Method Article

Одномолекулярная диффузия и сборка на полимерно-переполненных липидных мембранах

DOI:

10.3791/64243

⸱

July 19th, 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, Indian Institute of Science, 2Holonyak Micro & Nanotechnology Lab, University of Illinois, Urbana-Champaign, 3Center for BioSystems Science and Engineering, Indian Institute of Science

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь представлен протокол для выполнения и анализа связывания, подвижности и сборки отдельных молекул на искусственных переполненных липидных мембранах с использованием одномолекулярной флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения (smTIRF).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клеточные мембраны представляют собой сильно переполненные среды для биомолекулярных реакций и передачи сигналов. Тем не менее, большинство экспериментов in vitro , исследующих взаимодействие белка с липидами, используют голые двухслойные мембраны. Таким системам не хватает сложностей скученности мембранными белками и гликанами и исключают связанные с этим объемные эффекты, встречающиеся на поверхностях клеточных мембран. Кроме того, отрицательно заряженная стеклянная поверхность, на которой образуются липидные бислои, препятствует свободной диффузии трансмембранных биомолекул. Здесь мы представляем хорошо охарактеризованную полимерно-липидную мембрану в качестве имитации для переполненных липидных мембран. Этот протокол использует полиэтиленгликоль (ПЭГ)-конъюгированные липиды в качестве обобщенного подхода к включению краудеров в поддерживаемый липидный бислой (SLB). Сначала представлена процедура очистки микроскопических слайдов и обложек для выполнения одномолекулярных экспериментов. Далее обсуждаются методы характеристики PEG-SLB и проведения одномолекулярных экспериментов по связыванию, диффузии и сборке биомолекул с использованием одномолекулярного отслеживания и фотоотбеливания. Наконец, этот протокол демонстрирует, как контролировать нанопоровую сборку бактериального порообразующего токсина Cytolysin A (ClyA) на переполненных липидных мембранах с помощью одномолекулярного анализа фотоотбеливания. Коды MATLAB с примерами наборов данных также включены для выполнения некоторых общих анализов, таких как отслеживание частиц, извлечение диффузионного поведения и подсчет субъединиц.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клеточные мембраны представляют собой сильно переполненные и сложные системы1. Молекулярная скученность может оказывать значительное влияние на диффузию связанных с мембраной объектов, таких как белок и липиды 2,3,4. Аналогичным образом, на бимолекулярные реакции на липидных мембранах, такие как димеризация рецепторов или олигомеризация мембранных комплексов, влияют скученность 5,6,7. Природа, конфигурация и концентрация краудеров могут управлять мембранным связыванием, диффузионной активностью и белково-белковым взаимодействием несколькими способами 8,9. Поскольку контроль скученности мембран на клеточных мембранах и интерпретация ее влияния на встроенные биомолекулы является сложной задачей, исследователи попытались создать альтернативные системы in vitro 10.

Популярным подходом для искусственных переполненных мембран является легирование двухслойных мембран полимерными (такими как полиэтиленгликоль, ПЭГ) привитыми липидами11,12. Во время визуализации динамики белка и липидов на поддерживаемых липидных бислоях (SLB) эти полимеры дополнительно защищают мембранные компоненты от лежащей в основе отрицательно заряженной подложки (такой как стекло), эффективно поднимая бислой от основной опоры. Изменяя размер и концентрацию полимера, можно контролировать степень молекулярной скученности, а также ее отделение от лежащей в основе твердой опоры13,14. Это явно преимущество перед липидными бислоями, поддерживаемыми на твердых подложках без полимерных подушек15,16, где трансмембранные биомолекулы могут терять свою активность 17,18,19. Что еще более важно, это позволяет нам рекапитулировать переполненную среду клеточной мембраны in vitro, что имеет решающее значение для многих мембранных процессов.

Поверхностно-привитые полимеры на мембранах также претерпевают изменения в своей конфигурации в зависимости от их плотности прививки12. При низких концентрациях они остаются в энтропически свернутой конфигурации, известной как гриб, над поверхностью мембраны. С увеличением концентрации они начинают взаимодействовать и имеют тенденцию раскручиваться и расширяться, в конечном итоге давая плотное кустарниковое образование на мембране21. Поскольку переход от грибного к кустарниковому режиму отличается высокой неоднородностью и проявляется в плохо охарактеризованных условиях полимера, важно использовать хорошо охарактеризованные условия для скученности на полимерно-привитых мембранах. По сравнению с недавним исследованием20, мы идентифицируем и сообщаем о переполненных мембранных композициях, которые поддерживают диффузный транспорт и активность трансмембранных биомолекул.

В этом протоколе мы обсуждаем, как генерировать PEGylated липидные мембраны и предоставляем рекомендации для плотностей ПЭГ, которые имитируют скученность в двух разных режимах полимерной конфигурации (а именно, гриб и щетка). Протокол также описывает связывание одной молекулы, отслеживание частиц и сбор и анализ данных фотоотбеливания для молекул, встроенных в эти переполненные мембраны. Во-первых, мы описываем этапы тщательной очистки, сборку камеры визуализации и генерацию PEG-SLB. Во-вторых, мы предоставляем подробную информацию для экспериментов по связыванию одной молекулы, отслеживанию частиц и фотоотбеливанию. В-третьих, мы обсуждаем i) извлечение относительных сродств связывания, ii) характеристику молекулярной диффузии и iii) подсчет субъединиц в сборке белка из фильмов отдельных молекул на мембране.

Хотя мы охарактеризовали эту систему с помощью одномолекулярной визуализации, протокол полезен для всех мембранных биофизиков, заинтересованных в понимании влияния скученности на биомолекулярные реакции на липидные мембраны. В целом, мы представляем надежный конвейер для создания переполненных и поддерживаемых липидных бислоев, а также различные одномолекулярные анализы, проведенные на них, и соответствующие процедуры анализа.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Очистка слайда и крышки для одномолекулярных экспериментов

  1. Перед сборкой камеры визуализации очистите и подготовьте как крышки, так и слайды. Просверлите несколько пар отверстий на стеклянных слайдах с помощью сверлильного станка с алмазным покрытием (диаметром 0,5-1 мм). Если используются акриловые листы, используйте лазерный резак для создания точных отверстий (0,5 мм), как показано на рисунке 1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая пара отверстий будет выступать в качестве входного и выходного отверстия для обмена потока для отдельной микрофлюидной камеры. Репрезентативный файл САПР для отверстий в акриловом слайде доступен в дополнительном файле кодирования 1. Отверстия, просверленные на стеклянных горках, обычно оказываются в 1,5-2 раза больше, чем размер сверла.
  2. Очистите слайды и крышки моющим средством. Тщательно промойте их деионизированной водой. Поместите горки и крышки в отдельную банку для окрашивания слайдов (Coplin) с водой и ультразвуком в ультразвуковом аппарате ванны на 30 минут. Для всех этапов обработки ультразвуком используйте настройку мощности 70 Вт.
  3. Удалите воду и наполните банку Coplin, содержащую стеклянные слайды и крышки, ацетоном до краев (50-100 мл в зависимости от объема банки). В случае акриловых листов используйте тот же объем предварительно смешанного 50% (v/v) раствора ацетона, иначе слайды станут морозными. Встряхните банку Coplin, чтобы убедиться, что все слайды и крышки полностью погружены в раствор, и храните ультразвуком в сонистаторе ванны в течение 30 минут.
  4. Извлеките ацетон и выбросьте его в контейнер для отходов, налейте метанол в банки Coplin (50%, v/v для акриловых слайдов) и храните ультразвуком в течение 30 минут. Как ацетон, так и метанол используются для удаления органических частиц на слайдах.
  5. Промойте горки и крышки обильным количеством воды типа 1 и поместите их в стеклянную банку Coplin. Вылейте 1 М KOH раствор в банку и храните ультразвуком в течение 1 ч. Для акриловых горок используйте 0,5 М KOH.
  6. Выбросьте KOH в контейнер для неорганических отходов. Промойте банку большим количеством воды и поместите банки Coplin в вытяжку для обработки пираньей. Не выполняйте обработку пираньей для акриловых горок; непосредственно перейдите к шагу 1.9.
    ВНИМАНИЕ: Лечение пираньей должно проводиться в вытяжном шкафу с соответствующими перчатками, защитными очками и фартуком для работы с кислотами. Раствор пираньи является сильным окислителем, и он удаляет любые оставшиеся органические частицы со слайдов и обложек.
  7. Для приготовления раствора пираньи аккуратно насыпьте 2/3 объема серной кислоты (98%, v/v) в стеклянный стакан и заполните остальное перекисью водорода (30%, v/v). Тщательно смешайте раствор со стеклянным стержнем, налейте его в банку Coplin и оставьте банку Coplin в вытяжном шкафу не менее чем на 1 ч.
  8. Раствор пираньи из банки Coplin можно поместить в контейнер для выбрасывания кислотных отходов, хранящихся внутри вытяжного шкафа. Промойте банку Коплина обильным количеством воды типа 1.
  9. Высушите горки и крышки в нежной струе газообразного азота и поместите их в чистую банку Coplin. Высушенные горки и крышки теперь готовы к плазменной обработке. Возьмите пару слайдов и обложек и поместите их в плазменную машину.
  10. Создайте вакуум в камере. Поверните ручку на радиочастоту 8-12 МГц для генерации плазмы в камере. Фиолетовое свечение внутри камеры будет указывать на образование плазмы в камере.
  11. Проводят плазменную обработку в течение 8-10 мин. Осторожно освободите вакуум после выключения плазмы и перейдите к этапу 2 для сборки микрофлюидной камеры визуализации.

2. Сборка микрофлюидной камеры

ПРИМЕЧАНИЕ: Камера визуализации создается путем сэндвичинга двусторонней ленты между предварительно очищенным чехлом и слайдом с предыдущего этапа, как описано ниже.

  1. Соберите слайды и крышки после плазменной обработки, как показано на рисунке 1. Поместите стеклянный слайд на чистую папиросную бумагу. Разрежьте двухстороннюю ленту на полоски шириной ~2-3 мм и поместите их с каждой стороны пары отверстий на стеклянной горке. Используйте наконечник пипетки, чтобы сгладить ленту, иначе это приведет к утечке из одного канала в другой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, вырежьте ленту для всего слайда с помощью лазерного или автоматизированного плоттерного резака (рисунок 1).
  2. Поместите обработанную плазмой крышку на заклеенный затвор, чтобы закрыть камеру. Используйте наконечник пипетки, чтобы осторожно надавить крышкой на заклеенные области, чтобы сделать канал водонепроницаемым.
  3. При использовании стеклянных слайдов запечатайте края с помощью эпоксидной смолы. Наконец, каждая камера визуализации, изготовленная из слайда и крышки, имеет размеры 10 мм x 2 мм x 0,1 мм (длина x ширина x глубина). Хранить подготовленные микрофлюидные камеры визуализации в течение 1-2 недель в высушенных условиях (предпочтительно между 10-25 °C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для лент лазерной резки, используемых с акриловыми слайдами, нет необходимости использовать эпоксидную смолу, поскольку края ленты образуют плотное герметичное уплотнение.

3. Изготовление опорных бислоев на стеклянной подложке методом плавления везикул

ПРИМЕЧАНИЕ: Переполненные поддерживаемые липидные бислои образуются на стенках камеры визуализации путем слияния липидных везикул, полученных с легированными PEG-липидами.

  1. Возьмите чистый стеклянный флакон, желательно предварительно очищенный с помощью раствора пираньи. Добавляют раствор хлороформа 1-пальмитоил-2-олеоил-глицеро-3-фосфохолина (POPC) и 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина-N-[амино(полиэтиленгликоль)-2000] (DOPE-PEG2000) на желаемую мольную фракцию липидов PEG2000 таким образом, чтобы конечная концентрация после добавления буфера составляла 3 мМ липидов на стадии 3.4. Аналогичным образом готовят другие мембранные композиции липидов.
  2. Высушите хлороформ из флакона с помощью мягкой струи азота с небольшим вихрем так, чтобы высушенные липиды равномерно покрывались на поверхности флакона. Поместите флакон в вакуумный осушитель на 1 ч. Это удалит любой остаточный хлороформ в стеклянном флаконе. Добавьте 1 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) и инкубируйте в течение ночи при 37 °C.
  3. Приготовьте небольшие одноламеллярные везикулы (SUV), как описано ниже.
    1. Осторожно вихрь в течение 1-2 мин после ночной инкубации до тех пор, пока раствор не станет мутным и молочным.
    2. Возьмите 100 мкл этого раствора в небольшой центрифужной трубке объемом 500 мкл и соникуйте в течение примерно 1 ч в ультразвуковом аппарате для ванны (устанавливается при мощности 70 Вт). Решение станет ясным; если нет, то настаивайте ультразвуком в течение дополнительных 30 минут. На этом этапе будут генерироваться внедорожники диаметром 50-100 нм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При подготовке впервые охарактеризуйте внедорожники с помощью динамического рассеяния света22,23 (DLS) или эквивалентного метода.
  4. Добавьте хлорид кальция (CaCl2, 3 M штучки) в обработанные ультразвуком везикулы таким образом, чтобы его конечная концентрация в растворе липидов составляла 30 мМ.
  5. Вырежьте наконечник микропипетки для введения раствора образца так, чтобы он плотно прилегал к отверстию. Смешайте липидный раствор и введите через одно из отверстий в камере визуализации, сделанных на этапе 2. Протрите лишний раствор, выходящий из камеры из розетки, чистой тканью, чтобы предотвратить загрязнение соседних каналов.
  6. Оставьте этот узел в увлажненной камере на 90 минут. Подготовьте увлажняющую камеру, поместив влажную ткань на конец трубки центрифуги объемом 50 мл. Поместите затвор боком внутрь трубки с закрытыми крышками труб. Везикулы будут сливаться и генерировать однородный бислой на поверхности стекла.
  7. Тщательно промыть камеру обильным количеством буфера PBS (примерно в 5 раз больше объема камеры визуализации). Предотвратите попадание пузырьков воздуха в камеру во время промывки, так как это может привести к дефектам мембраны.

4. Установка микроскопа и измерения одночастичной визуализации

ПРИМЕЧАНИЕ: Одномолекулярные эксперименты проводятся на объективной установке флуоресцентного микроскопа с полной внутренней отражением 24,25,26 (TIRF) (рисунок 2). Визуализация TIRF обеспечивает лучшее соотношение сигнал/шум для одномолекулярной визуализации, хотя эпифлуоресцентные микроскопы также могут использоваться при определенных условиях (особенно когда флуоресцентные биомолекулы могут быть удалены из объемного раствора путем промывки). Можно использовать TIRF призменного типа, но объектив предпочтительнее для удобства настройки микрофлюидики27. Для TIRF типа объектива рекомендуется объектив с высокой числовой апертурой (100-кратное увеличение, обычно коммерчески доступное в качестве цели TIRF).

  1. Перед проведением любого эксперимента по мобильности и сборке выровняйте микроскоп TIRF, чтобы обеспечить оптимальное соотношение сигнал/шум за счет освещения испаряющимся полем. Во время выравнивания держите мощность лазера на низком уровне, от 100 мкВт до 1 мВт.
    ВНИМАНИЕ: Лазерные защитные очки следует использовать во время выравнивания лазерного луча.
    1. Чтобы выровнять микроскоп, подготовьте образец флуоресцентных шариков, добавив их в микрофлюидный канал при низких концентрациях (при ~100 пМ), чтобы флуоресцентные пятна от одиночных шариков не перекрывались на изображениях.
    2. Во-первых, визуализируйте бусины в режиме эпифлуоресценции. Пока освещение находится в режиме эпифлуоресценции, переместите ступень зеркального перевода M5 (зеркало, которое отражает лазер на дихроику) таким образом, чтобы луч, выходящий из объектива, изгибался до тех пор, пока он в конечном итоге не окажется в полной конфигурации внутреннего отражения.
    3. Проверить, достигнуто ли освещение МДП. Когда испаряющееся поле МДП освещает образец бусины, убедитесь, что видны только бусины на поверхности и не наблюдаются свободно плавающие бусины вдали от поверхности.
  2. В начале эксперимента установили мощность лазера в задней фокальной плоскости объектива на 5-10 мВт для предотвращения фоторазрушения (фотоотбеливания) флуорофоров.
  3. Держите слайд на ступени микроскопа и сначала сосредоточьтесь на голой мембране (без флуорофоров). Обычно для этого достаточно небольших следов примесей в липидных мембранах. Необязательно: Включите небольшое количество флуоресцентных шариков или квантовых точек (субпикомолярный диапазон) на этапе 3.1, так что только от двух до пяти флуоресцентных частиц присутствуют в поле зрения, чтобы облегчить идентификацию правильного фокуса.
  4. Введите образец (мембранные белки и т.д.) с помощью микропипетки в камеру визуализации с покрытием PEG-SLB, изготовленную на этапе 3.7.
  5. Для измерения кинетики связывания с одной молекулой используйте шприцевой насос для пропуска меченых биомолекул через входные отверстия в микрофлюидную камеру (рисунок 3). Используйте расход 50-500 мкл/мин.
    1. Начните сбор пленки, прежде чем добавлять решение в камеру обработки изображений. Получайте >5000 кадров со скоростью кадров 25-50 кадров/с при непрерывном потоке до тех пор, пока не произойдет дальнейшего увеличения появления новых пятен на поверхности мембраны (Видео 1). Для анализа кинетики связывания выполните действия, описанные в пункте 6.1.
  6. Для отслеживания одиночных частиц добавьте меченые биомолекулы в низких концентрациях (по сравнению с константой связывания) в канал с помощью микропипетки. Оптимизируйте концентрацию до плотности <0,1 частицы/мкм2 , чтобы отдельные частицы редко пересекались (Видео 2). Это обеспечивает высокую точность треков, восстановленных из наборов данных. Инкубировать при необходимости (в случае плохого связывания мембраны биомолекулами, ~10 мин) в увлажняющей среде и промыть камеру буфером.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Промывка необходима в случае, если связывание плохое на мембране и большинство флуоресцентных молекул остаются в растворе. В противном случае это может помешать визуализации и привести к плохому соотношению сигнал/шум.
  7. Для анализа траектории одной частицы получите 200-500 кадров со скоростью 10-100 кадров/с. Поддерживайте фокусировку объектива на двухслойной плоскости с минимальным дрейфом ступени в течение интервала захвата.

5. Получение изображения для подсчета субъединиц в белковой сборке

ПРИМЕЧАНИЕ: Получение изображения для оценки стехиометрии требует непрерывного отбеливания флуорофоров и определения количества шагов до тех пор, пока флуорофоры больше не будут излучать флуоресценцию.

  1. Для измерения субъединиц добавить соответствующую концентрацию меченых биомолекул (пример: см. результаты; ClyA добавляли при концентрации 25 нМ) в микрофлюидную камеру визуализации и инкубат (промывали при необходимости). Инкубируйте затвор в увлажняющей камере при желаемой температуре в течение необходимого количества времени (пример: 37 °C и 60 мин для сборки ClyA).
  2. Выполняйте получение изображений для одномолекулярного фотоотбеливания, как описано ниже.
    1. Промывайте камеру визуализации буфером перед визуализацией (при необходимости). Поместите слайд на микроскоп и отрегулируйте фокус, чтобы визуализировать меченые молекулы.
    2. Установите мощность лазера на уровень, при котором отбеливание флуорофора происходит постепенно (~1-5 мин). В идеале, для каждой собранной биомолекулы, держите скорость шага фотоотбеливания >10-20 кадров изображения друг от друга. Получайте изображения до тех пор, пока все молекулы не будут полностью фотоотбелены (Видео 3).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы определить общую продолжительность требуемой траектории фотоотбеливания, нанесите среднюю интенсивность отдельных пятен с количеством кадров изображения и определите постоянную времени путем установки экспоненциальной функции распада. Общая продолжительность приобретения может быть установлена в 5-10 раз больше постоянной времени.
  3. Выполните зависящее от времени измерение сборки, начав сбор пленки, как только образец вводится в камеру, и приобретая новые пленки фотоотбеливания через фиксированные промежутки времени после связывания мембраны из разных сегментов PEG-SLB.

6. Анализ изображений и данных

  1. Выполните связывание и отслеживание одиночных частиц, как описано ниже.
    1. Извлеките траектории одиночных частиц из фильмов, полученных выше, как показано на рисунке 4. Для обнаружения отдельных частиц и их отслеживания используйте пакет MATLAB, u-track28 или Trackmate29, плагин в ImageJ, который также обеспечивает надежный алгоритм отслеживания одной частицы. Выполните действия по настройке анализа u-track, как показано в дополнительном файле 1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Критическими параметрами для отслеживания одной частицы являются стандартное отклонение размера частицы (в пикселях) и длина закрытия зазора. Используйте 1 и 0 соответственно для этих параметров в качестве наиболее строгих критериев отслеживания.
    2. Чтобы рассчитать константы скорости связывания, сначала оцените количество частиц, связывающихся с поверхностью мембраны с течением времени. Используйте файл MATLAB binding_SPT (Дополнительный файл кодирования 2) с выходной папкой u-track для идентификации и построения графика количества частиц, появляющихся на мембране, полученной из шага 6.1. Подгонка наблюдаемой кинетики к соответствующим кинетическим моделям (пример: одинарная экспоненциальная подгонка для определения константы времени, обратная из которой может быть присвоена кажущейся константе скорости)30 для извлечения констант скорости (см. результаты, рисунок 5).
    3. Среднеквадратичное смещение (MSD) диффузионных частиц (таких как индикатор ДНК в PEG-SLB, рисунок 6) указывает на природу диффузии. Используйте пакет MATLAB MSD_ISD (Supplementary Coding File 2) с выходной папкой u-track для получения графика MSD в зависимости от времени задержки (рисунок 6B).
    4. Чтобы идентифицировать гетерогенные диффузные виды, рассчитайте распределения мгновенного квадратного смещения (ISD), как показано на рисунке 6C. ISD2, определяемый как (Xt+τ - Xt)2 + (Yt+τ− Yt)2, где время задержки, τ = 2, является предпочтительным, поскольку оно уменьшает шум. Отфильтруйте короткие траектории с менее чем тремя кадрами, чтобы уменьшить шум.
    5. Используйте ISD_analyzer (Файл дополнительного кодирования 2) в MATLAB с u-трековым выходом для построения ISD отслеживаемых частиц (рисунок 6C).
  2. Выполните одномолекулярный анализ фотоотбеливания, как описано ниже.
    1. Для оценки стехиометрии мембранных комплексов выполняют фотоотбеливающий анализ зависящих от времени интенсивностей флуоресцентных комплексов (Видео 3). Для этого примените алгоритм коррекции дрейфа (drift_correct_images, Supplementary Coding File 2) на основе автокорреляции кадров фильма для извлечения дрейфа перевода. Это предполагает, что собранные структуры в значительной степени неподвижны во время получения изображения. Запустите пакет MATLAB Extract_traces_1C (дополнительный файл кодирования 2), чтобы обнаружить следы времени интенсивности частиц из фильмов.
    2. Используйте Stepcount_immobile кода MATLAB (файл дополнительного кодирования 2) для выполнения определения шага для трассировки времени интенсивности. В случае, если частицы не неподвижны, используйте пакет u-track для извлечения местоположения движущихся частиц. Этот набор координат xy может быть сопоставлен с необработанными фильмами для извлечения значений интенсивности движущейся частицы, когда она диффундирует поперек на мембране. Используйте пакет MATLAB utrack_Int (Файл дополнительного кодирования 2) с выходными данными анализа u-track для этого параметра.
    3. Выполните коррекцию неполной маркировки биомолекул флуорофорными метками для оценки правильной стехиометрии белкового комплекса. Определите эффективность маркировки с помощью спектрофотометра UV-VIS путем измерения поглощения красителя и белка для оценки концентрации. Рассчитайте эффективность маркировки как молярное отношение красителя к белку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые красители также поглощают на длинах волн, близких к 280 нм, и, следовательно, этот вклад поглощения красителем должен быть учтен при расчете концентрации.
    4. Выполните биномиальную коррекцию для учета неполной эффективности маркировки флуорофора следующим образом, используя код MATLAB Step_correction (Файл дополнительного кодирования 2) с данными, полученными в результате подсчета шагов на шаге 6.2.2. Например, для порообразующего токсина, такого как цитолизин А, который образует додекамерную кольцеобразную структуру, применяют биномиальную коррекцию по следующей формуле:
      нкfigure-protocol-1
      где figure-protocol-2 = эффективность маркировки, n = количество шагов фотоотбеливания, а s = фактические подсчеты. Используйте рутинную Stepcount_immobile MATLAB для восстановления скорректированных олигомерных видов. Преобразование частоты олигомеров (si) в массовые доли (рисунок 7C; Дополнительный кодовый файл 2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Набор анализируемых вами файлов включен в Файл дополнительного кодирования 3. Коды MATLAB в файле дополнительного кодирования 2 могут быть запущены с этими наборами данных.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мониторинг связывания белка ClyA на peGylated мембранах
После этапа 4.5 кинетику связывания оценивают путем построения графика количества частиц, связывающихся с поверхностью мембраны с течением времени (видео 1). Поскольку белок ClyA связывается с мембраной с 5 моль% липидов PEG2000, плотность частиц увеличивается и достигает насыщения (рисунок 5). Экспоненциальный распад, прилегающий к связанным частицам (голубым кругам), дает постоянную времени (τ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы демонстрируем одномолекулярные эксперименты на поддерживаемых липидных бислоях (SLB), которые демонстрируют переполненную среду для мембранных биомолекул. Переполненная среда генерирует эффект исключенного объема, приводящий к усилению биомолекулярныхреакций 1,2,39,40. Для ПЭГ-липидной системы, где полимер в первую очередь занимает объем вне бислоя, этот эффект особенно выражен для мол...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы признают профессора Бенджамина Шулера за то, что он поделился экспрессионной плазмидой для белка ClyA. Эта работа была поддержана Программой Human Frontier Science Program (RGP0047-2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Шприцы 2,5 млHMD HealthcareDispo Van, 2,5 мл Туберкулиновыйпластиковый шприц
АцетонFinar Chemicals10020LL025
Акриловый листтолщиной 2 мм
Акриловый листBigiMall2 мм, прозрачная
ванна СоникаторBransonCPX-1800
Хлорид
ХлороформСигма528730  Класс ВЭЖХ
ХолестеринAvanti700100
Coplin JarDuran Wheaton KimbleS60168 Slide Jar со стеклянной крышкой
CoverslipsVWR631-157424 мм X 50
мм Cy3-DNA StrandIDTGCTGCTATTGCGTCCGTTTGGTT
GGTGTGGTTGG-Cy3
Цианиновый краситель (Cy3)Cytiva Life SciencesPA23001
DiIинвитрогенD3911дил краситель (1,1'-диоктадецил-3,3,3',3'-тетраметилиндокарбоцианина перхлорат ('DiI'; DiIC18(3)))
DNA Connector Strand 1Sigma AldrichGCTGCTATTGCGTCCGTTTAGCT
GGGGGAGTATTGCGGAGGAAGC
T
DNA Connector Strand 2Sigma AldrichCGGACGCAATAGCAGCTCACAG
TCGGTCACAT
DNA Tocopherol StrandBiomersToco-CCCAATGTGACCGACTGA
DOPE-PEG2000Avanti8801301,2-диолеол-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси(полиэтиленгликоль)-2000] (соль аммония)
Двухсторонняя лента3MLF93010LE
сверла (с алмазным покрытием)0,5 - 1 мм
Сверлильный станокDremel220Рабочая станция
EMCCDAndorDU-897U-CS0-#BV
Флуоресцентные шарикиInvitrogenF10720
Стеклянные предметные стеклаBlue StarMicro Slides, PIC-1
Стеклянные флаконыSigma854190
Перекись водородаLobachemie0018230% раствор,
AR Grade LaboleneThermo-Fischer Scientific 
Моющий лазер 532 нмКогерентныйсапфировый
лазерный резакУниверсальные лазерные системыILS12.75
Лиссамин Родамин DOPEAvanti8101501,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-(лиссамин родамин B сульфонил) (соль аммония)
МетанолFinar Chemicals30932LL025
МикроскопOlympusIX81
Фосфатный буфер солевого раствора (PBS)1X
Очиститель плазмыHarrick Plasma IncPDC-002
POPCAvanti8504571-пальмитоил-2-олеоил-глицеро-3-фосфохолин
Программируемый шприцевой насосNew Era Pump SystemsNE1010Шприцевой насос высокого давления
Колпачки из ПТФЭ Sigma27141
Трубка из ПТФЭCole-ParmerWW-06417-21Masterflex, 0,022" ID x 0,042" OD
Серная кислотаSD Fine Chemicals98%, AR Grade
TIRF ObjectiveOlympusUPLAPO100XOHR
вакуумный эксикаторTarsons
Vortex MixerTarsons
кальция

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Löwe, M., Kalacheva, M., Boersma, A. J., Kedrov, A. The more the merrier: Effects of macromolecular crowding on the structure and dynamics of biological membranes. The FEBS Journal. 287 (23), 5039-5067 (2020).
  2. Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K., Uversky, V. N. What macromolecular crowding can do to a protein. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 23090-23140 (2014).
  3. Horton, M. R., Höfling, F., Rädler, J. O., Franosch, T. Development of anomalous diffusion among crowding proteins. Soft Matter. 6 (12), 2648-2656 (2010).
  4. Jeon, J. H., Javanainen, M., Martinez-Seara, H., Metzler, R., Vattulainen, I. Protein crowding in lipid bilayers gives rise to non-Gaussian anomalous lateral diffusion of phospholipids and proteins. Physical Review X. 6 (2), 021006(2016).
  5. Zhang, Y., et al. The influence of molecular reach and diffusivity on the efficacy of membrane-confined reactions. Biophysical Journal. 117 (7), 1189-1201 (2019).
  6. Loverdo, C., Bénichou, O., Moreau, M., Voituriez, R. Enhanced reaction kinetics in biological cells. Nature Physics. 4 (2), 134-137 (2008).
  7. Monine, M. I., Haugh, J. M. Reactions on cell membranes: Comparison of continuum theory and Brownian dynamics simulations. Journal of Chemical Physics. 123 (7), 074908(2005).
  8. Berry, H. Anomalous diffusion due to hindering by mobile obstacles undergoing Brownian motion or Orstein-Ulhenbeck processes. Physical Review E. 89 (2), 22708(2014).
  9. Saxton, M. J. Anomalous diffusion due to obstacles: A Monte Carlo study. Biophysical Journal. 66 (2), 394-401 (1994).
  10. Andersson, J., Fuller, M. A., Wood, K., Holt, S. A., Köper, I. A tethered bilayer lipid membrane that mimics microbial membranes. Physical Chemistry Chemical Physics. 20 (18), 12958-12969 (2018).
  11. Kaufmann, S., Papastavrou, G., Kumar, K., Textor, M., Reimhult, E. A detailed investigation of the formation kinetics and layer structure of poly(ethylene glycol) tether supported lipid bilayers. Soft Matter. 5 (14), 2804-2814 (2009).
  12. Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. Lipid membranes with grafted polymers: Physicochemical aspects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).
  13. Labouta, H. I., et al. Surface-grafted polyethylene glycol conformation impacts the transport of PEG-functionalized liposomes through a tumour extracellular matrix model. RSC Advances. 8 (14), 7697-7708 (2018).
  14. Lee, H., Larson, R. G. Adsorption of plasma proteins onto PEGylated lipid bilayers: The effect of PEG size and grafting density. Biomacromolecules. 17 (5), 1757-1765 (2016).
  15. Richter, R. P., Bérat, R., Brisson, A. R. Formation of solid-supported lipid bilayers: An integrated view. Langmuir. 22 (8), 3497-3505 (2006).
  16. Andersson, J., et al. Solid-supported lipid bilayers - A versatile tool for the structural and functional characterization of membrane proteins. Methods. 180, 56-68 (2020).
  17. Duncan, A. L., et al. Protein crowding and lipid complexity influence the nanoscale dynamic organization of ion channels in cell membranes. Scientific Reports. 7 (1), 1-15 (2017).
  18. Garenne, D., Libchaber, A., Noireaux, V. Membrane molecular crowding enhances MreB polymerization to shape synthetic cells from spheres to rods. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (4), 1902-1909 (2020).
  19. Pollock, N. L., Lee, S. C., Patel, J. H., Gulamhussein, A. A., Rothnie, A. J. Structure and function of membrane proteins encapsulated in a polymer-bound lipid bilayer. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1860 (4), 809-817 (2018).
  20. Coker, H. L. E., et al. Controlling anomalous diffusion in lipid membranes. Biophysical Journal. 116 (6), 1085-1094 (2019).
  21. Rex, S., Zuckermann, M. J., Lafleur, M., Silvius, J. R. Experimental and Monte Carlo simulation studies of the thermodynamics of polyethyleneglycol chains grafted to lipid bilayers. Biophysical Journal. 75 (6), 2900-2914 (1998).
  22. Hallett, F. R., Watton, J., Krygsman, P. Vesicle sizing number distributions by dynamic light scattering. Biophysical Journal. 59 (2), 357-362 (1991).
  23. Jin, A. J., Huster, D., Gawrisch, K., Nossal, R. Light scattering characterization of extruded lipid vesicles. European Biophysics Journal. 28 (3), 187-199 (1999).
  24. Axelrod, D. Chapter 7: Total internal reflection fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 89, 169-221 (2008).
  25. Fish, K. N. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Current Protocols in Cytometry. 50 (1), 1-13 (2009).
  26. Fiolka, R., Belyaev, Y., Ewers, H., Stemmer, A. Even illumination in total internal reflection fluorescence microscopy using laser light. Microscopy Research and Technique. 71 (1), 45-50 (2008).
  27. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
  28. Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).
  29. Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  30. Jarmoskaite, I., Alsadhan, I., Vaidyanathan, P. P., Herschlag, D. How to measure and evaluate binding affinities. eLife. 9, 57264(2020).
  31. Sathyanarayana, P., et al. Cholesterol promotes Cytolysin A activity by stabilizing the intermediates during pore formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (31), 7323-7330 (2018).
  32. Mueller, M., Grauschopf, U., Maier, T., Glockshuber, R., Ban, N. The structure of a cytolytic alpha-helical toxin pore reveals its assembly mechanism. Nature. 459 (7247), 726-730 (2009).
  33. Hubicka, K., Janczura, J. Time-dependent classification of protein diffusion types: A statistical detection of mean-squared-displacement exponent transitions. Physical Review E. 101 (2), 1-13 (2020).
  34. Kepten, E., Weron, A., Sikora, G., Burnecki, K., Garini, Y. Guidelines for the fitting of anomalous diffusion mean square displacement graphs from single particle tracking experiments. PLoS ONE. 10 (2), 0117722(2015).
  35. Persson, F., Lindén, M., Unoson, C., Elf, J. Extracting intracellular diffusive states and transition rates from single-molecule tracking data. Nature Methods. 10 (3), 265-269 (2013).
  36. McGuire, H., Aurousseau, M. R. P., Bowie, D., Blunck, R. Automating single subunit counting of membrane proteins in mammalian cells. The Journal of Biological Chemistry. 287 (43), 35912-35921 (2012).
  37. Hines, K. E. Inferring subunit stoichiometry from single molecule photobleaching. The Journal of General Physiology. 141 (6), 737-746 (2013).
  38. Zhang, H., Guo, P. Single molecule photobleaching (SMPB) technology for counting of RNA, DNA, protein and other molecules in nanoparticles and biological complexes by TIRF instrumentation. Methods. 67 (2), 169-176 (2014).
  39. Phillip, Y., Schreiber, G. Formation of protein complexes in crowded environments-From in vitro to in vivo. FEBS Letters. 587 (8), 1046-1052 (2013).
  40. Mittal, S., Chowhan, R. K., Singh, L. R. Macromolecular crowding: Macromolecules friend or foe. Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1850 (9), 1822-1831 (2015).
  41. Mashaghi, S., van Oijen, A. M. A versatile approach to the generation of fluid supported lipid bilayers and its applications. Biotechnology and Bioengineering. 111 (10), 2076-2081 (2014).
  42. Wong, W. C., et al. Characterization of single-protein dynamics in polymer-cushioned lipid bilayers derived from cell plasma membranes. The Journal of Physical Chemistry B. 123 (30), 6492-6504 (2019).
  43. Shashkova, S. S., Leake, M. C. Single-molecule fluorescence microscopy review: Shedding new light on old problems. Bioscience Reports. 37 (4), 20170031(2017).
  44. Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. C. Advanced fluorescence microscopy techniques-FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047(2012).
  45. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  46. Carter, B. C., Vershinin, M., Gross, S. P. A comparison of step-detection methods: How well can you do. Biophysical Journal. 94 (1), 306-319 (2008).
  47. Otsuka, S., Ellenberg, J. Mechanisms of nuclear pore complex assembly - Two different ways of building one molecular machine. FEBS Letters. 592 (4), 475(2018).
  48. Tsekouras, K., Custer, T. C., Jashnsaz, H., Walter, N. G., Pressé, S. A novel method to accurately locate and count large numbers of steps by photobleaching. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3601-3615 (2016).
  49. Bryan, J. S., Sgouralis, I., Pressé, S. Enumerating high numbers of fluorophores from photobleaching experiments: A Bayesian nonparametrics approach. bioRxiv. , (2020).
  50. Bryan, J. S., Sgouralis, I., Pressé, S. Diffraction-limited molecular cluster quantification with Bayesian nonparametrics. Nature Computational Science. 2 (2), 102-111 (2022).
  51. Kim, Y., et al. Efficient site-specific labeling of proteins via cysteines. Bioconjugate Chemistry. 19 (3), 786-791 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Molecule DiffusionPolymer Crowded MembranesSupported Lipid BilayerPEG Conjugated LipidsSingle Molecule TrackingTIRF MicroscopyMembrane Protein AssemblyCytolysin A BindingParticle Tracking AnalysisPhotobleaching Analysis

Related Articles