Method Article

Визуализация конформационной динамики мембранных рецепторов с помощью одномолекулярного FRET

DOI:

10.3791/64254

⸱

August 17th, 2022

 ,  , 
1Department of Molecular Biosciences, Northwestern University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании представлена подробная процедура проведения экспериментов по переносу энергии одномолекулярного флуоресцентного резонанса (smFRET) на рецепторах, связанных с G-белком (GPCR), с использованием сайт-специфической маркировки через включение неестественных аминокислот (UAA). Протокол содержит пошаговое руководство по подготовке образцов smFRET, экспериментам и анализу данных.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Способность клеток реагировать на внешние сигналы имеет важное значение для клеточного развития, роста и выживания. Чтобы реагировать на сигнал из окружающей среды, клетка должна уметь распознавать и обрабатывать его. Эта задача в основном опирается на функцию мембранных рецепторов, роль которых заключается в преобразовании сигналов в биохимический язык клетки. Рецепторы, связанные с G-белком (GPCR), составляют крупнейшее семейство мембранных рецепторных белков у людей. Среди GPCR метаботропные глутаматные рецепторы (mGluRs) являются уникальным подклассом, которые функционируют как облигатные димеры и обладают большим внеклеточным доменом, содержащим лиганд-связывающий сайт. Последние достижения в структурных исследованиях mGluRs улучшили понимание процесса их активации. Однако распространение крупномасштабных конформационных изменений через mGluRs во время активации и модуляции плохо изучено. Одномолекулярный флуоресцентный резонансный перенос энергии (smFRET) является мощным методом визуализации и количественной оценки структурной динамики биомолекул на уровне одного белка. Для визуализации динамического процесса активации mGluR2 были разработаны флуоресцентные конформационные датчики на основе включения неестественных аминокислот (UAA), которые позволили маркировать сайт-специфический белок без возмущения нативной структуры рецепторов. Протокол, описанный здесь, объясняет, как выполнять эти эксперименты, включая новый подход к маркировке UAA, подготовку образцов и сбор и анализ данных smFRET. Эти стратегии являются обобщаемыми и могут быть расширены для исследования конформационной динамики различных мембранных белков.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Передача информации через плазматическую мембрану сильно зависит от функции мембранных рецепторов1. Связывание лиганда с рецептором приводит к конформационному изменению и активации рецептора. Этот процесс часто носит аллостерический характер2. С более чем 800 членами, рецепторы, связанные с G-белком (GPCR), являются крупнейшим семейством мембранных рецепторов у людей3. Благодаря своей роли почти во всех клеточных процессах, GPCR стали важными мишенями для терапевтического развития. В канонической модели передачи сигналов GPCR активация агониста приводит к конформационным изменениям рецептора, которые впоследствии активируют гетеротримерный G-белковый комплекс путем обмена GDP на GTP в нуклеотидном карманеG-α. Активированные субъединицы Gα-GTP и Gβγ затем контролируют активность последующих эффекторных белков и распространяют сигнальный каскад 4,5. Этот сигнальный процесс существенно зависит от способности лигандов изменять трехмерную форму рецептора. Механистическое понимание того, как лиганды достигают этого, имеет решающее значение для разработки новых терапевтических средств и проектирования синтетических рецепторов и датчиков.

Метаботропные глутаматные рецепторы (mGluRs) являются членами семейства GPCR класса C и важны для медленных нейромодулирующих эффектов глутамата и настройки возбудимости нейронов 6,7. Среди всех GPCR GPCR класса C являются структурно уникальными в том смысле, что они функционируют как облигатные димеры. mGluRs содержат три структурных домена: домен венериной мухоловки (VFT), богатый цистеином домен (CRD) и трансмембранный домен (TMD)8. Конформационные изменения в процессе активации являются сложными и включают локальную и глобальную конформационную связь, которая распространяется на расстояние 12 нм, а также димерную кооперативность. Промежуточные конформации, временное упорядочение состояний и скорость перехода между состояниями неизвестны. Следуя конформации отдельных рецепторов в режиме реального времени, можно идентифицировать переходные промежуточные состояния и последовательность конформационных изменений во время активации. Это может быть достигнуто путем применения одномолекулярного флуоресцентного резонансного переноса энергии 9,10 (smFRET), как это было недавно применено для визуализации распространения конформационных изменений при активации mGluR211. Ключевым шагом в экспериментах FRET является генерация датчиков FRET путем специфической для сайта вставки донорских и акцепторных флуорофоров в интересующий белок. Стратегия включения неестественных аминокислот (UAA) была принята 12,13,14,15 для преодоления ограничений типичных технологий флуоресцентной маркировки, которые требуют создания мутантов без цистеина или вставки большой генетически закодированной метки. Это позволило наблюдать конформационную перестройку существенного компактного аллостерического линкера, который соединял лигандсвязывающий и сигнальный домены mGluR2. В этом протоколе представлено пошаговое руководство по проведению экспериментов smFRET на mGluR2, включая подход к маркировке mGluR2 с помощью UAA для присоединения флуорофоров с использованием катализируемой медью реакции циклизации азида. Более того, этот протокол описывает методологию прямого захвата мембранных белков и анализа данных. Протокол, изложенный здесь, также применим к изучению конформационной динамики других мембранных белков.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Общий рабочий процесс протокола описан на рисунке 1.

1. Подготовка пробоотборной камеры

  1. Очистка слайдов и крышек
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги направлены на очистку поверхностей слайдов, а также обшивки и подготовку их к аминосиланизации. Одним из важнейших требований для проведения одномолекулярных флуоресцентных экспериментов на поверхностно-привязанных молекулах является пассивированная поверхность. Наиболее надежный и воспроизводимый метод пассивации предполагает ковалентное прикрепление инертных полимерных цепей к поверхности стекла в виде плотного слоя. Полиэтиленгликоль (ПЭГ) является наиболее эффективным полимером, используемым для пассивации поверхности16. Подробности процедуры пассивации с использованием ПЭГ (ПЭГилирования) описаны ниже:
    1. Отметьте отверстия, которые необходимо просверлить на слайдах маркером (~6 мм друг от друга и в стороне от края). Используйте Dremel для сверления небольших отверстий (диаметром 1 мм) на стеклянной горке. Погружайте горки в воду во время процесса бурения.
    2. Промойте слайды ацетоном, чтобы удалить остатки чернил с маркера.
    3. Снимите с ацетона и промойте горки водой, затем разогрейте их в микроволновой печи в течение 5 минут в воде на высокой мощности (700 Вт).
    4. Очистите горки водой, прежде чем поместить их в стеклянную витражную банку для обработки ультразвуком. Поместите крышки в другую банку для окрашивания.
    5. Обрабатывайте слайды и крышки в ацетоне в течение 30 мин в ультразвуковом аппарате ванны при 23 °C.
    6. Тем временем очистите стеклянную колбу для приготовления раствора аминосиланизации, используемого на следующем этапе. Наполните колбу 1 М КОН, обжайте колбу ультразвуком в течение 30 мин, тщательно промойте КОХ водой, а затем в течение дополнительных 30 мин в метаноле нанесите ультразвук. Оставьте колбу в метаноле до момента стадии аминосиланизации.
    7. Тем временем удалите аминосилан, mPEG и биотин-ПЭГ из морозильной камеры (-20 ° C) и дайте им достичь комнатной температуры (RT) в темноте.
    8. Утилизируйте ацетон из слайда и закрывающих банок в соответствующем контейнере для химических отходов, тщательно промойте водой, а затем обработайте горки ультразвуком в 5 М КОН в течение 30 минут.
    9. Промойте горки и крышки водой, а затем обработайте метанол ультразвуком в течение 2 мин (повторите дважды). Оставьте банки, наполненные метанолом, до стадии аминосиланизации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В данном исследовании используется деионизированная вода, если не указано иное. Используется звуковой аппарат для ванны, работающий при 23 °C.
  2. Аминосиланизация
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг направлен на ковалентное связывание аминосилана с чистой поверхностью слайда и крышки. Функционализированные mPEG и биотин-ПЭГ будут ковалентно связываться с этой поверхностью на следующем этапе.
    1. Приготовьте аминосиланизационную смесь в чистой колбе (этап 1.6). Готовят раствор, смешивая метанол (150 мл), уксусную кислоту (7,5 мл, используйте стеклянную пипетку) и аминосилан (2,5 мл).
    2. Аккуратно перемешайте раствор в химической вытяжке, затем вылейте его в горку и закрывайте банки. Используйте 50 мл для обшивки и 100 мл для слайдов. Убедитесь, что слайды и крышки полностью погружены в решение.
    3. Инкубировать в течение 10 мин, затем обрабатывать банки ультразвуком в течение 1 мин (обработка ультразвуком удаляет примеси с поверхности) и инкубировать еще 10 мин.
    4. Утилизируйте раствор аминосиланизации в контейнер для сбора отходов. Добавьте метанол в банки, закройте банки крышками и аккуратно встряхните вручную. Утилизируйте метанол и наполните банки водой.
    5. Верните флакон с аминосиланом в морозильную камеру (−20 °C).
  3. ПЕГИЛИРОВАНИЕ
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги описывают процедуру ПЕГилирования.
    1. Во время аминосиланизации подготавливают пегилационный буфер. Взвесьте 84 мг бикарбоната натрия (NaHCO3) и добавьте его в 10 мл воды (10 мМ). Кроме того, взвесьте mPEG и биотин-PEG и отложите их в сторону. Для шести слайдов и обложек используйте 96 мг mPEG и 1,2-2,4 мг биотина-PEG.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно не добавлять слишком много биотина-ПЭГ, так как это может увеличить количество фоновых пятен. Не растворяйте смесь ПЭГ до непосредственного нанесения на слайды.
    2. Промойте горки водой, высушите их легким воздушным ударом, а затем поместите в увлажненные сборочные коробки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно использовать чистую авиакомпанию. Избегайте использования сжатого консервированного воздуха, который может оставить остатки на стекле.
    3. Добавьте пегилационный буфер в порошковую смесь ПЭГ и пипетку вверх и вниз осторожно несколько раз, чтобы растворить. Добавьте 55 мкл пегилационного буфера на слайд (для шести слайдов добавьте 330 мкл пегилационного буфера).
    4. Центрифуга при 9 600 х г в течение 1 мин при 23 °C для осаждения нерастворенных частиц. Соберите супернатант для использования на следующем шаге.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Биотин-ПЭГ быстро гидролизуется из-за присутствия группы NHS. Важно быстро выполнить этапы смешивания и центрифугирования.
    5. Нанесите 60 мкл раствора ПЭГилирования на каждый слайд, а затем поместите крышку сверху так, чтобы раствор ПЕГилирования был зажат между слайдом и крышкой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте введения пузырьков между слайдом и крышкой, так как это снизит эффективность пассивации. Удалите все пузырьки, отрегулировав крышку и слайд с помощью наконечника пипетки.
    6. Поместите слайды в плоский и темный ящик. Слайды можно хранить в течение ночи; однако инкубация в течение 4-6 ч приводит к оптимальной пассивации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно помнить, какая сторона пегилирована.
    7. Перед хранением отметьте непегилированную сторону. После инкубации аккуратно разберите и тщательно промойте горки и крышки водой.
    8. Высушите горки и крышки, обдувая воздухом. Держите слайды и крышки в стерильной трубке (50 мл), при этом полиэтиленовая поверхность обращена друг к другу. Хранить при −20 °C до дня эксперимента.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лучше всего использовать слайды и обложки в течение 4 недель после подготовки. ПЭГилированные поверхности должны быть обращены в сторону друг от друга. Хранение полиэтиленовых слайдов и чехлов в вакуумных пакетах может увеличить срок их хранения.

2. экспрессия mGluR2 с включенной неестественной аминокислотой, флуоресцентной маркировкой и экстракцией

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол описывает препарат, реагенты и лечение клеток для экспрессии mGluR2, содержащих UAA 4-азидо-L-фенилаланин (AZP). Процедура предназначена для клеток HEK293T, выращенных на стеклянных покровах толщиной 18 мм. Процедура может быть расширена по мере необходимости.

  1. Посев
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживать клетки HEK293T в ДМЭМ, дополненные 10% (v/v) фетальной бычьей сывороткой, 100 единиц·мл−1 пенициллин-стрептомицин и 15 мМ буфера HEPES (дополнительный файл 1) (рН 7,4) при 37 °C при 5% CO2.
    1. Пропускают клетки с 0,05% трипсина-ЭДТА. Семена heK293T клеток на стеклянных крышках из поли-L/D-лизина (PLL/PDL) таким образом, чтобы они достигали ≥80% конфюляции во время трансфекции.
  2. Трансфекция
    1. Приготовьте 40 мМ запасного раствора АЗП в 0,1 М NaOH.
    2. Подготовка среды, дополненной AZP, для выращивания клеток и экспрессии mGluR2. Дополняйте стандартные носители (+ FBS, ручка/стрептококк, 15 мМ HEPES) с использованием 40 мМ АЗП. Доведите конечную концентрацию AZP до 0,6 мМ. Добавьте 1 M раствора HEPES (добавлена половина объема 40 мМ раствора AZP). Например, для получения 10 мл АЗП, дополненной средой, смешайте 9,775 мл стандартной среды, 150 мкл 40 мМ раствора AZP и 75 мкл 1 M РАСТВОРА HEPES.
    3. Фильтруйте (стерилизуйте) среду с помощью шприцевого фильтра (0,2 мкм, PES).
    4. Замените стандартный носитель носителем, содержащим носитель, дополненный AZP, перед трансфекцией.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не высушить клетки во время замены среды.
    5. Трансфектируйте клетки трансфекционным реагентом (Таблица материалов) в соответствии с руководством производителя. Трансфектируйте клетки HEK293T на 18-миллиметровом покровном листе, используя в общей сложности 2 мкг ДНК (1000 нг тРНК/синтетазы + 1000 нг янтарной кодон-содержащей белковой плазмиды). В таблице 1 приведены сведения о концентрации и объеме используемых компонентов.
    6. Измените среду через 24 ч после трансфекции на свежую среду, дополненную AZP, и позвольте клеткам расти в течение дополнительных 24 ч.
  3. Маркировка алкиновыми цианиновыми красителями
    1. За 20 мин до маркировки дважды вымойте крышки теплым (37 °C) буфером записи (RB) (Дополнительный файл 1) и переместите их на теплый (37 °C) стандартный носитель без AZP (+ FBS, Pen/Strep, 15 мМ HEPES).
    2. Готовят маркировочный раствор, содержащий Cy3-алкин, Cy5-алкин, BTTES, сульфат меди (II) (CuSO4), (+) L-аскорбат натрия и аминогуанидин.
    3. Следуйте порядку создания и добавления решений (таблица 2):
      1. Подготовьте 50 мМ BTTES.
      2. Готовят 100 мМ аминогуанидина.
      3. Приготовить 100 мМ Na-аскорбата.
      4. Приготовить 655,5 мкл РБ.
      5. Добавьте алкиновый краситель Cy3/Cy5 (10 мМ в запасе DMSO) в RB.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте аминогуанидин в RB.
      6. Приготовьте 20 мМ CuSO4.
      7. Смешайте CuSO4 и BTTES в новой пробирке (раствор станет синим).
      8. Добавьте смесь CuSO4 и BTTES в RB (2.3.3.6.)
      9. Добавьте На-Аскорбат.
      10. Следуйте объему, приведенному в таблице 2 ниже, для 18-мм крышки.
    4. Тщательно перемешайте раствор и инкубируйте на льду и в темноте в течение 10 мин перед маркировкой клеток.
    5. Перед добавлением раствора для маркировки в обшивки извлеките носитель и промойте их RB. Добавляют маркировочный раствор и инкубируют в течение 15 мин при 37 °C в темных условиях.
    6. ПРИМЕЧАНИЕ: Для улучшения маркировки добавляют глутамат (конечная концентрация ~0,5 мМ) через 10 мин и инкубируют еще 5 мин. Медь очень токсична для клеток, и реакция маркировки не должна продолжаться более 15 мин in vivo. Приготовьте все компоненты свежими. Добавьте Na-аскорбат последним. Во время приготовления держите реакцию при температуре 4°C. Однако после добавления маркировочного раствора клетки должны храниться при температуре 37 °C внутри инкубатора.
  4. Сбор клеток и извлечение белков (лизис клеток)
    1. Удалите раствор для маркировки и дважды промойте крышку (18 мм), содержащую трансфектированные клетки mGluR2, RB.
    2. Используя пипетку, смойте ячейки с крышки и повторно суспендируйте в RB (1 мл).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Максимально сведите к минимуму воздействие света на образец после этого момента.
    3. Гранулируйте клетки, вращая при 1000 х г при 4 °C в течение 5 мин и удаляйте супернатант. Повторно суспендируют клеточную гранулу в 80-130 мкл раствора лизиса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гранула клетки должна быть видна на глаз. Объем лизиса зависит от количества образца, потерянного в процессе маркировки и промывки.
    4. Аккуратно перемешайте путем пипетки, чтобы разбить гранулу. Заверните в фольгу и поместите на коромысло при 4 °C в течение 0,5-1 ч для лизирования клеток.
    5. Гранулируют нерастворимую фракцию центрифугированием при 20 000 х г и 4 °С в течение 20 мин. Перенесите супернатант в свежую холодную трубку (лизированный белок, который содержит интересующий флуоресцентно помеченный белок) и храните его на льду для экспериментов.

3. Сборка и функционализация одномолекулярной проточной камеры

  1. Извлеките слайд и крышку из морозильной камеры и дайте им нагреться в RT в темноте (~30 мин).
  2. Соберите камеру с помощью двусторонней ленты, зажав полоски двусторонней ленты между слайдом и крышкой. Убедитесь, что ПЭГилированные поверхности образуют внутреннюю часть проточной камеры.
  3. Используя наконечник пипетки, нажмите на крышку, чтобы убедиться, что лента полностью соприкасается как с крышкой, так и со слайдом; позаботьтесь о том, чтобы не сломать крышку. Нанесите эпоксидную смолу на края слайдов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не добавляйте столько, чтобы эпоксидная смола заполняла просверленные отверстия.
  4. Поместите проточную камеру стороной крышки вниз в увлажненную темную коробку, чтобы эпоксидная смола высохла (~30 мин).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте буфер T50 (дополнительный файл 1) через просверленные отверстия, чтобы предотвратить покрытие эпоксидной смолой отверстий (10-15 мкл) в период сушки.
  5. Инкубируйте каждую полосу камеры с 500 нМ нейтравидина (разбавленного в Т50), медленно применяя ~ 40 мкл к каждой полосе.
  6. Инкубировать на RT в течение 2 мин внутри увлажненного темного ящика. Промывка с ~100 мкл буфера T50 на полосу.
  7. Инкубируйте каждую полосу камеры с 20 нМ биотинилированным антителом11. Выбор антитела зависит от метки на белке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если первичное антитело не биотинилировано, сначала инкубируют с биотинилированным вторичным антителом в течение 30 мин, а затем инкубируют с первичным антителом.
  8. Инкубировать на RT в течение 30 мин внутри увлажненного темного ящика. Мойка с ~200 мкл T50 на полосу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что полосы никогда не высыхают в процессе подготовки.

4. Одномолекулярные буферы

  1. Буфер тролокса
    ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер Trolox является начальным буфером для создания буфера изображений. Компоненты буфера зависят от эксперимента и могут варьироваться в зависимости от интересующего белка. Буфер, используемый в описанном здесь протоколе, включает соли (NaCl, KCl, CaCl2, MgCl2), буферный агент (HEPES) и тролокс (pH ~ 7,35).
    1. Растворите 9-10 мг Тролокса в 10 мл одномолекулярного регистрирующего буфера (SRB, Дополнительный файл 1)
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тролокс делает буфер слегка кислым. Регулируют рН на этом этапе с помощью раствора гидроксида натрия (NaOH), 10 М (рН 7,35). Тонкая регулировка pH будет произведена после полного растворения Тролокса; однако повышение рН в этой точке увеличивает растворимость тролокса.
    2. Перемешайте раствор на RT с помощью настольного коромысла в течение 4-8 ч (завернутого в алюминиевую фольгу) до полного растворения Тролокса.
    3. Проверьте pH и при необходимости отрегулируйте его.
    4. Убедитесь, что Тролокс полностью растворен. Стерилизовать раствор шприцевым фильтром и хранить при температуре 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер следует использовать после 2-10 дней выдержки. Тролокс помогает подавить моргание и обычно используется в одномолекулярных исследованиях17. Антимигающие свойства получены из окисленного производного Тролокса18; следовательно, рекомендуется держать его на RT в течение как минимум нескольких часов, чтобы созреть. Кроме того, УФ-излучение свежего раствора Тролокса ускоряет процесс окисления и может быть использовано для ускорения «старения» буфера Тролокса18.
  2. Рецепт буфера визуализации: смешайте буфер Trolox + моющее средство (~ в 2 раза превышающее значение CMC моющего средства) + 4 мМ протокатеховой кислоты (PCA).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация моющего средства держится вблизи КМЦ, так как высокие концентрации моющих средств могут привести к увеличению денатурации белка. Например, в следующей смеси можно использовать 955 мкл Тролокса + 5 мкл 10% ДДМ + холестерин (W%, 10:1) + 40 мкл 100 мМ раствора ПЦА. Здесь PCA действует как антиоксидантный агент и ранее использовался в исследованиях smFRET19. DDM является неионным, обычно используется для солюбилизации мембранных белков20,21 и используется в одномолекулярных исследованиях. DDM является хорошим моющим средством первого выбора; Тем не менее, мы рекомендуем протестировать несколько моющих средств и убедиться, что результаты одинаковы.

5. Настройка микроскопа и сбор данных smFRET

  1. Включите компьютер и микроскоп. Включите лазеры для разогрева (532 нм для возбуждения Cy3 и 640 нм для возбуждения Cy5).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь использовался перевернутый микроскоп, оснащенный объективом 100x TIRF (N.A. 1.49), разделителем изображения и камерой EMCCD. Установка оснащена четырехлинейным лазерным комбайнером, дихроичным зеркалом, фильтром излучения длинных проходов, эмиссионным дихроичным фильтром и фильтром с насечкой.
  2. Включите камеру EMCCD и откройте программное обеспечение камеры. Подождите 20 минут, пока камера достигнет −69 °C и стабилизируется.
  3. Установите камеру для образцов на ступень микроскопа. Добавляйте образец белка постепенно, чтобы достичь ~400 молекул на поле зрения (шаг 2.4.5). Промывайте камеру 100 мкл буфера визуализации.
  4. Отрегулируйте коэффициент усиления, скорость захвата и мощность лазера таким образом, чтобы одномолекулярные флуоресцентные сигналы обнаруживались как в донорском, так и в акцепторном каналах. При необходимости отрегулируйте концентрацию белков внутри пробной камеры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: С более чем 400 молекулами в поле зрения различать отдельные молекулы становится сложнее, а фоновый шум будет выше.
  5. Возбуждают донора и приобретают временные следы до тех пор, пока не будет фотоотбелено по меньшей мере 80% молекул донора в поле зрения.
  6. В конце фильма включите лазер 640 нм, чтобы непосредственно возбуждать акцептор до тех пор, пока некоторые из молекул акцептора не отбелеют, облегчая одну молекулу от мультимерной дискриминации.
  7. Перейдите в другое поле зрения и повторите описанные выше шаги, чтобы собрать не менее трех фильмов (технических реплик) для каждого условия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте минимально возможную мощность лазера при выборе новой интересующей области (ROI) и фокусировке, чтобы свести к минимуму фотоотбеливание. Обратите внимание на дрейф стадии во время приобретения. Если после перехода на новый ROI наблюдается заметный дрейф, подождите 3 минуты перед началом приобретения.

6. Анализ данных

  1. Выравнивание каналов донора и акцептора (сопоставление фильмов)
    1. Записывайте флуоресцентные изображения шариков в донорском и акцепторном каналах.
    2. Сгенерируйте файл сопоставления, используя данные шарика, чтобы соотнести донорскую и акцепторную флуоресценцию от каждой молекулы22,23.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эмиссионный сигнал от одной молекулы разбивается на донорский и акцепторный сигналы эмиссионным дихроичным фильтром внутри сплиттера изображения. Изображения донора и акцептора проецируются на камеру бок о бок. Чтобы точно связать интенсивность донора и акцептора одной молекулы между двумя областями, файл картирования часто генерируется с использованием флуоресцентных образцов шариков. Используя этот файл сопоставления, все молекулы, которые обнаруживаются в донорском и акцепторном каналах, сопоставляются друг на друга. Затем анализ генерирует временные следы, которые являются интенсивностью донора и акцептора с течением времени, для каждой молекулы.
  2. Подбор одномолекулярных следов FRET (подбор частиц)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отдельные следы частиц исследуются и отбираются для последующего анализа с использованием MATLAB. Точные критерии отбора зависят от системы. Общие рекомендации о том, что представляет собой частица качества, изложены здесь. Все пользовательские коды доступны на GitHub (https://github.com/vafabakhsh-lab).
    1. Выберите следы, где общая интенсивность следов (донор + акцептор) стабильна с течением времени. Выберите следы с антикоррелированными изменениями донорской и акцепторной интенсивности.
    2. Выберите донорские и акцепторные молекулы, которые показывают одноступенчатое фотоотбеливание. Выберите трассировки длиной >5 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фон в каждом канале после отбеливания должен быть равен нулю. Следы не должны иметь много мигающих событий; это повысит сложность анализа.
    3. Рассчитайте эффективность FRET с помощью уравнения E = (IA− 0,088 × ID)/(ID + [IA− 0,088 × ID])24,25,26, где I D и IA — необработанные донорские и акцепторные интенсивности соответственно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Утечка донорского излучения в акцепторный канал определяется с использованием только донорского меченого образца, возбужденного с помощью лазера26 532 нм. Поправочный коэффициент утечки, 0,088, может отличаться для разных настроек в зависимости от используемых наборов фильтров. Важно отметить, что количественное и надежное преобразование эффективности FRET в абсолютные расстояния требует коррекции интенсивности донора и акцептора для нескольких факторов и широко обсуждалось до27.
  3. Идентификация конформационного состояния с помощью скрытого марковского моделирования (HMM)
    1. Запустите программу vbFRET28 в MATLAB и импортируйте выбранные трассировки для заданного условия. Задайте ограничения для числа потенциальных состояний и итераций, которые необходимо выполнить.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На основе исходных данных репрезентативных результатов была выдвинута гипотеза о том, что конформационным датчиком занято до четырех дискретных состояний FRET; таким образом, был обозначен диапазон от одного до четырех государств. Ранее было установлено, что улучшения в подгонке незначительно увеличатся с итерациями >25; таким образом, для подгонки репрезентативных данных было использовано 25 итераций.
    2. Анализ трассировок smFRET и экспорт идеализированных трассировок и сеанса анализа. Сохраните идеализированные трассировки в отдельную папку для последующего анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Программы, используемые для извлечения данных о переходе состояний и времени ожидания из идеализированных следов, были доступны в ранее опубликованной работе29.
    3. Используя программы MATLAB, извлекайте переходы состояний и стройте их в виде тепловой карты с координатой X, указывающей начальную конформацию, и координатой Y, указывающей на конечную конформацию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Переходы определяются как изменения значения FRET >0,1 в репрезентативных результатах, обсуждаемых здесь. Порог переходов зависит от гипотетических конформационных состояний, занимаемых интересующим белком (установленный порог перехода меньше разницы между ближайшими состояниями FRET), а также разрешения, допускаемого экспериментальной установкой. Исследование тепловых карт для нескольких условий позволяет идентифицировать наиболее распространенные конформационные состояния, через которые датчик переходит и, таким образом, занимает. Для репрезентативных результатов были определены четыре состояния FRET (FRET = 0,31, 0,51, 0,71 и 0,89).
    4. Используя программы MATLAB, извлеките время ожидания для каждого идентифицированного конформационного состояния. Обозначьте диапазон значений FRET, определяющих каждое состояние и время разрешения во время сбора данных. Диапазоны FRET равномерно делятся на соседние состояния FRET. Экспортируйте время пребывания для данных условий лечения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В большинстве случаев данные о времени ожидания могут быть хорошо оценены одной экспоненциальной функцией распада. Этот анализ может быть выполнен в программном обеспечении для анализа данных и графиков.
  4. Гауссовская подгонка гистограмм популяции smFRET для количественной оценки занятости состояния
    1. Импортируйте гистограммы FRET популяции для условий, представляющих интерес, в программное обеспечение для анализа данных и построения графиков для анализа нескольких пиковых фитингов.
    2. Укажите количество присутствующих пиков (четыре пика или состояния на основе анализа HMM). Подгонка была выполнена с использованием нескольких гауссовских распределений30 , определяемых как figure-protocol-1, где A — площадь пика, xc — пиковый центр, а w — ширина пика для каждого пика.
    3. Ограничьте параметры подгонки как A > 0, xc = FRET ± 0,02 и 0,1 ≤w≤ 0,24. Четыре пика FRET для индивидуальных популяционных гистограмм FRET были установлены одновременно. Применяйте определенные ограничения для фитингов всех условий.
    4. Вычислите состояние заполняемости (в процентах) как область пика интереса, деленную на общую площадь, определенную как сумма всех пиков.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Экспрессия и флуоресцентная маркировка датчика FRET на основе UAA
В настоящем документе обсуждаются примерные результаты введения и флуоресцентной маркировки УАА (АЗП) в crD mGluR2 (548UAA). Как упоминалось ранее, для вставки AZP в mGluR2 необходима коэкспрессия инженерного трансляционного механизма, который включает модифицированную тРНК-синтетазу и комплементарную тРНК (pIRE4-Azi), и mGluR2, содержащий янтарный кодон в положении 548, созданный с использованием мутагенеза (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GPCR - это белки, которые действуют на клеточную мембрану, чтобы инициировать трансдукцию сигнала. Многие GPCR состоят из нескольких доменов, причем сигнализация зависит от совместного взаимодействия между доменами. Чтобы модулировать свойства этих мембранных рецепторов, важно понять динамическое поведение нескольких доменов. Одномолекулярный флуоресцентный резонансный перенос энергии (smFRET) - это метод флуоресценции, который позволяет измерять конформацию и динамику белка в режиме реального времени11...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим членов лаборатории Резы Вафабахша за обсуждения. Эта работа была поддержана грантом Национального института здравоохранения R01GM140272 (для R.V.), Фондом лидерства Searle для наук о жизни в Северо-Западном университете и Чикагским биомедицинским консорциумом при поддержке фондов Searle в The Chicago Community Trust (для R.V.). B.W.L. был поддержан грантом Национального института общих медицинских наук (NIGMS) T32GM-008061.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
(+)-L-аскорбат натрияSigma AldrichCat # 11140-250G
4-азидо-L-фенилаланинChem-Impex InternationalCat # 06162
548UAALiauw et al. 2021Трансфицированная конструкция
Уксусная кислотаFisher Chemical64-19-7
АцетонFisher Chemical67-64-1
Adobe Illustrator (2022)https://www.adobe.com/RRID:SCR_010279Программное обеспечение, алгоритм
Аминогуанидин (гидрохлорид)Cayman Chemical81530
АминосиланОлдрич919-30-2
Соникатор для ванны 2,8 лУльтразвуковая ванна Fisher Scientific2,8 л
Biotin-PEGLaysan Bio IncItem# Biotin-PEG-SVA-5000-100mg
BTTESClick Chemistry Tools1237-500
Сульфат меди (II)Sigma AldrichCat # 451657-10G
Cover SlipVWR16004-306Камера для образцов
Cy3 AlkyneClick Chemistry ToolsTA117-5
Cy5 AlkyneClick Chemistry ToolsTA116-5
DDMAnatracePart# D310 1 GMМоющее средство
DDM-CHS (10:1)AnatracePart# D310-CH210 1 млМоющее средство с холецтеролом
Определенная фетальная бычья сывороткаThermo Fisher ScientificSH30070.03
Di01-R405/488/561/635SemrockNotch filter
DMEMCorning10-013-CV
EMCCDФотоаппарат AndorDU-897U
ET542lpChromaДлинночастотный эмиссионный фильтр
FF640-FDi01SemrockЭмиссионный дихроичный фильтр
FLAG-tag антителоGenscriptA01429
Флуоресцентный шарикInvitrogen T7279Микросферы TetraSpeckСферические шарики
Стеклянные слайдыFisherfinest12-544-4образец камеры
ГлутаматSigma AldrichCat # 6106-04-3
HEK 293TSigma AldrichCat # 12022001Клеточная линия
HEPESFisherBioReagents7365-45-9
Разветвитель изображенияOptoSplit II
KOHFluka1310-58-3
ЛазерOxxius4-х линейный лазерный сумматор
Lipofectamine 3000 Реагент для трансфекцииThermo Fisher ScientificL3000015Реактив для трансфекции
МетанолFisher Chemical67-56-1
МикроскопOlympus Olympus IX83
Milli-Q водаБарнстедДеионизатор воды
m-PEGLaysan Bio IncТовар# MPEG-SIL-5000-1g
NF03-405/488/532/635Дихроичное зеркалоSemrock
OptiMEMThermo Fisher Scientific51985091Среда для пониженной сыворотки
OptiMEM/Восстановленная средаThermo Fisher Scientific
OriginPro (2020b)https://www.originlab.com/RRID:SCR_014212Программное обеспечение для анализа данных и построения графиков
Пенициллин-стрептомицинGibco15140-122
pIRE4-AziAddgenePlasmid # 105829Трансфицированная конструкция
Poly-L-лизина гидробромидSigma AldrichCat # P2636
Протокатеховая кислота (PCA)HWI группа99-50-3
smCamera (Version 1.0)http://ha.med.jhmi.edu/resources/Camera программное обеспечение
Гидрокарбонат натрияFisherBioРеагенты144-55-8
Гидроксид натрия (NaOH)Sigma1310-73-2
Шприцевой фильтрWhatman UNIFLOCat#9914-2502Фильтрация жидкости
Trolox Sigma53188-07
для сыворотки

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smock, R. G., Gierasch, L. M. Sending signals dynamically. Science. 324 (5924), 198-203 (2009).
  2. Changeux, J. P., Christopoulos, A. Allosteric modulation as a unifying mechanism for receptor function and regulation. Cell. 166 (5), 1084-1102 (2016).
  3. Tang, X. -l, Wang, Y., Li, D. -l, Luo, J., Liu, M. -Y. Orphan G protein-coupled receptors (GPCRs): biological functions and potential drug targets. Acta Pharmacologica Sinica. 33 (3), 363-371 (2012).
  4. Chung, K. Y., et al. Conformational changes in the G protein Gs induced by the β2 adrenergic receptor. Nature. 477 (7366), 611-615 (2011).
  5. Vafabakhsh, R., Levitz, J., Isacoff, E. Y. Conformational dynamics of a class C G-protein-coupled receptor. Nature. 524 (7566), 497-501 (2015).
  6. Niswender, C. M., Conn, P. J. Metabotropic glutamate receptors: Physiology, pharmacology, and disease. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 50, 295-322 (2010).
  7. Pin, J. P., Bettler, B. Organization and functions of mGlu and GABA(B) receptor complexes. Nature. 540 (7631), 60-68 (2016).
  8. Kniazeff, J., et al. Closed state of both binding domains of homodimeric mGlu receptors is required for full activity. Nature Structural & Molecular Biology. 11 (8), 706-713 (2004).
  9. Ha, T. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer. Methods. 25 (1), 78-86 (2001).
  10. Schuler, B., Eaton, W. A. Protein folding studied by single-molecule FRET. Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).
  11. Liauw, B. W. -H., Afsari, H. S., Vafabakhsh, R. Conformational rearrangement during activation of a metabotropic glutamate receptor. Nature Chemical Biology. 17 (3), 291-297 (2021).
  12. Noren, C. J., Anthonycahill, S. J., Griffith, M. C., Schultz, P. G. A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins. Science. 244 (4901), 182-188 (1989).
  13. Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. Copper-catalyzed azide-alkyne click chemistry for bioconjugation. Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 153-162 (2011).
  14. Huber, T., Naganathan, S., Tian, H., Ye, S. X., Sakmar, T. P. Unnatural amino acid mutagenesis of GPCRs using amber codon suppression and bioorthogonal labeling. G Protein Coupled Receptors: Structure. 520, 281-305 (2013).
  15. Serfling, R., Coin, I. Chapter Four - Incorporation of Unnatural Amino Acids into Proteins Expressed in Mammalian Cells. Methods in Enzymology. Pecoraro, V. 580, Academic Press. Cambridge, MA. 89-107 (2016).
  16. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549(2014).
  17. Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
  18. Cordes, T., Vogelsang, J., Tinnefeld, P. On the mechanism of Trolox as antiblinking and antibleaching reagent. Journal of the American Chemical Society. 131 (14), 5018-5019 (2009).
  19. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  20. Lee, S., et al. How do short chain nonionic detergents destabilize G-protein-coupled receptors. Journal of the American Chemical Society. 138 (47), 15425-15433 (2016).
  21. Cao, A. -M., et al. Allosteric modulators enhance agonist efficacy by increasing the residence time of a GPCR in the active state. Nature Communications. 12 (1), 1-13 (2021).
  22. Mancebo, A., Mehra, D., Banerjee, C., Kim, D. -H., Puchner, E. M. Efficient cross-correlation filtering of one-and two-color single molecule localization microscopy data. Frontiers in Bioinformatics. 1, 739769(2021).
  23. Mehra, D., Adhikari, S., Banerjee, C., Puchner, E. M. Characterizing locus specific chromatin structure and dynamics with correlative conventional and super-resolution imaging in living cells. Nucleic Acids Research. , (2022).
  24. Chen, H., Puhl, H. L., Koushik, S. V., Vogel, S. S., Ikeda, S. R. Measurement of FRET efficiency and ratio of donor to acceptor concentration in living cells. Biophysical Journal. 91 (5), 39-41 (2006).
  25. Gopich, I. V., Szabo, A. FRET efficiency distributions of multistate single molecules. The Journal of Physical Chemistry B. 114 (46), 15221-15226 (2010).
  26. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
  27. Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-A multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).
  28. Bronson, J. E., Fei, J., Hofman, J. M., Gonzalez, R. L., Wiggins, C. H. Learning rates and states from biophysical time series: A Bayesian approach to model selection and single-molecule FRET data. Biophysical Journal. 97 (12), 3196-3205 (2009).
  29. Zhang, J., et al. Specific structural elements of the T-box riboswitch drive the two-step binding of the tRNA ligand. Elife. 7, 39518(2018).
  30. Goodman, N. R. Statistical analysis based on a certain multivariate complex Gaussian distribution (an introduction). The Annals of Mathematical Statistics. 34 (1), 152-177 (1963).
  31. Brown, R. B., Audet, J. Current techniques for single-cell lysis. Journal of the Royal Society Interface. 5, Suppl 2 131-138 (2008).
  32. Schamber, M. R., Vafabakhsh, R. Mechanism of sensitivity modulation in the calcium-sensing receptor via electrostatic tuning. Nature Communications. 13 (1), 2194(2022).
  33. Jain, A., Liu, R., Xiang, Y. K., Ha, T. Single-molecule pull-down for studying protein interactions. Nature Protocols. 7 (3), 445-452 (2012).
  34. Huang, S. K., et al. Delineating the conformational landscape of the adenosine A(2A) receptor during G protein coupling. Cell. 184 (7), 1884-1894 (2021).
  35. Wingler, L. M., et al. Angiotensin analogs with divergent bias stabilize distinct receptor conformations. Cell. 176 (3), 468-478 (2019).
  36. Gordon, C. G., et al. Reactivity of biarylazacyclooctynones in copper-free click chemistry. Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9199-9208 (2012).
  37. Kim, E., Koo, H. Biomedical applications of copper-free click chemistry: In vitro, in vivo, and ex vivo. Chemical Science. 10 (34), 7835-7851 (2019).
  38. Pickens, C. J., Johnson, S. N., Pressnall, M. M., Leon, M. A., Berkland, C. J. Practical considerations, challenges, and limitations of bioconjugation via azide-alkyne cycloaddition. Bioconjugate Chemistry. 29 (3), 686-701 (2018).
  39. Geng, Y., et al. Structural mechanism of ligand activation in human calcium-sensing receptor. Elife. 5, 13662(2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Molecule FRETMembrane ReceptorsConformational DynamicsProtein LabelingMetabotropic Glutamate ReceptorsGPCR ActivationHidden Markov ModelingFluorescent SensorsHEK 293T CellsSite Specific Labeling

Related Articles