Методическая статья

Прижизненная микроскопия для изучения тромбоцитарно-лейкоцитарно-эндотелиальных взаимодействий в печени мышей

930 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/64239

⸱

6 октября 2022 г.

 ,  , 
1Center for Translational Research on Inflammatory Diseases, Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center, 2Department of Medicine, Baylor College of Medicine, 3Department of Pediatrics, Baylor College of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Прижизненная микроскопия является мощным инструментом, который позволяет получить представление о временных и пространственных взаимосвязях быстрых и/или последовательных процессов. В данной работе мы описываем протокол для оценки как белок-белковых взаимодействий, так и тромбоцитарно-нейтрофильно-эндотелиальных взаимодействий в синусоидах печени на мышиной модели экспериментального сепсиса (эндотоксемии).

Аннотация

Воспаление и тромбоз – это сложные процессы, которые протекают преимущественно в микроциркуляции. Хотя стандартная гистология может дать представление о конечном пути развития как воспаления, так и тромбоза, она не способна показать временные изменения, которые происходят на протяжении всего времени этих процессов. Прижизненная микроскопия (IVM) — это использование визуализации живых животных для получения временного представления о физиологических процессах in vivo. Этот метод особенно эффективен при оценке клеточных и белковых взаимодействий в кровотоке из-за быстрых и последовательных событий, которые часто необходимы для возникновения этих взаимодействий. Несмотря на то, что IVM является чрезвычайно мощной методологией визуализации, способной наблюдать за сложными процессами in vivo, существует ряд методологических факторов, которые важно учитывать при планировании исследования IVM. В этой статье описывается процесс проведения прижизненной визуализации печени, выявляются важные соображения и потенциальные подводные камни, которые могут возникнуть. Таким образом, в данной статье описывается использование IVM для изучения тромбоцитарно-лейкоцитарно-эндотелиальных взаимодействий в синусоидах печени с целью изучения относительного вклада каждого из них в различных моделях острого повреждения печени.

Введение

Воспаление и тромбоз – это сложные процессы, которые протекают преимущественно в микроциркуляции. В этом протоколе описывается хирургическая подготовка, которая позволяет визуализировать микроциркуляторное русло печени in vivo. Хотя стандартная гистология может дать представление о конечных путях как воспаления, так и тромбоза, она не может показать временные изменения, которые происходят на протяжении всего процесса. Кроме того, этот метод особенно эффективен при оценке транзиторных клеточных и белковых взаимодействий, происходящих в микрососудистом кровообращении, благодаря его способности фиксировать с помощью видеомикроскопии часто быстрые и последовательные взаимодействия, происходящие в биологических системах. В данной работе описывается использование прижизненной микроскопии для изучения тромбоцитарно-лейкоцитарно-эндотелиальных взаимодействий в синусоидах печени с целью изучения относительного вклада каждого из них в различных моделях острого повреждения печени.

В то время как эта хирургическая подготовка и метод визуализации могут быть адаптированы к множеству воспалительных и патологических моделей, здесь описаны две модели сосудистого воспаления: модель эндотоксемии мышиного сепсиса и повреждение печени, вызванное ацетаминофеном (APAP). Инъекции эндотоксина (липополисахарид; ЛПС) для индуцирования экспериментальной модели мышиного сепсиса началась еще в 1930-х годах с его выделения и последующего исследования в качестве ключевой молекулы в прогрессировании сепсиса1. Несмотря на то, что эта модель ограничена тем, что ЛПС является лишь одним компонентом грамотрицательных бактерий, это широко принятый и используемый метод, который относительно прост и быстр в применении. Кроме того, он быстро и точно воспроизводит физиологические проявления сепсиса1. Учитывая роль, которую абсорбция эндотоксинов в кишечнике играет в развитии заболеваний печени и воспаления2, это превосходная модель для изучения тромбоцитарно-лейкоцитарно-эндотелиальных взаимодействий в печени мышей.

В дополнение к модели сепсиса с помощью ЛПС, передозировка APAP обеспечивает отличную модель для изучения патологических межклеточных взаимодействий в печени. Передозировка APAP может привести к острой печеночной недостаточности, характеризующейся тромбоцитопенией и накоплением тромбоцитов в печени, что впоследствии блокирует опосредованное лейкоцитами восстановление печени3. В то время как хирургическая подготовка и методология визуализации для этой модели могут быть адаптированы для ряда биологических вопросов и для изучения различных патологических процессов, как модель сепсиса ЛПС, так и APAP-индуцированное повреждение печени являются отличными моделями для изучения тромбоцитарно-лейкоцитарно-эндотелиальных взаимодействий in vivo.

ЭКО имеет некоторые неотъемлемые преимущества по сравнению со стандартными гистологическими методами. В то время как стандартные гистологические методы позволяют изучать целые или срезы тканей и оценивать белки и архитектуру тканей, эти методологии имеют ограничения. По замыслу, эти процессы требуют обработки тканей, которая может исказить или замаскировать то, что находится в живой системе. Ткань должна быть зафиксирована во время гистологического препарирования, что может привести к артефактам фиксации или усилению аутофлуоресценции. Фиксация также может привести к внутриклеточным изменениям в тканях, а потенциальная возможность неправильной фиксации может привести к деградации тканей. Кроме того, гистологические методы не имеют потенциала для непосредственного изучения временных аспектов белковых или клеточных взаимодействий и могут пропускать эфемерные или нечастые взаимодействия.

И наоборот, флуоресцентная прижизненная микроскопия позволяет избежать многих осложнений и ограничений, присущих стандартной гистологии. IVM позволяет избежать фиксации и, тем самым, артефактов или деградации тканей, которые могут произойти во время гистологической подготовки. По своей конструкции он также позволяет визуализировать ткани внутри живой биологической системы, и, таким образом, выделение и разделение тканей не требуются. Кроме того, он позволяет визуализировать и изучать преходящие или редкие процессы, которые может быть трудно или невозможно зафиксировать с помощью гистологии. Этот метод IVM также может быть использован для захвата и идентификации последовательных процессов (например, взаимодействий, инициированных тромбоцитами или лейкоцитами, в результате чего тромбоцитарно-лейкоцитарные агрегаты связываются с эндотелием сосудов). Наконец, этот метод может быть адаптирован к множеству систем визуализации. В зависимости от потребностей исследования и желаемого набора данных, после хирургической подготовки на экстернализованную печень можно установить практически любую желаемую систему визуализации. Мы успешно применили этот протокол для визуализации с помощью широкопольной флуоресцентной микроскопии, микроскопии вращающегося диска, лазерной сканирующей конфокальной микроскопии с использованием сканера резонансной головки, а также двухфотонной микроскопии. Однако нет никаких оснований полагать, что этот метод должен быть ограничен вышеупомянутыми системами микроскопии.

В этом методе изложен протокол IVM, который ранее использовался для изучения тромбоцитарно-лейкоцитарно-эндотелиальных взаимодействий в печени мышей. Этот протокол был использован для сравнения височной тромбоцитарно-эндотелиальной адгезии тромбоцитов, либо меченных флуоресцентно конъюгированными антителами, либо генетически модифицированных для эндогенной флуоресценции4. Этот протокол был использован для оценки транзиторных тромбоцитарно-лейкоцитарно-эндотелиальных взаимодействий в синусоидах печени в эндотоксемической модели воспаления печени и для совместной локализации P-селектина и рекомбинантного белка. Кроме того, этот протокол позволил определить, являются ли различия в плотности нейтрофилов с помощью стандартной гистологии результатом различий в скоростях эритроцитов (в качестве суррогата объемной скорости потока)5. Наконец, этот метод был использован для оценки рекрутирования тромбоцитов клетками Купфера в синусоидах печени в острой модели APAP-индуцированного повреждения печени6. Такая работа была бы невозможна при использовании стандартных гистологических методов. Как уже говорилось, этот протокол может быть адаптирован для различных систем визуализации, и при правильной хирургической подготовке, выборе флуоресцентных антител и настройках визуализации этот протокол является высоконадежным и воспроизводимым для изучения патологии печени.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все протоколы для животных были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Медицинского колледжа Бейлора и Комитетом по исследованиям и разработкам Медицинского центра по делам ветеранов Майкла Э. Дебейки. Все эксперименты являются заключительными, в конце эвтаназии проводится под хирургической плоскостью анестезии. Подробную информацию обо всех материалах, реагентах и оборудовании, используемых в этом протоколе, см. в Таблице материалов .

1. Получение антител и красителей

  1. Выбор антител и красителей
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество наблюдаемых одновременных цветов будет зависеть от конкретной конфигурации микроскопа. В используемой здесь системе можно визуализировать четыре разные длины волн одновременно.
    1. Визуализация сосудов:
      1. В зависимости от плана эксперимента пометьте сосудистую сеть либо эндотелий-специфичным (например, CD31) антителом, либо молекулой, которая равномерно распределена в плазме (например, декстрана или альбумином).
        ПРИМЕЧАНИЕ: В этой статье описывается использование техасского красного маркированного декстрана (150 кДа; 250 мкг/мышь). Преимущество этого белка с большой молекулярной массой заключается в его способности оставаться в сосудистой сети во время острого воспаления. Необходимо соблюдать осторожность при использовании мечения антител, чтобы избежать антител, которые могут нарушать функцию эндотелия.
    2. Визуализация тромбоцитов:
      1. Для идентификации тромбоцитов используйте либо генетически модифицированные мышей (например, R26R-EYFPf/f/PF4-Cre), либо тромбоцито-специфические (например, анти-GPIbβ) антитела к IVM. Для получения подробной информации об использовании флуоресцентного мечения тромбоцитов см. предыдущую публикацию4.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь используются меченые DyLight488 антитела против GPIbβ (X488; 6 мкг/мышь). Необходимо соблюдать осторожность при использовании мечения антителами, чтобы избежать нарушения функции тромбоцитов или адгезии.
    3. Визуализация лейкоцитов:
      1. Подобно визуализации тромбоцитов, визуализируйте интересующие вас лейкоциты либо с помощью генетически модифицированных мышей (например, LysM-EGFP для гранулоцитов), либо лейкоцит-специфических антител (например, Ly6G для мышиных нейтрофилов). Чтобы следовать этому протоколу, используйте меченые Brilliant Violet 421 (BV421) антитела против Ly6G (3 мкг/мышь). В экспериментах с острыми тонами (<6 ч) помечают нейтрофилы 3 мкг анти-Ly6G (клон 1A8) на животное.
        Примечание: При использовании антитела против Ly6G (клон 1A8) следует отметить, что это антитело использовалось для истощения нейтрофилов (0,05-1 мг антитела/мышь)7-9 через не менее 24 ч и/или при повторных инъекциях. Также сообщалось, что антитела Anti-Ly6G (1A8) влияют на адгезию и трансмиграцию нейтрофилов при высоком (но не низком) напряжении сдвига в некоторых, но не во всех ситуациях 9,10. Поэтому дозировку антител следует тщательно подбирать для каждого случая.
    4. Дополнительные белки:
      1. В зависимости от количества лазеров и наборов фильтров/детекторов, доступных в конкретной системе визуализации, добавьте больше длин волн, чтобы идентифицировать больше объектов одновременно, стараясь при этом избежать наложения спектра.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол описывает визуализацию 4-го объекта, P-селектина (клон Psel.KO2.3), с использованием меченого PerCP-eFluor 710 анти-P-селектинового антитела (4 мкг/мышь). Хотя большинство описаний и изображений в этой статье относятся к острому повреждению печени, вызванному ЛПС, другие модели повреждения могут представлять интерес и могут потребовать альтернативных обозначений. Описание антител, используемых для лечения APAP-индуцированного повреждения см. в обсуждении6.
  2. Удаление консервантов и стерилизация
    Примечание: Несмотря на то, что существуют коммерчески доступные антитела и красители, готовые для инъекций животным, большинство из них будут содержать носители или консерванты (например, азид натрия), которые могут быть вредны для животных или добавлять искажающие переменные. Антитела и красители, содержащие носители или консерванты, должны быть диализированы против фосфатно-солевого буфера Дульбекко без кальция или магния (DPBS-/-; или других физиологических буферов).
    1. Налейте 500 мл DPBS-/- (~1000-кратный объем антитела/красителя, подлежащего диализу) в стакан с магнитной мешалкой. Прикрепите кассету мощностью 7 000 MWCO к поплавковому бую и поместите ее в диализный буфер не менее чем на 5 минут для предварительного кондиционирования мембраны. Извлеките кассету и промокните пластиковые края насухо безворсовой салфеткой. Избегайте прикосновения к диализной мембране.
    2. Введите антитело/краситель в кассету через один из четырех портов с помощью иглы 18-20 G. Поместите кассету с антителом/красителем в диализный буфер. Поместите стакан на магнитную мешалку и диализируйте не менее 1 часа при температуре 4 °C. Смените диализный буфер.
    3. Повторите диализ и замену диализного буфера на шаге 1.2.2 еще как минимум два раза (не менее трех обменов).
    4. Извлеките кассету и промокните пластиковые края насухо безворсовой салфеткой. Избегайте прикосновения к диализной мембране. Аспирируйте антитело/краситель из кассеты через неиспользуемый порт с помощью иглы 18-20 G.
    5. В вытяжке для культуры тканей стерилизуйте препараты с помощью фильтра 0,2 мкм перед использованием у животных. Храните неиспользованные порции в стерильных пробирках при температуре 4 °C.
  3. Рычаги управления
    1. В то время как точный контроль, необходимый для каждого эксперимента, будет варьироваться в зависимости от дизайна исследования, обязательно включите надлежащие фиктивные когорты, группы, получавшие и не получавшие носитель, а также контрольные изотипы, чтобы исключить неспецифическую маркировку и биологические эффекты при анализе результатов исследования.

2. Внутрибрюшинное введение эндотоксина

Примечание: Для оценки тромбоцитарно-нейтрофильно-эндотелиальных взаимодействий в синусоидах печени на экспериментальной модели мышиного сепсиса можно использовать инъекции эндотоксина.

  1. Взвесьте мышей, чтобы определить количество эндотоксина для введения (5 мг/кг; Escherichia coli серотип O111:B4; содержание эндотоксина 1 х 106 ЕУ/мг).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Активность и эффект эндотоксина зависят от вида и штамма и могут варьироваться от партиик партии 11. Поэтому для максимальной согласованности результатов следует проводить эксперименты с одной и той же партией эндотоксина12.
  2. Наберите эндотоксин, разведенный обычным физиологическим раствором (0,9% хлорида натрия), в шприц с прикрепленной иглой 27 G. В недоминантной руке держите мышь за загривок с помощью большого и указательного пальцев. Используя другую руку, надавите на хвост, чтобы обнажить живот, и поместите хвост между пятым пальцем и ладонью недоминантной руки.
  3. Очистите брюшную полость с помощью 70% этанола. Введите иглу в нижнюю левую (или правую) область живота и введите эндотоксин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следует соблюдать осторожность, чтобы не вводить иглу слишком глубоко, потому что существует риск повреждения органов, которое может затруднить проведение экспериментов (например, повреждение кишечника, почек и т. д.).
  4. Выполните шаги 2.1-2.3 у контрольных животных с использованием обычного физиологического раствора (или транспортного средства).
    Примечание: APAP-индуцированное повреждение печени может быть достигнуто с использованием методологии, аналогичной описанной выше, с использованием APAP, а не эндотоксина6. Подробности о модели APAP-индуцированного повреждения печени см. в обсуждении.

3. Индукция и поддержание анестезии животных и эвтаназия

  1. Поместите животных под хирургическую плоскость анестезии. Поддерживайте анестезию с помощью ингаляционного изофлурана через носовой конус или трахеостомическую трубку. Оценивайте и корректируйте уровень анестезии, отслеживая движение после защемления пальца ноги.
  2. В конце всех экспериментов проводят эвтаназию путем обескровливания под хирургической плоскостью анестезии с последующим двусторонним пневмотораксом.

4. Катетеризация яремной вены и трахеи

  1. Выполните трахеотомию для облегчения дыхания и установки сосудистых катетеров для введения меченых антител/красителей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хирургический диссекционный микроскоп или лупы полезны при катетеризации.
  2. Сбрить шерсть с шеи и живота; удалить лишние волосы. Положите животное на грелку, чтобы поддерживать температуру тела на уровне 37 °C, используя ректальный зонд для контроля температуры тела. Потрите шею бетадином, а затем 70% этанолом.
  3. Сделайте вертикальный разрез по средней линии на шее и обнажите трахею с помощью тупого рассечения.
    1. Трахеостомия
      1. Подготовьте трахеостомическую трубку PE90 с введенной тупой иглой 21 G (рисунок 1A).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление скоса ~45° к концу трахеостомической трубки может облегчить ее введение в трахею. В качестве альтернативы, периферический внутривенный катетер 18-20 G также может быть заменен на трубку PE90.
      2. После того, как кожа и фасция будут надрезаны, отведите слюнные железы от центра.
      3. С помощью тупой диссекции отделите грудино-щитовидную мышцу, чтобы обеспечить лучший доступ к трахее.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за тем, чтобы не было питающих сосудов и сонных артерий, которые прилегают к трахее.
      4. Сделайте небольшой (~1-2 мм) горизонтальный разрез между кольцами трахеи на вентральной/передней стороне трахеи (рис. 1B).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Использование ножниц Vannas облегчит правильное препарирование. Следите за тем, чтобы надрез был сделан только на передней поверхности трахеи; Полная транссекция трахеи затруднит канюляцию трахеи и может повредить близлежащие сосудистые структуры.
      5. Введите в отверстие трахеостомическую трубку. Следите за тем, чтобы кончик трубки не вставлялся за киль.
      6. Закрепите трахеостомическую трубку внутри трахеи, завязав шелковый шов #4-0 вокруг трахеи и трубки, используя кольца трахеи в качестве опоры (Рисунок 1C).
    2. Наружная яремная канюляция
      1. Подготовьте яремный катетер (Рисунок 2) с помощью трубки PE50 (внешний диаметр 0,97 мм, внутренний диаметр 0,58 мм) с трубкой PE10 (внешний диаметр 0,61 мм, внутренний диаметр 0,28 мм), вставленной в один конец (вставка Рисунка 2), и тупой иглой 22 G или 23 G, вставленной в другой. Используйте клей, чтобы трубка не скользила и не протекала. Прикрепите шприц, наполненный стерильным физиологическим раствором, чтобы промыть катетер.
      2. Обнажите наружную яремную вену (ЭДВ) после отражения слюнной железы. С помощью тупой диссекции освободите EJV от окружающей соединительной ткани (рис. 3A).
      3. Используя шелковые шовные нити #4-0, перевяжите краниальный конец визуализированной EJV и поместите свободную петлю вокруг каудального конца EJV (Рисунок 3B). Зажмите концы каждого шва вместе с помощью гемостатиков и аккуратно оттяните два гемостата друг от друга, чтобы помочь обнажить EJV.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная область для канюляции находится между ветвями передней яремной вены краниально и внутренней яремной вены каудально. Чтобы облегчить наложение швов, сложите кусок (~15 см) шовной нити пополам и пропустите согнутый конец под EJV с помощью одной пары щипцов, одновременно поднимая EJV с помощью отдельной пары щипцов, чтобы предотвратить скручивание сосуда. Затем разрежьте шов, чтобы получилось две отдельные длины.
      4. С помощью ножниц Vannas сделайте небольшой (~1 мм) разрез на передней поверхности EJV. Введите изогнутую тупую иглу 30 G (дополненную штифтом диаметром 0,15 мм, тупо подпиленным и вставленным в кончик иглы) в EJV через разрез и осторожно поднимите ее вверх, чтобы облегчить прохождение катетера, содержащего нормальный физиологический раствор, в EJV.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Перед введением и промывкой в мышь убедитесь, что на катетере и концентраторе нет пузырьков воздуха. Воздушная эмболия может быть смертельной для животного.
      5. Как только катетер окажется внутри EJV, ослабьте каудальную петлю ровно настолько, чтобы катетер мог пройти глубже в вену. Проверьте расположение катетера путем аспирации крови и промывки катетера для проверки на утечки (Рисунок 3C).
      6. С помощью каудальной петли закрепите катетер внутри EJV. С помощью черепного шва закрепите катетер на краниальном конце EJV, чтобы свести к минимуму случайную деканюляцию (рисунок 3D).
      7. Закройте разрез кожи шеи шелковым швом #4-0.

5. Экстериоризация печени

  1. Очистите брюшную полость с помощью скраба с бетадином, а затем 70% этанола.
  2. Сделайте вертикальный разрез ~1 см на коже верхней части живота, начиная с основания грудины. С помощью тупого рассечения отделите кожу от мышц живота. Прижгите крупные питающие сосуды кожи и мышц, чтобы свести к минимуму кровотечение во время следующих этапов (рисунок 4A).
  3. Сделайте горизонтальный разрез кожи на ~1-2 см с последующей мышцей живота, разрезая вертикальный разрез пополам на шаге 5.2 примерно в верхней части видимой печени; использовать инструмент для прижигания для помощи в гемостазе кожи (рисунок 4B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размер разреза брюшной полости имеет решающее значение для оптимальной визуализации печени. Если отверстие слишком маленькое, существует риск ишемии печени из-за перерастяжения или ущемления печеночной артерии и/или воротной вены. Если отверстие слишком большое, то другие органы, такие как кишечник, также могут быть выведены наружу и мешать визуализации.
  4. Вырежьте примерно 1 см круг в центре марли размером 2 в х 2 и смочите его теплым обычным физиологическим раствором. Расположите марлю так, чтобы отверстие располагалось по центру разреза. Осторожно раздвиньте края разреза и надавите на брюшную полость легким направлением вверх, чтобы наружно обнажить печень, чтобы печень легко лежала поверх увлажненной марли (рисунок 4C).
  5. Поместите мышь на лоток для визуализации в положении лежа так, чтобы печень находилась по центру покровного стекла (рисунок 4D).
    ПРИМЕЧАНИЕ: У контрольного животного печень должна быть темно-бордовой. В этом протоколе для ЭКО используется инвертированный лазерный сканирующий конфокальный микроскоп с двусторонним резонансным головным сканером. Поэтому для создания пользовательского лотка IVM был использован 3D-принтер (рисунок 5). Предоставлены файлы .stl, созданные для 3D-печати (Дополнительный файл 1); Могут потребоваться корректировки в соответствии с индивидуальными потребностями.
  6. Перенесите животное в перевернутый микроскоп.

6. Прижизненная микроскопия печени

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе используется лазерный сканирующий конфокальный микроскоп с двусторонним резонансным головным сканером для прижизненной микроскопии. Чтобы стабилизировать частоту резонансной головки, включите систему не менее чем за 30 минут до начала визуализации. Разные системы могут иметь разные возможности. Обсуждение этих вопросов выходит за рамки данной статьи. Свяжитесь с представителями оборудования для получения технических подробностей конкретных систем.

  1. Чтобы сохранить операционную плоскость анестезии, подключите животное к системе доставки изофлурана.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от протокола эксперимента, может потребоваться искусственная вентиляция легких (в отличие от спонтанной вентиляции).
  2. Положите на животное лучистящую греющую прокладку, используя ректальный зонд, чтобы поддерживать внутреннюю температуру 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе прямоугольный кусок пенопласта, который подходит для лотка IVM, действует как изолятор и распорка, на которую помещается лучистая прокладка для обогрева (Рисунок 4D).
  3. Установите револьверную головку объектива на желаемое увеличение, при необходимости нанося иммерсионное масло. Чтобы следовать этому протоколу, используйте объектив из силиконового масла 60x/NA1.30 с 1-кратным оптическим зумом.
  4. После того, как фокальная плоскость определена, определите ≥10 случайных полей зрения, избегая областей вблизи краев печени.
    Примечание: Поскольку печень проявляет аутофлуоресценцию в канале флуоресцеина изотиоцианата (FITC), используйте эпифлуоресценцию для быстрой идентификации общей фокальной плоскости.
    1. В зависимости от системы определите края видимой печени с помощью эпифлуоресценции в канале FITC и запишите координаты стадии (x,y).
    2. Используйте границы печени (x,y) и генератор случайных чисел для определения случайных координат (x,y). Для получения приемлемого поля зрения обратите внимание на (а) наличие судов, рассредоточенных по всему полю зрения; b) ≥80% судов находятся в одной и той же фокальной плоскости; и (c) ≥1 поле зрения от любых краев печени (пример на рисунке 6). Если анализ изображений сосредоточен на тромбоцитарно-лейкоцитарно-эндотелиальных взаимодействиях в печеночных синусоидах, исключите поля с сосудами, диаметр которых составляет ≥15 мкм (диаметр мышиных синусоид обычно составляет ≤10 мкм).

7. Анализ изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: ImageJ/FIJI использовался для обработки всех изображений в этой статье. FIJI (fiji.sc) — это версия Image J (imagej.nih.gov) с открытым исходным кодом, которая обладает большей функциональностью за счет использования дополнительных плагинов и макросов13.

  1. Откройте многоканальные покадровые файлы в ImageJ/FIJI.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от платформы, могут потребоваться дополнительные программы/плагины. ImageJ/FIJI имеет импортер биоформатов, который может открывать несколько различных типов файлов, таких как файлы .oir от Olympus. Здесь файлы были преобразованы в .tif, потому что это более широко используемый формат.
  2. Убедитесь, что установлен правильный масштаб; Обратите внимание на соотношение пикселей/μм и временной интервал в метаданных/свойствах.
  3. Используйте различные фильтры для удаления фонового шума (например, фильтр со срединным радиусом 2 пикселя, используемый в этом протоколе). Убедитесь, что обработка всех изображений одинакова, чтобы свести к минимуму различия при постобработке. По мере сравнения подсчетов и длительности в этих экспериментах вместо средней интенсивности флуоресценции используйте фильтр для улучшения ясности, а также для идентификации и измерения межклеточных взаимодействий.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование и величина фильтров будут зависеть от размера интересующей цели (целей) и соотношения сигнал/шум на изображениях.
  4. Поскольку существует неоднородность между полями зрения по плотности сосудов, измерьте общую площадь сосудов в каждом поле с помощью кисти выбора (рис. 7).
    1. Щёлкните правой кнопкой мыши по овальному инструменту выделения и выберите инструмент «Кисть выделения ».
    2. Отрегулируйте размер кисти, дважды щелкнув значок инструмента «Кисть выделения ».
    3. Обведите сосуды, чтобы выделить/выбрать их. Чтобы удалить части выделенной области, используйте щелчок [alt] и щелкните левой кнопкой мыши с помощью клавиши [shift] и щелкните левой кнопкой мыши.
    4. Нажмите [M] , чтобы измерить выбранную область.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если масштаб изображения был правильно установлен, то вывод должен быть в μm2, который конвертируется в мм2.
  5. Подсчитайте количество тромбоцитов и лейкоцитов в поле. Считать клетки адгезивными, если они переместились на <1 клеточное тело в течение 30 с. Рассчитайте количество клеток (тромбоцитов и/или лейкоцитов) на мм2.
  6. Чтобы оценить относительный кровоток в каждом сосуде, измерьте среднюю скорость эритроцитов (RBC) в качестве суррогата с помощью плагина MTrackJ в ImageJ/FIJI (imagescience.org/meijering/ software/mtrackj)14, как описано ранее5. Идентифицируйте эритроциты как круглые или дискообразные дефекты наполнения в канале декстрана. Сохраняйте треки для ведения учета, асинхронного анализа и проверки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пример этого показан на рисунке 8 и в дополнительном видео S1.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Оценка влияния стержневого домена виментина на адгезию лейкоцитов к воспаленному эндотелию
Связывание лейкоцитарного Р-селектина гликопротеина-1 (PSGL-1) с эндотелиальным и тромбоцитарным Р-селектином происходит во время острой фазы воспаления повреждения печени, вызванного сепсисом. Тем не менее, было показано, что рекомбинантный палочковидный домен виментина человека (rhRod) связывается с P-селектином и блокирует адгезию лейкоцитов как к эндотелию, так и к тромбоцитам. Этот протокол был использован ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Цель данной методики состоит в том, чтобы описать необходимые шаги, необходимые для надежного получения прижизненных изображений и видео печени мыши с высоким разрешением в гомеостатических условиях и после введения эндотоксина или APAP. Несмотря на то, что этот протокол позволил обеспечить последовательное получение данных о тромбоцитарно-лейкоцитарно-эндотелиальных взаимодействиях в печени, существует ряд критических шагов, необходимых для успеха, а также потенциальные ловушки, которых...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть. Спонсоры не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи. Содержание не отражает точку зрения Министерства по делам ветеранов США или правительства США.

Благодарности

Эта работа была поддержана NIH/NIGMS GM-123261 (FWL) и NIH/NHLBI HL139425 (JC). Поддержка исследований также финансировалась NIH/NHLBI HL116524.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<прочные>хирургические принадлежности
2" x 2" нетканые губкиMcKesson Med. Surg92242000Для изоляции печени
#4-0 шелковый плетеный шов с иглойSOFSILKN/A4-0 Мягкий шелковый покрытый плетеный черный, нерассасывающийся: Игла для резки C-1
4-0 шелковый плетеный шов без иглыEthiconN/A4-0 Черный плетеный шелк, нерассасывающаяся
тупой игла 21 г (0,5 дюйма)SAI Infusion TechnologiesB21-50Используется для прикрепления к концу трахеостомической трубки для подключения к аппарату искусственной вентиляции легких. Альтернативным источником является
тупой иглой Instech 23 G (0,5 дюйма)SAI Infusion TechnologiesB23-50Она используется для сосудистого катетера для подключения к шприцу. Альтернативным источником являются Instech
Dissecting Scissors (Sharp Tip)Kent ScientificINS600393-GMicro Dissecting Scissors; твердосплавные лезвия; Прямой; острые точки; Длина лезвия 24 мм; 4 1/2 дюйма Общая длина
Микроножницы McPherson-Vannas (Vannas)Kent ScientificINS600124Они полезны для создания отверстий в трахее и сосудах
Полиэтиленовая трубка 10InstechBTPE-10Используется для создания внутрисосудистой части катетера. Альтернативным источником является
полиэтиленовая трубкаInstechBTPE-50Используется для изготовления внесосудистой части катетера. Альтернативным источником является
полиэтиленовая трубкаInstechBTPE-90Это используется для изготовления трахеостомической трубки. Альтернативным источником является BD Intramedic
USP класс стерильный нормальный физиологический растворCoviden8881570121Hospira 0,0% натрия хлорид для инъекций, расходные материалы USP
микроскопия
изофлуран и аппарат искусственной вентиляции легкихKent ScientificSomnosuiteКомбинированный аппарат искусственной вентиляции легких для грызунов и система
доставки летучих анестетиковПоролоновый спейсер для согревания прокладки во время микроскопиин/дЭтот спейсер должен быть вырезан из высококачественного пенопласта, должен облегать лоток печеночного микроскопа, а конкретные размеры по высоте зависят от микроскопической системы
Лазерный сканирующий конфокальный микроскоп с резонансной головкой сканераOlympusFV3000Несмотря на то, что мы описываем использование Olympus FV3000 с использованием сканера с резонансной головкой, этот протокол работает с большинством систем визуализации
Лоток для микроскопа печениН/ДН/ДЛоток для микроскопа печени был разработан для инвертированного микроскопа
<сильно>Антитела и Связанные реагенты
Brilliant Violet 421/антитело против мыши Ly6G BioLegend1276283 &микро; g/мышь. Для мечения нейтрофилов
BV421/F4/80 антителомBioLegend1231320,75 мг/кг. Для маркировки клеток Купфера
фосфатный буферный физиологический раствор Дульбекко без кальция или магнияGibco/ThermoFisher Scientific14190144Используется в качестве диализата для удаления азида натрия из антител
DyLight649/anti-GPIbβ антителаemfret AnalyticsX6493 µ g/мышь. Для мечения тромбоцитов
DyLight488/anti-mouse GPIbβ антителаemfret AnalyticsX4886µ g/мышь. Для мечения тромбоцитов
Эндотоксин из Escherichia coli серотип O111:B4Sigma-AldrichL30245 мг/кг; Активность эндотоксина может варьироваться от партии к партии. Таким образом, одна и та же партия должна быть использована для серии экспериментов, чтобы свести к минимуму вариацию из-за партии эндотоксина
PerCP-eFluor 710/антитела против мышиного P-селектинаInvitrogen46-0626-824 &; g/мышь. Для маркировки P-селектина
Slide-a-Lyzer 7,000 MWCO кассетаThermo Scientific66370Используется для диализа антител для удаления азида натрия
Texas Red-labeled dextanSigma-AldrichT1287~150 кДа; 250 &микро; г/мышиный
TRITC/бычья сыворотка альбуминSigma-AldrichA2289500 &микро; g/мышь. Разведите до исходной концентрации 50 мг/мл (5%) в обычном физиологическом растворе. Используется для маркировки сосудистой сети. Он может просачиваться в интерстициальное пространство легче, чем высокомолекулярный декстран во время воспаления
# BD Intramedic 50 BD Intramedic 90

Ссылки

  1. Deitch, E. A. Rodent models of intra-abdominal infection. Shock. 24, Suppl 1 19-23 (2005).
  2. Nolan, J. P. The role of intestinal endotoxin in liver injury: A long and evolving history. Hepatology. 52 (5), 1829-1835 (2010).
  3. Miyakawa, K., et al. Platelets and protease-activated receptor-4 contribute to acetaminophen-induced liver injury in mice. Blood. 126 (15), 1835-1843 (2015).
  4. Da, Q., Derry, P. J., Lam, F. W., Rumbaut, R. E. Fluorescent labeling of endogenous platelets for intravital microscopy: Effects on platelet function. Microcirculation. 25 (6), 12457(2018).
  5. Lam, F. W., et al. The vimentin rod domain blocks P-selectin-P-selectin glycoprotein ligand 1 interactions to attenuate leukocyte adhesion to inflamed endothelium. PLoS One. 15 (10), 0240164(2020).
  6. Shan, Z., et al. Chitinase 3-like-1 contributes to acetaminophen-induced liver injury by promoting hepatic platelet recruitment. eLife. 10, 68571(2021).
  7. Daley, J. M., Thomay, A. A., Connolly, M. D., Reichner, J. S., Albina, J. E. Use of Ly6G-specific monoclonal antibody to deplete neutrophils in mice. Journal of Leukocyte Biology. 83 (1), 64-70 (2008).
  8. Pollenus, E., et al. Limitations of neutrophil depletion by anti-Ly6G antibodies in two heterogenic immunological models. Immunology Letters. 212, 30-36 (2019).
  9. Wang, J. X., et al. Ly6G ligation blocks recruitment of neutrophils via a β2-integrin-dependent mechanism. Blood. 120 (7), 1489-1498 (2012).
  10. Cunin, P., et al. Differential attenuation of β2 integrin-dependent and -independent neutrophil migration by Ly6G ligation. Blood Advances. 3 (3), 256-267 (2019).
  11. Weary, M. E., Donohue, G., Pearson, F. C., Story, K. Relative potencies of four reference endotoxin standards as measured by the Limulus amoebocyte lysate and USP rabbit pyrogen tests. Applied and Environmental Microbiology. 40 (6), 1148-1151 (1980).
  12. Kiers, D., et al. Comparison of different lots of endotoxin and evaluation of in vivo potency over time in the experimental human endotoxemia model. Innate Immunity. 25 (1), 34-45 (2019).
  13. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  14. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
  15. Sierro, F., et al. A liver capsular network of monocyte-derived macrophages restricts hepatic dissemination of intraperitoneal bacteria by neutrophil recruitment. Immunity. 47 (2), 374-388 (2017).
  16. Guidotti, L. G., et al. Immunosurveillance of the liver by intravascular effector CD8+ T cells. Cell. 161 (3), 486-500 (2015).
  17. Davis, R. P., et al. Optimization of in vivo imaging provides a first look at mouse model of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) using intravital microscopy. Frontiers in Immunology. 10, 2988(2020).
  18. Reif, R., et al. In vivo imaging of systemic transport and elimination of xenobiotics and endogenous molecules in mice. Archives of Toxicology. 91 (3), 1335-1352 (2017).
  19. Sloboda, D. D., Brooks, S. V. Treatment with selectin blocking antibodies after lengthening contractions of mouse muscle blunts neutrophil accumulation but does not reduce damage. Physiological Reports. 4 (1), 12667(2016).
  20. Lam, F. W., Da, Q., Guillory, B., Cruz, M. A. Recombinant human vimentin binds to P-selectin and blocks neutrophil capture and rolling on platelets and endothelium. Journal of Immunology. 200 (5), 1718-1726 (2018).
  21. Mossanen, J. C., Tacke, F. Acetaminophen-induced acute liver injury in mice. Laboratory Animals. 49, 30-36 (2015).
  22. Guerrero Munoz, F., Fearon, Z. Sex related differences in acetaminophen toxicity in the mouse. Journal of Toxicology. Clinical Toxicology. 22 (2), 149-156 (1984).
  23. Larsen, A. K., et al. Autofluorescence in freshly isolated adult human liver sinusoidal cells. European Journal of Histochemistry. 65 (4), 3337(2021).
  24. Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Science Translational Medicine. 4 (158), (2012).
  25. Jost, A. P., Waters, J. C. Designing a rigorous microscopy experiment: Validating methods and avoiding bias. Journal of Cell Biology. 218 (5), 1452-1466 (2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

in vivo
Видео скоро будет доступно

Похожие статьи