& торговля; II | Характеристики |
| флуоресцентного микроскопа | leica | DM2500 | иммунофлуоресцентный |
| желатин | Sigma | 48722 | разнонаправленной дифференцировки |
| Sangon | F519062 | Выделение митохондрий | |
| hCG | Aibei | M2520 | Суперстимуляция яичников |
| гиалуронидаза | Sigma | H1115000 | Суперстимуляция яичников |
| Инвертированный микроскоп | Olympus | IMT-2 | Набор для микроинъекции |
| изолированных митохондрий | Sigma | CS0760 | Анализ потока митохондрий JC-1 JC-1 |
| Sigma | T4069 | Тест функции митохондрий | |
| KCl | Sigma | P5405 | Перенос митохондрий |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | Перенос |
| митохондрийLaminB | Abcam | ab-16048 | Митохондриальный функциональный тест |
| M16 Medium Sigma | M7292 | эмбриональная клеточная культура | |
| M2 Medium | Sigma | M7167 | эмбриональная клеточная культура |
| маннитол | Sigma | M9546 | Митохондриальный перенос |
| Микроинъектор | Olympus+ eppendorf | IX73 | Митохондриальный перенос |
| MitoTracker красный | Invitrogen | M22425 | Окрашивание митохондрий |
| MOPS | Sigma | M1442 | Выделение митохондрий |
| медиатор нейрофиламентов полипептид (NFM) | Santa Cruz Biotechnology | sc-16143 | Многонаправленная дифференцировка |
| нейрогенная индукция | Gibco | A1647801 | Многонаправленная дифференцировка |
| Нейрон-специфическая энолаза (NSE) | Santa Cruz Biotechnology | sc-292097 | Масло многонаправленной дифференцировки |
| красное O Сангон | E607319 | масло адипогенной дифференцировки | |
| красное O раствор | Sigma | O1516 | Многонаправленная дифференцировка |
| остеогенная индукция | Cyagen | HUXXC-90021 | Многонаправленная дифференцировка |
| PBS (фосфатно-солевой буфер) | Hyclone | SH30256.LS | Клеточная культура |
| Пенициллин и стрептомицин | Гиклон | SV30010 | Клеточная культура |
| PMSG | Aibei | M2620 | Суперстимуляция яичников |
| Протеаза Коктейль ингибиторов | Sigma | P8340 | Выделение митохондрий |
| сахарозой | Sigma | V900116 | Выделение митохондрий |
| Tris | Sigma 648314 | Выделение митохондрий | |
| Tris-HCl | Sigma | 108319 | перенос митохондрий |
| Triton X-100 | beyotime | P0096 | иммунофлуоресценция |
| VDAC | Abcam | ab-14734 | Митохондриальный функциональный тест |
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Эта статья была опубликована
Видео скоро будет доступно