Method Article

Визуализация конформационной динамики мембранных рецепторов с помощью одномолекулярного FRET

DOI:

10.3791/64254

⸱

August 17th, 2022

 ,  , 
1Department of Molecular Biosciences, Northwestern University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании представлена подробная процедура проведения экспериментов по переносу энергии одномолекулярного флуоресцентного резонанса (smFRET) на рецепторах, связанных с G-белком (GPCR), с использованием сайт-специфической маркировки через включение неестественных аминокислот (UAA). Протокол содержит пошаговое руководство по подготовке образцов smFRET, экспериментам и анализу данных.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Способность клеток реагировать на внешние сигналы имеет важное значение для клеточного развития, роста и выживания. Чтобы реагировать на сигнал из окружающей среды, клетка должна уметь распознавать и обрабатывать его. Эта задача в основном опирается на функцию мембранных рецепторов, роль которых заключается в преобразовании сигналов в биохимический язык клетки. Рецепторы, связанные с G-белком (GPCR), составляют крупнейшее семейство мембранных рецепторных белков у людей. Среди GPCR метаботропные глутаматные рецепторы (mGluRs) являются уникальным подклассом, которые функционируют как облигатные димеры и обладают большим внеклеточным доменом, содержащим лиганд-связывающий сайт. Последние достижения в структурных исследованиях mGluRs улучшили понимание процесса их активации. Однако распространение крупномасштабных конформационных изменений через mGluRs во время активации и модуляции плохо изучено. Одномолекулярный флуоресцентный резонансный перенос энергии (smFRET) является мощным методом визуализации и количественной оценки структурной динамики биомолекул на уровне одного белка. Для визуализации динамического процесса активации mGluR2 были разработаны флуоресцентные конформационные датчики на основе включения неестественных аминокислот (UAA), которые позволили маркировать сайт-специфический белок без возмущения нативной структуры рецепторов. Протокол, описанный здесь, объясняет, как выполнять эти эксперименты, включая новый подход к маркировке UAA, подготовку образцов и сбор и анализ данных smFRET. Эти стратегии являются обобщаемыми и могут быть расширены для исследования конформационной динамики различных мембранных белков.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Передача информации через плазматическую мембрану сильно зависит от функции мембранных рецепторов1. Связывание лиганда с рецептором приводит к конформационному изменению и активации рецептора. Этот процесс часто носит аллостерический характер2. С более чем 800 членами, рецепторы, связанные с G-белком (GPCR), являются крупнейшим семейством мембранных рецепторов у людей3. Благодаря своей роли почти во всех клеточных процессах, GPCR стали важными мишенями для терапевтического развития. В канонической модели передачи сигналов GPCR активация агониста приводит к конформационным изменениям рецептора, кот....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Общий рабочий процесс протокола описан на рисунке 1.

1. Подготовка пробоотборной камеры

  1. Очистка слайдов и крышек
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги направлены на очистку поверхностей слайдов, а также обшивки и подготовку их к аминосиланизации. Одним из важнейших требований для проведения одномолекулярных флуоресцентных экспериментов на поверхностно-привязанных молекулах является пассивированная поверхность. Наиболее надежный и воспроизводимый метод пассивации предполагает ковалентное прикрепление инертных полимерных цепей к поверхности стекла в виде плотного слоя. Полиэтиленгликоль (ПЭГ) является наиболее эф....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Экспрессия и флуоресцентная маркировка датчика FRET на основе UAA
В настоящем документе обсуждаются примерные результаты введения и флуоресцентной маркировки УАА (АЗП) в crD mGluR2 (548UAA). Как упоминалось ранее, для вставки AZP в mGluR2 необходима коэкспрессия инженерного трансляционного механизма, который включает модифицированную тРНК-синтетазу и комплементарную тРНК (pIRE4-Azi), и mGluR2, содержащий янтарный кодон в положении 548, созданный с использованием мутагенеза (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GPCR - это белки, которые действуют на клеточную мембрану, чтобы инициировать трансдукцию сигнала. Многие GPCR состоят из нескольких доменов, причем сигнализация зависит от совместного взаимодействия между доменами. Чтобы модулировать свойства этих мембранных рецепторов, важно понять динамическое поведение нескольких доменов. Одномолекулярный флуоресцентный резонансный перенос энергии (smFRET) - это метод флуоресценции, который позволяет измерять конформацию и динамику белка в режиме реального времени11.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим членов лаборатории Резы Вафабахша за обсуждения. Эта работа была поддержана грантом Национального института здравоохранения R01GM140272 (для R.V.), Фондом лидерства Searle для наук о жизни в Северо-Западном университете и Чикагским биомедицинским консорциумом при поддержке фондов Searle в The Chicago Community Trust (для R.V.). B.W.L. был поддержан грантом Национального института общих медицинских наук (NIGMS) T32GM-008061.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
(+)-L-аскорбат натрияSigma AldrichCat # 11140-250G
4-азидо-L-фенилаланинChem-Impex InternationalCat # 06162
548UAALiauw et al. 2021Трансфицированная конструкция
Уксусная кислотаFisher Chemical64-19-7
АцетонFisher Chemical67-64-1
Adobe Illustrator (2022)https://www.adobe.com/RRID:SCR_010279Программное обеспечение, алгоритм
Аминогуанидин (гидрохлорид)Cayman Chemical81530
АминосиланОлдрич919-30-2
Соникатор для ванны 2,8 лУльтразвуковая ванна Fisher Scientific2,8 л
Biotin-PEGLaysan Bio IncItem# Biotin-PEG-SVA-5000-100mg
BTTESClick Chemistry Tools1237-500
Сульфат меди (II)Sigma AldrichCat # 451657-10G
Cover SlipVWR16004-306Камера для образцов
Cy3 AlkyneClick Chemistry ToolsTA117-5
Cy5 AlkyneClick Chemistry ToolsTA116-5
DDMAnatracePart# D310 1 GMМоющее средство
DDM-CHS (10:1)AnatracePart# D310-CH210 1 млМоющее средство с холецтеролом
Определенная фетальная бычья сывороткаThermo Fisher ScientificSH30070.03
Di01-R405/488/561/635SemrockNotch filter
DMEMCorning10-013-CV
EMCCDФотоаппарат AndorDU-897U
ET542lpChromaДлинночастотный эмиссионный фильтр
FF640-FDi01SemrockЭмиссионный дихроичный фильтр
FLAG-tag антителоGenscriptA01429
Флуоресцентный шарикInvitrogen T7279Микросферы TetraSpeckСферические шарики
Стеклянные слайдыFisherfinest12-544-4образец камеры
ГлутаматSigma AldrichCat # 6106-04-3
HEK 293TSigma AldrichCat # 12022001Клеточная линия
HEPESFisherBioReagents7365-45-9
Разветвитель изображенияOptoSplit II
KOHFluka1310-58-3
ЛазерOxxius4-х линейный лазерный сумматор
Lipofectamine 3000 Реагент для трансфекцииThermo Fisher ScientificL3000015Реактив для трансфекции
МетанолFisher Chemical67-56-1
МикроскопOlympus Olympus IX83
Milli-Q водаБарнстедДеионизатор воды
m-PEGLaysan Bio IncТовар# MPEG-SIL-5000-1g
NF03-405/488/532/635Дихроичное зеркалоSemrock
OptiMEMThermo Fisher Scientific51985091Среда для пониженной сыворотки
OptiMEM/Восстановленная средаThermo Fisher Scientific
OriginPro (2020b)https://www.originlab.com/RRID:SCR_014212Программное обеспечение для анализа данных и построения графиков
Пенициллин-стрептомицинGibco15140-122
pIRE4-AziAddgenePlasmid # 105829Трансфицированная конструкция
Poly-L-лизина гидробромидSigma AldrichCat # P2636
Протокатеховая кислота (PCA)HWI группа99-50-3
smCamera (Version 1.0)http://ha.med.jhmi.edu/resources/Camera программное обеспечение
Гидрокарбонат натрияFisherBioРеагенты144-55-8
Гидроксид натрия (NaOH)Sigma1310-73-2
Шприцевой фильтрWhatman UNIFLOCat#9914-2502Фильтрация жидкости
Trolox Sigma53188-07
для сыворотки

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smock, R. G., Gierasch, L. M. Sending signals dynamically. Science. 324 (5924), 198-203 (2009).
  2. Changeux, J. P., Christopoulos, A. Allosteric modulation as a unifying mechanism for receptor function and regulation. Cell. 166 (5), 1084-1102 (2016).
  3. Tang, X. -l, Wang, Y., Li, D. -l, ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Molecule FRETMembrane ReceptorsConformational DynamicsProtein LabelingMetabotropic Glutamate ReceptorsGPCR ActivationHidden Markov ModelingFluorescent SensorsHEK 293T CellsSite Specific Labeling

Related Articles