Method Article

Разработка и тестирование метилированных наноструктурированных дипептидов, которые ингибируют активность src-киназы in vitro для противораковых применений

DOI:

10.3791/64256

⸱

November 30th, 2022

 ,  , 
1Biochemistry Department, College of Science, King Abdulaziz University, 2Independent Scholar, 3School of Health Sciences and Biomedical Engineering, Hebei University of Technology, 4School of Engineering, Saveetha University, 5Programa de Pós-graduação em Ciência e Engenharia dos Materiais, UFPI

In This Article

Retraction Notice

The article Developing and Testing Methylated Nano-Structured Dipeptides that Inhibit Src Kinase Activity In Vitro for Anti-Cancer Applications has been retracted by the journal due to authorship and reproducibility concerns.

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь представлен протокол разработки и тестирования дипептидов, которые могут ингибировать активность фермента Src-киназы с использованием бесклеточных и клеточных анализов для противораковых приложений. Полученные здесь пептиды (W-RCH3, WCH3-R CH3 и W-R(CH3)2) ингибировали Src-киназу со значениями IC50 510 нМ, 916 нМ и 1 мкМ соответственно.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь, с целью разработки нового противоопухолевого метода, были разработаны семь дипептидов, которые содержали метилированный триптофан и/или метилированный аргинин и были получены с использованием синтеза твердофазного пептида Fmoc. Сверхэкспрессия фермента тирозинкиназы Src была вовлечена в развитие различных видов рака. Ранее было показано, что дипептиды, содержащие неестественные аминокислоты, такие как метилированный аргинин (RCH3), диметилированный аргинин (R(CH3)2) и/или метилированный триптофан (WCH3), ингибируют Src-киназу. В этом исследовании три таких дипептида, W-RCH3, WCH3-R CH3 и W-R(CH3)2, были протестированы с использованием бесклеточных анализов, и было обнаружено, что они имеют значения IC50 (концентрация, при которой происходит 50% ингибирование) 510 нМ, 916 нМ и 1 мкМ соответственно. Эти значения были сопоставимы с полученными для циклических пента- и нано-W-R пептидов ([W-R]5-[W-R]9), синтезированных в предыдущих исследованиях. Тем не менее, неметилированные версии дипептидов не проявляли какой-либо ингибирующей активности в отношении Src-киназы. Все эти дипептиды (50 мкМ) не проявляли цитотоксичности после инкубации до 72 ч с тремя различными линиями раковых клеток, включая клеточные линии лейкемии (CCRF-CEM), аденокарциномы молочной железы (MDA-MB-231) и аденокарциномы яичников (SK-OV-3), что указывает на ограниченную проницаемость пептидов через клеточную мембрану. Таким образом, необходимы дальнейшие исследования для улучшения проницаемости этих пептидов для противоопухолевых применений, таких как использование пептидного носителя или дополнительной функционализации пептида. Таким образом, в этом исследовании представлен протокол синтеза и тестирования пептидов, которые ингибируют активность Src-киназы и, таким образом, обладают многообещающими противораковыми способностями, как это было продемонстрировано с помощью бесклеточных и клеточных анализов.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рак вызывается аномальным ростом нормальных клеток и является одним из самых смертоносных заболеваний во всем мире. Эти аномальные клетки распространяются в различные органы организма с помощью процесса, называемого метастазированием. Наиболее распространенной формой рака является рак молочной железы, который в 2020 году возник у 2,26 млн человек. Кроме того, в 2020 году от рака легких умерло около 1,80 млнчеловек1. По данным Всемирной организации здравоохранения, в 2020 году от рака умерло около 10 млнчеловек2. Раковые клетки отличаются от нормальных тем, что они сверхэкспрессируют определенные ферменты, такие как протеинтирозинкиназы (ПТК). Национальный институт рака определяет киназы как ферменты, способные фосфорилировать другие белки или сахара3. Знание регуляторной функции киназ может облегчить разработку эффективных противоопухолевых препаратов. Например, ПТК катализируют фосфорилирование других белков или сахаров, и, как следствие, АТФ превращается в АДФ за счет потери фосфатной группы. В общей сложности 80% онкогенов и протоонкогенов кодируют ПТК4. Src-киназы — семейство нерецепторных тирозинкиназ, включая Lck, Fyn, Hck, Blk, Yes и Yrk, которые сверхэкспрессируются в раковых клетках, особенно при раке молочной железы 5,6. Тирозинкиназы Src связаны с митогенезом, дифференцировкой, активацией Т-клеток и трансформацией клеток. Src помогает инвазии и метастазированию раковых клеток благодаря своей способности снижать адгезию раковых клеток. В Src-киназе существует пять различных доменов, упорядоченных от N- к С-концевым следующим образом: домен жирных кислот, домен гомологии Src 3 (SH3), домен гомологии Src 2 (SH2), домен тирозинкиназы (SH1) и С-концевой регуляторный домен7.

figure-introduction-1
Рисунок 1: Целевые домены в ферменте киназе Src, включая домен SH3, домен SH2, киназный домен (SH1) и короткий С-концевой регуляторный сегмент. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Киназный домен SH1 чаще всего является мишенью при разработке ингибиторов Src-киназы, поскольку он содержит два консервативных сайта для связывания АТФ и субстрата (рис. 1). Если аминокислотная последовательность киназного домена известна, субстрат также может быть использован в качестве мишени для создания соединения, которое имитирует связывание субстрата с Src-киназой8. Кроме того, в качестве целей могут использоваться и другие сайты, такие как домены SH3 и SH2. По сравнению с другими химиотерапевтическими препаратами, ингибиторы киназы демонстрируют меньшую токсичность и более высокую эффективность9. По состоянию на сентябрь 2021 года существует 73 малых молекулы, которые действуют как ингибиторы киназы, одобренные FDA10. Иматиниб является примером противоопухолевого препарата, который избирательно ингибирует активность тирозинкиназы; Однако некоторые пациенты устойчивы к препарату из-за появления точечной мутации в киназном домене11. Компания AstraZeneca выпустила саракатиниб, который является препаратом, ингибирующим семейство тирозинкиназ семейства Src со значением IC50 (концентрация, при которой происходит 50% ингибирование) 2,7 нМ, но он был проигнорирован в испытаниях фазы2 12. Из 52 ингибиторов ПТК, одобренных FDA США по состоянию на начало 2020 года,только 28 рецепторов ПТК-мишеней, 11 блокируют нерецепторный ПТК, 11 ингибируют протеинкиназы белок-серин/треонин и два блокируют МЭК1/213. Растущий исследовательский интерес к онкологии будет продолжать подпитывать открытие ингибиторов киназы в качестве потенциальных противораковых препаратов. Тем не менее, только 50 из 500 протеинкиназ были нацелены на лечение до сих пор; Таким образом, ожидается, что в ближайшем будущем будет изучено большее число киназ для разработки лекарств14. Кроме того, существует необходимость в открытии ингибиторов киназы для изучения пока еще не идентифицированных мутаций киназ, которые приводят к раку.

Таким образом, данное исследование было направлено на разработку пептидов, которые могли бы быть использованы в качестве ингибиторов для семейства Src и нацелены на сайт связывания АТФ благодаря его способности служить консервативным сайтом между различными киназами. С этой целью был синтезирован ряд дипептидов, содержащих метилированный триптофан и/или метилированный аргинин, и протестирован на их синергетическую способность ингибировать Src-киназу. Индольное кольцо триптофана имитирует аденин АТФ и конкурирует с АТФ на пути к связыванию с АТФ-связывающим сайтом. Кроме того, метилированный аргинин в лиганде конкурирует за домен SH3 Src. Исследователи показали, что полипептид, содержащий деметилированный аргинин, ингибирует домен SH3, возможно, благодаря специфической консервативной последовательности на мотиве связывания SH3 (т.е. PXXP), который имеет сродство к связыванию с лигандом, содержащим два-три остатка Arg в N-конце или один-два остатка Arg на С-концелигандов. 16,17. Гуанидиновая группа Arg связывается с консервативным остатком Asp-99 домена SH318,19, в то время как оставшаяся часть Arg связывается с консервативным Trp-118 фермента, что подтверждается анализом ЯМР и кристаллическими структурами нескольких доменов SH319. Здесь представлен протокол синтеза семи метилированных дипептидов и проверки их способности ингибировать Src-киназу. Далее была изучена способность этих пептидов убивать несколько линий раковых клеток in vitro.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Синтез пептидов

ПРИМЕЧАНИЕ: Синтез W-R описан в качестве репрезентативного примера (Рисунок 2).

  1. Взвесьте 566 мг (0,3 ммоль) H-Arg(Pbf)-2-хлортририльной смолы и добавьте ее в сосуд для синтеза пептидов (см. Таблицу материалов) в соответствии с процедурой, используемой Mandal et al20. Выполнение синтеза пептидов с использованием хорошо зарекомендовавшей себя стратегии синтеза твердофазных пептидов (SPPS)21.
    Метилированные или диметилированные дипептиды, содержащие неестественные аминокислоты, собирали на катковой амидной смоле (нагрузочная способность 0,3 ммоль/г), в то время как дипептиды, содержащие природные аминокислоты, собирали на смоле, к которой была присоединена первая аминокислота, такая как H-Arg(Pbf)-2-хлортририльная смола (нагрузочная способность 0,3 ммоль/г). Важно отметить, что амидная смола катка производит пептид, покрытый С-концевым NH2.
  2. Сухую смолу набухают в течение 1 ч в 5 мл N,N-диметилформамида (ДМФА) под давлением газообразного азота, соединенного с пептидным сосудом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте весь процесс синтеза в вытяжном шкафу. Очки, перчатки и лабораторный халат необходимо носить на протяжении всего эксперимента. Таймер также необходим для отслеживания этапов добавления химических реагентов.
  3. Удаляйте избыток ДМФА с помощью давления газообразного азота, соединенного с резервуаром для синтеза пептидов на протяжении всего процесса синтеза.
  4. Массовая масса 473,9 мг Fmoc-trp(Boc)-OH (0,9 ммоль) и 341 мг 2-(1H-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония гексафторфосфата (HBTU) (0,9 ммоль) в качестве связывающих реагентов. Добавьте порошки в пробирку и растворите их в 5 мл сухого ДМФА.
  5. Добавьте 313,4 мкл (1,8 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина (DIPEA) в качестве активирующего агента в пробирку (шаг 1.4) и перемешайте, встряхивая пробирку.
  6. Добавьте содержимое пробирки в смолу и дайте протекать реакции в течение 1 ч под газообразным азотом комнатной температуры. Затем слейте излишки ДМФА под давлением газообразного азота и промойте смолу 3 раза с помощью ДМФ.
  7. Снимите защиту с N-концевого Fmoc с помощью 5 мл 20% пиперидина в DMF (v/v) в течение 20 минут под воздействием газообразного азота. Промойте смолу 3 раза с помощью DMF (3 x 5 мл).
  8. Высушите смолу, добавив 5 мл дихлорметана (DCM), и подержите ее под газообразным азотом в течение 5 минут, затем слейте воду с помощью давления газообразного азота. Добавьте 5 мл метанола под газообразный азот на 5 минут, чтобы увеличить сухость смолы.
  9. Добавьте 10 мл свежеприготовленного коктейля из ТЖК/тиоанизола/дитиотреита/анизола (90:3:5:2 v/v/w/v) в течение 2,5 часов, чтобы снять защиту со всех боковых цепей и отделить дипептид от смолы.
    ВНИМАНИЕ: Коктейль для расщепления необходимо добавлять в стеклянный мерный цилиндр, так как ТЖК является кислотным и опасным; Будьте осторожны при его использовании.
  10. Через 2,5 ч слейте реакционный раствор из пептидного сосуда с помощью давления азота в круглую донную колбу. Добавьте 250 мл холодного диэтилового эфира (Et2O) в колбу с круглым дном, содержащую сырой пептид, чтобы осадить пептид.
  11. Отфильтруйте осажденный пептид с помощью фильтровальной бумаги в конической воронке с одним боковым рукавом, который соединен с водой (так, чтобы фильтрация происходила за счет давления воды), и соберите осадок (пептиды), чтобы полностью удалить эфир. Сырой пептид выпадает в осадок в течение 10 минут.
  12. Очистите сырой пептид на колонке высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с обратной фазой (см. Таблицу материалов) с помощью градиентной системы. Используйте градиент 0%-100% ацетонитрила, содержащего 0,1% TFA, в воде, содержащей 0,1% TFA, в течение 30-60 мин при расходе 1 мл/мин.

figure-protocol-1
Рисунок 2: Твердофазный пептидный синтез W-R. Сокращения: HBTU = 2-(1H-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония гексафторфосфат; DIPEA = N,N-диизопропилэтиламин; TFA = трифторуксусная кислота; DMF = диметилформамид. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

2. Определение клеточной токсичности синтезированных пептидов

  1. Планшет 2000 ячеек/лунка ячеек SK-OV-3, 5000 клеток/лунка ячеек MDA-MB-231 или 5 × 106 клеток/лунка ячеек CCRF-CEM (в общем объеме 100 мкл/лунка) в 96-луночный микропланшет. Инкубируйте клетки во влажной атмосфере с содержанием 5%CO2, 95% воздуха при 37 °C до тех пор, пока они не достигнут 75%-80% конфлюенции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Среда RPMI-16 используется для культивирования клеток CCRF-CEM и минимально необходимой среды Eagle (EMEM) для клеточных линий MDA-MB-231 и SK-OV-3. Обе среды дополняют 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 1% пенициллином/стрептомицином (10 000 ЕД/мл пенициллина и 10 мг/мл стрептомицина в 0,9% NaCl). Поместите все среды и добавки на водяную баню при температуре 37 °C на 30 минут перед началом эксперимента. Эксперимент следует проводить в капюшоне биобезопасности, в перчатках и лабораторном халате.
  2. Отсадите среду с помощью пипетки и добавьте 100 мкл пептида 50 мкМ или 10 мкМ доксорубицина (Dox), используемого в качестве положительного контроля in triplicate, в лунки, содержащие три различных типа раковых клеток, покрытых в 96-луночном планшете. Верните планшет в инкубатор на 72 ч (в тех же условиях, что указаны в пункте 2.1).
  3. Через 72 ч добавьте 20 мкл 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфоффенил)-2Н-тетразолия (MTS) в 96-луночный планшет. Оберните тарелку алюминиевой фольгой и выдержите тарелку в течение 1-4 часов при температуре 37 °C во влажной атмосфере.
    ПРИМЕЧАНИЕ: MTS - это краситель, используемый для визуализации живых клеток (необработанных или обработанных пептидами), поскольку только живые клетки превращают MTS тетразолий в окрашенный краситель формазан, который можно измерить при длине волны 490 нм.
  4. Измерьте абсорбцию продукта формазана при длине волны 490 нм (А490) на микропланшетном ридере (см. Таблицу материалов). Включите среду, смешанную с МТС, в качестве заготовки для эксперимента. Используйте только воду (так как пептиды растворимы в воде) и 0,1 Н HCl (так как для растворения WCH3 требуется HCl) в качестве отрицательного контроля.
  5. Измерьте процент выживаемости клеток с помощью следующего уравнения (уравнение 1) с помощью программы для работы с электронными таблицами (см. Таблицу материалов). Процедура аналогична той, которую использовали Mandal et al20.
    figure-protocol-2Эквалайзер (1)

3. Анализ активности c-Src-киназы

ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ активности киназы Src проводили с использованием коммерческого набора для анализа (см. Таблицу материалов) в трех экземплярах, в соответствии с процедурой Chhikara et al.22. Используйте только WCH3 и RCH3 в качестве контроля для сравнения влияния только метилированной аминокислоты на киназу и с другой метилированной или неметилированной аминокислотой.

  1. В 384-луночный микропланшет с черной несвязывающейся поверхностью с круглым дном на 384 лунки добавьте 2,5 мкл реакционного коктейля, содержащего 0,7 нМ домена киназыHis 6-Src в буфере киназы, который входит в набор для анализа, к 2,5 мкл предварительно разведенных пептидов, растворенных в 10% ДМСО (4-кратная целевая концентрация). Инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре с помощью шейкера для микропланшетов (5 об/мин) в соответствии с протоколом производителя.
    Реакционный коктейль состоит из киназного буфера (200 мМ HEPES, pH 7,5), MgCl2 (16 мМ), ДМСО (4%), EGTA (8 мМ), 2-меркаптоэтанола (43 мМ) и Brij-35 (0,04%). Оптимальным субстратом киназной реакции данного эксперимента является (AEEEIYGEFEAKKKK).
  2. Добавьте в тарелку 5 μL коктейля АТФ/субстрат (40 μM/600 μM) и инкубируйте в течение 30 минут в вибростенде для микропланшетов при комнатной температуре.
  3. Тем временем приготовьте 1x смесь для детектирования ADP, содержащую 8 нМ индикатора ADP и 10 мкг/мл конъюгированного с красителем антитела ADP2 (см. Таблицу материалов) до буфера для остановки и детектирования B (1x) из набора. Остановите киназную реакцию (шаг 3.2), добавив 10 мкл смеси для обнаружения АДФ 1x и инкубируйте в течение 1 часа при комнатной температуре.
  4. Измерьте интенсивность флуоресценции с помощью микропланшетного ридера с возбуждением на длине волны 580 нм, излучением на длине волны 630 нм и шириной полосы 10 нм. Получите относительные единицы флуоресценции (RFU) из прибора, чтобы получить процент ингибирования фермента в соответствии с уравнением (2).
    figure-protocol-3Эквалайзер (2)
  5. Рассчитайте значение IC50 , указанное на сайте компании23.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W-RCH3, WCH3-R CH3, W-R(CH3)2, WCH3-R, WCH3-R(CH3)2 и контрольные пептиды W-R синтезировали с использованием синтеза твердофазных пептидов Fmoc (рис. 3) с чистотой 95%, 98,7%, 99%, 100%, 100% и 99,5% соответственно. Химическая структура этих дипептидов была подтверждена с помощью ESI-MS. m/z значения этих дипептидов составили 374,1624, 388,1949, 388,1794, 374,1815, 402,2022 и 361,1457 соответственно.

...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Пептиды, изготовленные и испытанные здесь для ингибирования Src-киназы и последующего уничтожения раковых клеток, содержали метилированный триптофан и/или метилированный аргинин, которые являются неестественными аминокислотами. Образование белого осадка при добавлении диэтилового эфира является критическим этапом в синтезе этих пептидов. Однако не все синтетические пептиды могут образовывать осадок; Таким образом, даже когда осадок не образуется, успешный синтез пептидов может быть подтв...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы поблагодарить деканата по научным исследованиям (DSR) Университета короля Абдулазиза (KAU), Джидда, Саудовская Аравия, который профинансировал этот проект в рамках гранта No. (Г: 031-130-1443).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,4-ДитиотрейтолСигма-Олдрич10708984001Пептидный синтез
Олдрич фриттированная фильтрующая воронка для твердофазного синтезаСигма-ОлдричZ283304Сосуд для синтеза пептидов
Alexa594 TracerBell Brook Labs, Мэдисон, Висконсин3013
АнизолСигма-Олдрич8014520500
CellTiter 96 AКоный One  Решение  Реагенты для анализа пролиферации клеток PromegaG3582Анализ пролиферации клеток (реагент MTS)
Дихлорметан, 99,9%, Экстра СухиеФишерскиAC326850025
Fmoc-ADMA(Pbf)-OHSigma-Aldrich8521070001
Fmoc-Arg(Me,Pbf)-OHSigma-Aldrich8521050001
Fmoc-Arg(Pbf)-OHSigma-Aldrich8520670025
Fmoc-Trp(Boc)- ОСигма-Олдрич47561-25G-F
HPLC C18 колонка Шимадзу  (Система RP-HPLC)вода/ацетонитрильный градиент
IRDye QC-1 гасительBell Brook Labs, Мэдисон, Висконсин3013
Считыватель микропланшетов SpectraMax M2eМолекулярные устройства
Microsoft Microsoftпрограммное обеспечение для работы с электронными таблицами
N,N-диизопропилэтиламин (DIPEA)Sigma-Aldrich496219
N,N-диметилформамид, безводный, 99,8%FishersciAA43997M1
Пиперидин 20%Sigma-Aldrich80645
Rink Amide смола (100-200 меш)Sigma-Aldrich8550010025
ТиоанизолSigma-Aldrich92358
Transcreener ADP2 FI AssayBell Brook Labs, Madison, WI3013набор для анализа активности c-Src киназы

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Cancer. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer#:~:text=Cancer%20a%20leading%20cause,and%20rectum%20and%20prostate%20cancers (2022).
  3. Negi, P., Cheke, R. S., Patil, V. M. Recent advances in pharmacological diversification of Src family kinase inhibitors. Egyptian Journal of Medical Human Genetics. 22 (1), 52(2021).
  4. Huang, X. L., et al. Role of receptor tyrosine kinases mediated signal transduction pathways in tumor growth and angiogenesis-New insight and futuristic vision. International Journal of Biological Macromolecules. 180, 739-752 (2021).
  5. Mohammed, S., et al. Sublethal doxorubicin promotes migration and invasion of breast cancer cells: role of Src Family non-receptor tyrosine kinases. Breast Cancer Research. 23 (1), 76(2021).
  6. Biscardi, J. S., Ishizawar, R. C., Silva, C. M., Parsons, S. J. Tyrosine kinase signalling in breast cancer: epidermal growth factor receptor and c-Src interactions in breast cancer. Breast Cancer Research. 2 (3), 1-8 (2000).
  7. Ortiz, M. A., et al. Src family kinases, adaptor proteins and the actin cytoskeleton in epithelial-to-mesenchymal transition. Cell Communication and Signaling. 19 (1), 67(2021).
  8. Hill, Z. B., Perera, B. G., Andrews, S. S., Maly, D. J. Targeting diverse signaling interaction sites allows the rapid generation of bivalent kinase inhibitors. ACS Chemical Biology. 7 (3), 487-495 (2012).
  9. Wu, S., Fu, L. Tyrosine kinase inhibitors enhanced the efficacy of conventional chemotherapeutic agent in multidrug resistant cancer cells. Molecular Cancer. 17 (1), 25(2018).
  10. Ayala-Aguilera, C. C., et al. Small molecule kinase inhibitor drugs (1995-2021): Medical indication, pharmacology, and synthesis. Journal of Medicinal Chemistry. 65 (2), 1047-1131 (2022).
  11. Lyczek, A., et al. Mutation in Abl kinase with altered drug-binding kinetics indicates a novel mechanism of imatinib resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (46), 2111451118(2021).
  12. Musumeci, F., Schenone, S., Brullo, C., Botta, M. An update on dual Src/Abl inhibitors. Future Medicinal Chemistry. 4 (6), 799-822 (2012).
  13. Roskoski, R. Properties of FDA-approved small molecule protein kinase inhibitors: A 2020 update. Pharmacological Research. 152, 104609(2020).
  14. Cohen, P., Cross, D., Jänne, P. A. Kinase drug discovery 20 years after imatinib: Progress and future directions. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (7), 551-569 (2021).
  15. Feng, S., Chen, J. K., Yu, H., Simon, J. A., Schreiber, S. L. Two binding orientations for peptides to the Src SH3 domain: development of a general model for SH3-ligand interactions. Science. 266 (5188), 1241-1247 (1994).
  16. Alexandropoulos, K., Cheng, G., Baltimore, D. Proline-rich sequences that bind to Src homology 3 domains with individual specificities. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (8), 3110-3114 (1995).
  17. Feng, S., Kasahara, C., Rickles, R. J., Schreiber, S. L. Specific interactions outside the proline-rich core of two classes of Src homology 3 ligands. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (26), 12408-12415 (1995).
  18. Polverini, E., Rangaraj, G., Libich, D. S., Boggs, J. M., Harauz, G. Binding of the proline-rich segment of myelin basic protein to SH3 domains: Spectroscopic, microarray, and modeling studies of ligand conformation and effects of posttranslational modifications. Biochemistry. 47 (1), 267-282 (2008).
  19. Weng, Z., et al. Structure-function analysis of SH3 domains: SH3 binding specificity altered by single amino acid substitutions. Molecular and Cellular Biology. 15 (10), 5627-5634 (1995).
  20. Mandal, D., Nasrolahi Shirazi, A., Parang, K. Cell-penetrating homochiral cyclic peptides as nuclear-targeting molecular transporters. Angewandte Chemie. 50 (41), 9633-9637 (2011).
  21. Hussein, W. M., Skwarczynski, M., Toth, I. Peptide Synthesis: Methods and Protocols. , Humana Press. (2020).
  22. Chhikara, B. S., et al. Phenylpyrazalopyrimidines as tyrosine kinase inhibitors: Synthesis, antiproliferative activity, and molecular simulations. Molecules. 25 (9), 2135(2020).
  23. TRANSCREENER ADP2 Fl Assay. BellBrook Labs. , Available from: https://www.bellbrooklabs.com/wp-content/uploads/2021/03/Tech-Manual-ADP2-Fl-v031621.pdf (2022).
  24. Sanner, M. F., et al. Cyclic peptides as protein kinase inhibitors: Structure-activity relationship and molecular modeling. Journal of Chemical Information and Modeling. 61 (6), 3015-3026 (2021).
  25. Nahhas, A. F., Nahhas, A. F., Webster, T. J. The physical properties of tripeptide stereocomplex nano-formations. Journal of Biomedical Nanotechnology. 16 (10), 1495-1503 (2020).
  26. Nahhas, A. F., Chang, R., Webster, T. J. Introducing unnatural amino acids-containing tripeptides as antimicrobial and anticancer agents. Journal of Biomedical Nanotechnology. 14 (5), 987-993 (2018).
  27. Deng, G., et al. Tryptophan-containing dipeptide derivatives as potent PPARγ antagonists: design, synthesis, biological evaluation, and molecular modeling. European Journal of Medicinal Chemistry. 43 (12), 2699-2716 (2008).
  28. Chetty, V. T., Sharma, A. M. Can PPARγ agonists have a role in the management of obesity-related hypertension. Vascular Pharmacology. 45 (1), 46-53 (2006).
  29. Skeggs, L. T., Kahn, J. R., Shumway, N. P. The preparation and function of the hypertensin-converting enzyme. Journal of Experimental Medicine. 103 (3), 295-299 (1956).
  30. Lunow, D., Kaiser, S., Brückner, S., Gotsch, A., Henle, T. Selective release of ACE-inhibiting tryptophan-containing dipeptides from food proteins by enzymatic hydrolysis. European Food Research and Technology. 237 (1), 27-37 (2013).
  31. Weber, J., Wilke-Mounts, S., Grell, E., Senior, A. E. Tryptophan fluorescence provides a direct probe of nucleotide binding in the noncatalytic sites of Escherichia coli F1-ATPase. The Journal of Biological Chemistry. 269 (15), 11261-11268 (1994).
  32. Iavarone, A. T., Patriksson, A., vander Spoel, D., Parks, J. H. Fluorescence probe of Trp-cage protein conformation in solution and in gas phase. Journal of the American Chemical Society. 129 (21), 6726-6735 (2007).
  33. Nongonierma, A. B., Fitzgerald, R. J. Inhibition of dipeptidyl peptidase IV (DPP-IV) by tryptophan containing dipeptides. Food & Function. 4 (12), 1843-1849 (2013).
  34. Bjelke, J. R., et al. Dipeptidyl peptidases 8 and 9: specificity and molecular characterization compared with dipeptidyl peptidase IV. The Biochemical Journal. 396 (2), 391-399 (2006).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Src Kinase InhibitionMethylated DipeptidesSolid Phase Peptide SynthesisAnti Cancer PeptidesTyrosine Kinase ActivityAcellular AssaysPeptide PermeabilityCancer Cell LinesPeptide FunctionalizationIC50 Measurement