Восстановление подвижности на основе актина с помощью коммерчески доступных белков

Краткое содержание

Этот протокол описывает, как производить актиновые кометы на поверхностях шариков с использованием коммерчески доступных белковых ингредиентов. Такие системы имитируют протрузивные структуры, обнаруженные в клетках, и могут быть использованы для изучения физиологических механизмов производства силы упрощенным способом.

Аннотация

Многие движения и изменения формы клеток, а также определенные типы внутриклеточной бактериальной и органеллной подвижности обусловлены биополимерным актином, который образует динамическую сеть на поверхности клетки, органеллы или бактерии. Биохимическая и механическая основа производства силы во время этого процесса может быть изучена путем воспроизведения движения на основе актина бесклеточным способом на инертных поверхностях, таких как бусины, которые функционализированы и инкубированы с контролируемым набором компонентов. При соответствующих условиях упругая актиновая сеть собирается на поверхности шарика и разрывается из-за напряжения, создаваемого ростом сети, образуя «актиновую комету», которая продвигает шарик вперед. Однако такие эксперименты требуют очистки множества различных актин-связывающих белков, что часто ставит их вне досягаемости неспециалистов. В данной статье подробно описан протокол воспроизводимого получения актиновых комет и подвижность шариков с использованием коммерчески доступных реагентов. Покрытие бусины, размер бусины и смесь подвижности могут быть изменены для наблюдения за влиянием на скорость бусины, траектории и другие параметры. Этот анализ может быть использован для тестирования биохимической активности различных актин-связывающих белков, а также для выполнения количественных физических измерений, которые проливают свет на активные свойства вещества актиновых сетей. Это будет полезным инструментом для сообщества, позволяющим изучать подвижность in vitro на основе актина без экспертных знаний в области очистки актин-связывающего белка.

Введение

Полимеризация актина в клетках пространственно и временно контролируется жесткой регуляцией нуклеации актиновой нити после передачи клеточной сигнализации¹. Нуклеация происходит через образование актинового тримера, а затем оба конца зарождающейся нити полимеризуются спонтанно, хотя один конец более динамичен (колючий конец), чем другой (заостренный конец)². Когда нуклеация и колючая концевая полимеризация направлены к поверхности, они производят достаточную силу (в диапазоне пико-нано Ньютона), чтобы вытолкнуть клеточную мембрану для движения и переместить объекты микронного размера внутри клетки с гидролизом АТФ в качестве источника энергии³. Некоторые примеры включают бактерии Listeria monocytogenes, которые используют кометы актина для распространения от клетки к клетке, и митохондрии, где движение на основе комет актина важно для рандомизированного наследования во время митоза ^4,5. Актиновые кометы на эндосомах и других внутриклеточных везикулах участвуют в отслоении от донорских мембран ^6,7,8.

С помощью способа, представленного здесь, сигнальные аспекты полимеризации клеточного актина обходят, и полимеризацию актина производят на микрометрических полистирольных шариках путем покрытия их активаторами разветвленного актинового зарождения, в частности активным доменом человеческого белка WASP, VCA (также называемым WA или WCA)¹. Затем шарики с покрытием инкубируют в смеси, содержащей ингредиенты, необходимые для полимеризации актина, включая основной нуклеатор полимеризации актина в клетках, комплекс Arp2/3, который активируется VCA на поверхности шарика с образованием новых нитей в виде ответвлений от сторон дочерних нитей¹. Актин первоначально полимеризуется равномерно вокруг шарика, но затем спонтанно нарушает симметрию, создавая актиновую комету, которая выдвигает шарик вперед, тем самым воссоздавая клеточные протрузионные сети и кометы контролируемым образом. Подобные подходы с шариками и другими покрытыми поверхностями использовались в прошлом нами и другими для изучения биохимии и биофизики полимеризации актина 9,10,11,12, но для этих экспериментов потребовался обширный опыт в актин-связывающих белках. Протокол, представленный здесь, описывает, как надежно создавать актиновые кометы и подвижность полностью с коммерчески доступными (или скоро будут доступными) реагентами, делая этот подход доступным для всех, в том числе в образовательной среде для обучения биофизическим концепциям. Ключевые особенности включают важность щадящего и надежного пипетирования, использование мономера с профилином в качестве источника актина и важность использования высокоактивного комплексного активатора Apr2/3 в качестве реагента для покрытия шариков.

Протокол

1. Подготовка буферов

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте сверхчистый H₂O для всех буферов. Он не обязательно должен быть стерильным. Фильтруйте все растворы, описанные на этапах 1,1-1,4, шприцевым фильтром 0,2 мкм, аликвотой порциями по 500 мкл-2 мл на пробирку в зависимости от использования и храните при -20 °C.

1. Приготовьте 10% BSA путем взвешивания 2 г BSA в коническую трубку 50 мл и заполнения до отметки 20 мл h_2O. Перемешайте до растворения BSA (около 30 мин), а затем восполните объем до 20 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте высококачественную BSA (см. Таблицу материалов). 10% раствор BSA используется как в приготовлении бисера, так и в смеси для подвижности.
2. Для приготовления шариков готовят буфер Xb (10 мМ HEPES, 0,1 М KCl, 1 мМ_MgCl2 и 0,1 мМ CaCl₂, рН 7,5) в виде 10-кратного раствора и разбавляют перед использованием (100 мкл 10x Xb запасного раствора + 900 мкл_H2O). Приготовьте Xb/1% BSA путем смешивания 100 мкл 10x Xb раствора + 100 мкл 10% BSA + 800 мкл_H2O.
3. Получают G-буфер (2 мМ Трис, 0,2 мМ CaCl₂, 0,2 мМ DTT, 2 мМ АТФ), который является буфером, используемым для разбавления мономерного актина (G-актина). Отрегулируйте pH 7, а не pH 8, как традиционно используется (см. обсуждение).
4. Подготавливают подвижный буфер MB13 (10 мМ HEPES, 1,5 мМ АТФ, 3 мМ DTT, 1,5 мМ MgCl₂, 1 мМ EGTA, 50 мМ KCl, 1% BSA, рН 7,5). Для некоторых приложений полезно 10x MB13. Тем не менее, подготовьте 10x MB13 без BSA, так как это приводит к проблемам во время регулировки pH. Добавьте BSA из 10% раствора (приготовленного на этапе 1.1) при восстановлении 1x MB13 из 10x MB13.

2. Приготовление белковых растворов

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте сверхчистый H₂O для всех повторных суспензий. Он не обязательно должен быть стерильным. Обработайте все белки на льду и аликвоте в предварительно охлажденные трубки. Манипулируйте осторожно, чтобы не образовывать пузырьки, и никогда не вихревые белковые растворы. Для хранения запасов при температуре -80°C мгновенное замораживание в жидком азоте не требуется. Адаптируйте размер аликвоты, чтобы избежать более пяти циклов замораживания-оттаивания, так как это, по-видимому, не влияет на активность любого из белков. Рабочие аликвоты могут храниться при -20 °C в течение нескольких недель.

1. Приготовьте раствор G-актина (кроличьих скелетных мышц), как описано ниже.
   1. Импульсная центрифуга актина порошка (см. Таблицу материалов) при 4 °C для сбора твердого вещества на дне трубки.
   2. Добавьте_H2Oв соответствии с инструкциями производителя (1 мг белка в 100 мкл холодного_H2O для немаркированного актина, 100 мкг белка в 100 мкл холодного_H2O для актина, меченного ATTO).
   3. Дайте ему постоять на льду не менее 15 минут. Аккуратно перемешайте, пипеткой вверх и вниз, дайте постоять на льду еще как минимум 15 минут и снова перемешайте. Импульсная центрифуга при 4 °C для сбора раствора на дне трубки и перемешивания.
   4. Приготовьте 10-50 мкл аликвот немаркированного актина в зависимости от использования и 20 мкл аликвот актина, меченного ATTO. Храните аликвоты при -80 °C.
   5. Для деполимеризации актиновых олигомеров, образующихся при лиофилизации и замораживании, разводят аликвоту повторного суспендированного актина ~8 раз в G-буфере с шипами с дополнительными АТФ и ДТТ (например, до 20 мкл ресуспендированного раствора актина со стадии 2.1.4, добавляют 134 мкл G-буфера, 0,32 мкл 0,2 мММ АТФ и 0,16 мкл 1 М ДТТ). Для флуоресцентной маркировки добавьте приблизительно 10% меченого актина; например, добавьте 5 мкл меченого ATTO актина к 40 мкл разбавленного немаркированного актина. Дайте ему деполимеризоваться на льду со случайным смешиванием (пипеткой), по крайней мере, от нескольких дней до недели, прежде чем измерять концентрацию белка с помощью анализа Брэдфорда, как описано в шаге 3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хранить разбавленный немаркированный и флуоресцентный актин на льду в холодном помещении или холодильнике; никогда не замерзать и не давать согреться. Препарат будет продолжать деполимеризацию с течением времени, и при правильном обращении может использоваться не менее 6 месяцев.
2. Ресуспенд комплекса Arp2/3 (мозг свиньи) (см. Таблицу материалов) по инструкции производителя (20 мкг белка в 20 мкл холодного_H2O), с последовательностью импульсного центрифугирования, перемешивания и т.д. на льду, как описано для актина на стадии 2.1. Объедините белковые растворы из повторного использования двух пробирок порошка, чтобы иметь больший запас для воспроизводимых экспериментов. Приготовить 2 мкл аликвоты и хранить при -80 °C.
3. Ресуспенд профилина (рекомбинант человека) (см. Таблицу материалов) в 4 раза более высокой концентрации, чем указано в инструкции производителя (100 мкг белка в 25 мкл холодного_H2O), с последовательностью импульсного центрифугирования, перемешивания и т.д. на льду, как для актина на стадии 2.1. Объедините белковые растворы из повторного использования двух пробирок порошка перед определением концентрации белка, чтобы иметь больший запас для воспроизводимых экспериментов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хранить на льду в холодном помещении или холодильнике; никогда не замерзать и не давать согреться. При правильном обращении повторно суспендированный профилин хорош в течение как минимум от 6 месяцев до 1 года.
4. Повторное укупоривание белка (α1β2, рекомбинант человека) (см. Таблицу материалов) в соответствии с инструкциями производителя (50 мкг белка в 50 мкл холодного_H2O), с последовательностью импульсного центрифугирования, смешивания и т.д. на льду, как описано для актина на стадии 2.1. Охладить 50 мкл глицерина на льду и добавить к нему 50 мкл повторно суспендированного белка; Аккуратно перемешать. Хранить при -20 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор не замерзает, и активность является надежной, поэтому раствор может храниться в виде одной аликвоты в течение нескольких месяцев или даже лет, если обращаться с ним осторожно. Мышиный рекомбинантный укупорочный белок, наиболее часто используемый в прошлом в экспериментах in vitro ¹³, скоро будет коммерчески доступен.
5. Повторноуспендный гельсолин (человеческий рекомбинантный, His-меченый) (см. Таблицу материалов) следуя инструкциям производителя (20 мкг белка в 20 мкл холодного_H2O), с последовательностью импульсного центрифугирования, смешивания и т.д. на льду, как описано для актина на стадии 2.1. Около 2 мкл гельзолина используется в день экспериментов; поэтому приготовьте крупные аликвоты (5-10 мкл) и храните при -80 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол с гельзолином предоставляется в качестве альтернативы. Рекомендуется использовать укупорочный белок вместо гельсолина, либо приобретенный, либо очищенный, как в¹³.
6. Resuspend VCA (human WASP-VCA, GST-tagged) (см. Таблицу материалов) при 2х более высокой концентрации, чем указано в инструкции производителя (500 мкг белка в 250 мкл холодного_H2O), с последовательностью импульсного центрифугирования, смешивания и т.д. на льду, как для актина на стадии 2.1. Сделать 10 мкл аликвот и хранить при -80 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как только SpVCA (человеческий pVCA, стрептавидин и His-tagged) коммерциализируется или если возможна очистка белка¹⁴ , рекомендуется использовать SpVCA вместо VCA. VCA не воспроизводимо дает кометы в условиях, описанных здесь.

3. Измерение концентрации белка

1. Построить стандартную кривую Брэдфорда, состоящую из двух перекрывающихся последовательных разбавлений BSA.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартную кривую нужно строить только каждые пару месяцев (или даже реже), пока спектрофотометр не изменится.
   1. В строке 1 стойки для микротрубок поместите трубки для разбавления BSA серии No1: четыре трубки по 2 мл, а затем четыре трубки по 1,5 мл. В строке 3 стойки поместите трубки для разбавления BSA серии #2, как для серии #1. В строке 5 стойки поместите одну пробирку объемом 2 мл для каждого измеряемого образца вместе с двумя пробирками по 1,5 мл. Добавьте одну трубку объемом 1,5 мл в строку 5 для заготовки.
   2. Отмерьте реагент Брэдфорда (см. Таблицу материалов) в трубках объемом 1,5 мл.
      1. Наполните коническую трубку объемом 15 мл сверху реагентом Брэдфорда для облегчения пипетки (избыток будет возвращен в бутылку в холодильнике) на льду. Возьмите 200 мкл реагента Брэдфорда и выбросьте его обратно в коническую трубку, чтобы намочить наконечник пипетки. Поскольку раствор вязкий, пипетка медленно позволяет раствору входить и выходить из кончика полностью, не образуя пузырьков.
      2. С помощью «предварительно мокрого» наконечника медленно пипеткуйте 200 мкл реагента Брэдфорда в каждую из пробирок объемом 1,5 мл в стойке (четыре для каждого разбавления BSA, один для заготовки и два для каждого измеряемого образца). Сделайте это сначала, чтобы дать реагенту Брэдфорда тщательно нагреться до комнатной температуры перед смешиванием с белковыми растворами. Верните оставшееся содержимое конической трубки объемом 15 мл в бутылку.
   3. Отмерьте_H2Oв пробирках объемом 2 мл. В строке 1 стойки добавьте 1 990 мкл_H2O к первой трубке и 900 мкл к трем другим трубкам. Для строки 3 добавить 1 992,5 мкл к первой трубке и 900 мкл к трем другим пробиркам. Добавьте 2 000 мкл H₂O к каждой из пробирок в строке 5.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для всех объемов, превышающих 1000 мкл, используйте пипетку 1000 мкл, но вводите полное количество, пипетируя дважды. Важно подготовить все перед началом последующих этапов, чтобы избежать оставления белков сильно разбавленных в_H2Oв течение длительных периодов времени.
   4. Для приготовления серии разбавления BSA No1 смешайте 10 мкл калиброванного 2 мг/мл BSA (см. Таблицу материалов) в пробирке с 1,990 мкл_H2Oдля получения раствора 10 мкг/мл. Из этого делают три последовательных разведения (5 мкг/мл, 2,5 мкг/мл и 1,25 мкг/мл BSA) путем переноса 900 мкл каждого раствора в следующую пробирку (содержащую 900 мкл_H2O).
   5. Для приготовления серии разбавления BSA No2 смешайте 7,5 мкл калиброванного 2 мг/мл BSA в пробирке с 1 992,5 мкл_H2O, чтобы получить раствор 7,5 мкг/мл. Из этого делают три последовательных разведения (3,75 мкг/мл, 1,875 мкг/мл и 0,9375 мкг/мл BSA) путем переноса 900 мкл каждого раствора в следующую пробирку (содержащую 900 мкл_H2O).
   6. Перемешайте и считайте поглощение для получения стандартной кривой. Добавьте 800 мкл H₂O в трубку реагента Брэдфорда для заготовки и запустите таймер. Максимально эффективно, не образуя пузырьков, смешайте 800 мкл каждого стандарта BSA с 200 мкл реагента Брэдфорда в подготовленных тубах. После того, как все стандарты были смешаны с реагентом Брэдфорда (< 5 мин), перелейте каждый стандарт в одноразовую кювету и считайте поглощение при 600 нм в спектрофотометре после заглушения машины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Одна и та же кювета может быть использована для чтения всей серии, если сначала считывается наименее концентрированный стандарт, а кювета хорошо опорожняется между чтениями. Повторяйте стандартную кривую до тех пор, пока линейное соответствие не получит значение R не менее 0,99. Только после того, как будет освоено пипетка и щадящее перемешивание, приступайте к чтению образцов.
2. Измерение концентраций актина и актин-связывающих белков
   1. В пробирках по 2 мл, содержащих 2000 мкл_H2O(приготовленных на стадии 3.1.3), осторожно смешайте следующее: по 2 мкл комплекса Arp2/3 и профилина, 4 мкл меченого G-актина, по 5 мкл гельзолина и VCA и 8 мкл укупорочного белка (человеческий рекомбинант). Сразу берут 800 мкл раствора и смешивают с уже приготовленным реагентом Брэдфорда, а затем повторяют, чтобы иметь два показания в пределах 5%-10 % друг от друга для каждого образца. Большая разница указывает на проблему с повторной приостановкой или обработкой. Прочитайте в течение нескольких минут после смешивания с реагентом Брэдфорда.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если используется стандартная кривая другого дня, то в дополнение к образцам необходимо подготовить только заготовку из этапа 3.1.6.
3. Рассчитайте концентрации актина и актин-связывающих белков, используя стандартную кривую и коэффициент разбавления. Повторите измерение для каждого нового повторного суспендирования. Молекулярные массы для преобразования показаний мг/мл, полученных с помощью анализа Брэдфорда, в мкМ: актин 43 кД, комплекс Arp2/3 224 кД, профилин 15 кД, гельсолин 95 кД, укупорочный белок 68 кД (рекомбинант человека) или 63,5 кД (рекомбинант мыши), VCA 43 кД и SpVCA 54 кД (молекулярная масса мономера).

4. Покрытие бисером

1. Предварительно охладите центрифугу до 4 °C и установите перемешивающий сухой блок (см. Таблицу материалов) на 18 °C.
2. Вымойте бусины: пипетку 50 мкл буфера Xb в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл, добавьте 9 мкл суспензии бусин диаметром 4,5 мкм или 2 мкл суспензии шарика диаметром 1 мкм (2,5 % суспензии с массой тела) (см. Таблицу материалов). Тщательно перемешайте и центрифугируйте образцы при 20 000 х г в течение 10 мин при 4 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Общая площадь поверхности бисера обоих размеров бусины составляет 3^см2:
   
   выводится путем вычисления количества бусин, а затем их общей поверхности с использованием классических уравнений для объема и площади поверхности сфер. Другие размеры бусин могут быть использованы, если количество скорректировано таким образом, чтобы общая площадь поверхности оставалась постоянной на уровне 3^см2.
3. Покройте шарики: осторожно удалите супернатант, не нарушая бусин, и повторно суспендируйте гранулу бусины в 40 мкл 2 мкМ SpVCA (или 7 мкМ VCA) в буфере Xb путем бережного пипетирования. Перемешивать при 18 °C, 1 000 об/мин в течение 20 мин.
4. Вымойте шарики с покрытием: центрифугируйте смесь (20 000 х г в течение 10 мин при 4 °C) и аккуратно удалите супернатант. Повторно суспендировать шарики в 50 мкл холодного Xb/1% BSA и центрифугу при 20 000 х г в течение 10 мин при 4 °C. Удалите супернатант и повторите шаг стирки 1x.
5. Повторно суспендируйте гранулу бусины с покрытием со стадии 4.4 в 120 мкл холодного Xb/1% BSA для обоих размеров бусин таким образом, чтобы площадь поверхности бисера/мкл бисерного раствора была одинаковой. Хранить на льду в холодильнике или холодильной камере. Бусины с покрытием будут продолжать нормально функционировать в течение как минимум нескольких недель.

5. Подготовка мотористического микса и слайдов для наблюдения

ПРИМЕЧАНИЕ: Общий объем подвижной смеси составляет 8,4 мкл, что обеспечивает зазор около 25 мкм между затвором и крышкой 18 мм x 18 мм, поэтому бусины всех размеров (диаметром до 10 мкм) не сжимаются. Основная смесь подвижности представляет собой приблизительно 5 мкМ G-актина (10% меченого флуоресцентного актина) с 5 мкМ профилина, 50 нМ комплекса Arp2/3 и 25 нМ колпачкового белка (или гельзолина 240 нМ).

1. Приготовьте реакционную смесь для подвижности. Точное количество актина (и, следовательно, профилина) зависит от концентрации, рассчитанной на стадии 3.3, но репрезентативная реакция выглядит следующим образом. Смешать на льду, в таком порядке: 3,2 мкл MB13, 1,5 мкл профилина при 30 мкм, разведенных в MB13, 1 мкл белка укупорки при 0,21 мкМ, разведенного в MB13 или гелсолина, разведенного до 2 мкм в MB13, 1 мкл комплекса Arp2/3 при 0,47 мкМ, разведенного в MB13, 0,2 мкл бисерной суспензии (вихрь непосредственно перед применением), и 1,5 мкл актина при 30 мкМ в G-буфере. Хорошо перемешать, но быстро и запустить таймер.
2. Нанесите всю реакционную смесь подвижности на слайд. Накройте крышкой размером 18 мм x 18 мм и запечатайте крышку расплавленным VALAP с помощью небольшой кисти. VALAP представляет собой смесь ланолина, парафина и вазелина (см. Таблицу материалов) 1:1:1 по весу, расплавленную и перемешанную вместе.

6. Микроскопическое наблюдение

1. Немедленно наблюдать реакции подвижности с помощью 100-кратного объектива на вертикальном или перевернутом микроскопе (см. Таблицу материалов), оснащенном фазовым контрастом и/или эпифлуоресцентной микроскопией (куб GFP, см. Таблицу материалов). Наблюдения проводятся при комнатной температуре (23-25 °C).
   1. Чтобы получить среднюю скорость смещения для всей популяции бусин, запишите фазовый контраст или флуоресцентные неподвижные изображения с течением времени, сканируя весь слайд. Измеряйте длину кометы вручную и график по отношению ко времени. Наклон линейной посадки представляет собой среднюю скорость роста.
   2. Чтобы оценить скорость отдельных бусин, соберите покадровые пленки в фазово-контрастной микроскопии. В зависимости от скорости бусины и требуемого разрешения, делайте кадры каждые 1-10 с. Используйте инструмент отслеживания любой программы обработки изображений для получения скоростей и траекторий бисера.

Результаты

Одним из ключевых аспектов воспроизводимого создания актиновых комет на бусинах является мягкое и точное пипетирование тонких актин-связывающих белков. Создание стандартной кривой Брэдфорда является хорошим способом оценки навыков пипетки. На рисунке 1A,B показаны трубки для стандартной кривой и пример того, как выглядят два последовательных разведения BSA после смешивания с реагентом Брэдфорда. Обратите внимание на градуированный синий оттенок (более высокая концентрация белка дает более голубой раствор). При считывании в спектрофотометре и построении графика эти решения дают стандартную кривую, как показано на рисунке 1С. Чтобы практиковать тщательное пипетирование, анализ следует повторять до тех пор, пока коэффициент линейной корреляции не составит 0,999, как показано на рисунке.

После того, как концентрации коммерческих повторно суспендированных белков были тщательно оценены с помощью анализа Брэдфорда, шарики с покрытием и смесь подвижности готовятся и смешиваются вместе. На рисунке 2А показаны репрезентативные изображения различных стадий образования комет: актиновые облака образуются в течение нескольких минут после смешивания шариков, покрытых SpVCA, и среды подвижности; поляризация облаков происходит в ~5 мин, а производство кометы в 15-20 мин. Актиновые кометы, видимые как с помощью эпифлюоресценции, так и с помощью фазово-контрастной микроскопии (рисунок 2А), продолжают удлиняться в течение многих часов, но постоянная скорость не поддерживается, поэтому подвижность шариков обычно оценивается в течение 1 ч. С другой стороны, для получения ярких актиновых облаков требуется 30 мин с шариками, покрытыми VCA (рисунок 2B), и кометы не образуются, хотя симметрия начинает нарушаться через 1-2 ч (стрелка на рисунке 2B), а облака показывают поляризацию после ночной инкубации.

На рисунке 3 показан пример оценки скорости шарика в присутствии укупорочного белка. Поскольку все бусины нарушают симметрию примерно в одно и то же время, выполняются «псевдо-покадровые» записи, где сканируется слайд и делаются снимки всей популяции комет с течением времени (рисунок 3A). Кометы не деполимеризуются; поэтому увеличение длин комет, измеренное с течением времени, может быть использовано для расчета скорости смещения (рисунок 3B). Гельсолин может быть использован в месте укупорки белка для образования кометы, если добавить в 10 раз больше гельзолина, чтобы компенсировать его пониженную укупорочную активность. Кометы, образующиеся в присутствии гельсолина, качественно одинаковы и движутся примерно с той же скоростью, что и бусины с укупорочным белком (рисунок 3С). Укупорочная активность является ключом к концентрации полимеризации на поверхности бусины, и когда ни укупорочный белок, ни гельсолин не включены в смесь подвижности, актиновые облака никогда не поляризуются, образуя кометы, хотя вокруг бусин образуются яркие актиновые облака (рисунок 3D). Кометы на шариках могут быть использованы для измерения производства силы на основе актина в различных биохимических контекстах путем изменения смеси подвижности и наблюдения за результатом подвижности с использованием различных методов микроманипуляции, например¹⁵.

Рисунок 1: Стандартная кривая Брэдфорда. (A) Изображение того, как настроить трубки для создания стандартной кривой Брэдфорда. Пробирки для отбора проб не показаны. (B) Изображение двух перекрывающихся последовательных разведений BSA после смешивания с реагентом Брэдфорда. (C) Абсорбции при 600 нм растворов, показанных в пункте (B), измеряются в спектрофотометре и строятся в зависимости от концентраций белка в растворах BSA. Линейная подгонка используется для расчета концентрации образца. Коэффициент корреляции, R, линейного соответствия равен 0,999. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Образование комет на бусинах, покрытых SpVCA, в отличие от бусин с VCA-покрытием. (A) Репрезентативные бусины с покрытием SpVCA (разные бусины на каждом изображении), показанные с течением времени. Указано время с момента перемешивания. Актиновые облака формируются сразу, а поляризация облаков дает кометы, которые продолжают удлиняться в течение нескольких часов. (B) Репрезентативные бусины, покрытые VCA (разные бусины на каждом изображении), показанные с течением времени. Более 1 ч необходимо, чтобы увидеть начало поляризации актиновых облаков (стрелка) и даже длительные инкубации не производят комет. Все изображения имеют бусины диаметром 4,5 мкм, эпифлуоресцентную визуализацию флуоресцентного актина в сочетании с визуализацией фазового контраста для 15 и 20-минутных временных точек в (A), шкала = 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Анализ скорости комет и шариков. (A) и (C) В присутствии либо укупорочного белка (CP), либо гельсолина, актиновые облака поляризуются, образуя кометы в первые 20 минут реакции, и кометы удлиняются с течением времени. Время от смешивания, указанное для каждого изображения; каждое изображение представляет собой отдельную бусину. Существует некоторая изменчивость между бусинами и препаратами, но в среднем бусины движутся со скоростью микрон / субмикрон в минуту (0,2-1 мкм / мин) в стандартных условиях, описанных здесь. (B) Репрезентативный график, показывающий оценку длины кометы (всей популяции бусин) с течением времени. Наклон линейной корреляции соответствует средней скорости смещения, в данном случае 0,24 мкм/мин. (D) При отсутствии укупорочной активности (без укупорочного белка или гельсолина) вокруг шариков образуются актиновые облака, но кометы не образуются. Все изображения имеют бусины диаметром 4,5 мкм, эпифлуоресцентную визуализацию флуоресцентного актина, шкалы = 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

Протокол, подробно описанный здесь, описывает, как получить рост актиновой сети на поверхностях бусин, образование комет и подвижность бусин с использованием коммерчески доступных белков. Однако иногда кометы не наблюдаются воспроизводимо или являются неоднородными между скольжением и покровом. В следующем обсуждении подчеркиваются некоторые ключевые моменты протокола и предлагаются некоторые параметры, которые могут быть скорректированы. Одним из факторов, который следует иметь в виду, является то, что на образование комет и скорость шарика влияет температура, причем температура намного выше 25 ° C или намного ниже 23 ° C негативно влияет на формирование комет и дает невоспроизводимые данные. Настоятельно рекомендуется использовать микроскоп с контролируемой температурой или микроскоп в помещении с климат-контролем. Хотя флуоресцентно меченый актин часто включается в смесь подвижности для наблюдения комет с помощью флуоресцентной микроскопии, как только кометы достигают длины более диаметра шарика, они также видны с помощью фазово-контрастной микроскопии в виде темного мазка рядом с шариком. Визуализация фазового контраста больше подходит для покадровой визуализации, поскольку некоторая фототоксичность связана с флуоресцентной визуализацией даже через вращающийся диск. Поскольку бусины со временем оседают, перевернутый микроскоп производит меньший горизонтальный дрейф бусин, чем вертикальный, и больше подходит для фильмов. Использование расплавленного VALAP для герметизации слайдов важно, поскольку такие вещества, как лак для ногтей, препятствуют образованию комет. Большое количество VALAP может быть изготовлено в стакане, а затем зачерпнуто для заправки меньших стаканов, более поддающихся быстрому плавлению. VALAP хорош в течение многих лет при комнатной температуре.

Другим ключевым техническим аспектом является тщательная подготовка буферной и моторизованной смеси. Следует соблюдать осторожность при приготовлении MB13, в частности на этапе регулировки pH. рН MB13 следует быстро отрегулировать до нейтрального с NaOH, чтобы избежать гидролиза АТФ, но не слишком быстро, поскольку EGTA солюбилизируется по мере приближения pH к нейтральному. EGTA является ключевым ингредиентом, потому что он комплексует кальций, связанный с актином, давая в смеси подвижности более активную магниевую форму¹⁶. MB13, приготовленный слишком быстро или слишком медленно, дает неоптимальное образование комет или даже вообще не дает. Дополнительным ключевым моментом является тщательный учет концентрации KCl в смеси подвижности при игре с условиями. Например, при использовании 1x MB13 в реакционной смеси и разбавлении профилина, укупорочного белка и комплекса Arp2/3 в MB13 конечная концентрация KCl в реакции подвижности составляет около 40-50 мМ за счет разбавления G-буфером. Эта концентрация дает наилучшие результаты в кометном анализе, и более 60 мМ KCl снижает комплексную ядерную активность Arp2/3.

С точки зрения белка, критическим техническим аспектом получения актиновых комет является правильное обращение с коммерческими актин-связывающими белками, в частности точное пипетирование количеств микролитров. Линейность стандартной кривой Брэдфорда является хорошим тестом на пипетирование, и кривая затем может быть использована для рутинных измерений концентраций белка. Действительно, при использовании повторно суспендированных коммерческих белков для кометной процедуры важно всегда проверять концентрации белка, так как изменчивость партии и ошибка пользователя во время повторного суспендирования могут привести к различиям между реальными и ожидаемыми концентрациями. Иногда небольшие различия в концентрациях белка могут привести к полному отсутствию комет.

Другим важным аспектом представленного здесь способа является использование профилин-комплексного G-актина в качестве топлива для полимеризации. Исторически сложилось так, что системы in vitro использовали предварительно полимеризованный нитевидный актин (F-актин) в качестве источника актина: деполимеризация в объемной полимеризации на поверхности^10,17. Это имело преимущество в контроле уровней G-актина, но добавляло уровень сложности, требующий дополнительных компонентов для катализа деполимеризации. Поскольку оборот актиновой сети не является необходимым для производства силы и подвижности, которые подпитываются нуклеацией и полимеризацией на поверхности шарика, в то время как факторы деполимеризации актина, такие как адФ/кофилин, действуют на старые сети, удаленные от поверхности¹⁸, большая часть in vitro восстановление подвижности на основе актина в настоящее время осуществляется без оборота для простоты. Тем не менее, есть некоторые недостатки использования G-актина. Во-первых, при использовании коммерческого актина, который был лиофилизирован, присутствуют олигомеры. Этапы деполимеризации, описанные здесь, очень важны для получения воспроизводимых результатов. В частности, хотя G-буфер традиционно настраивается на рН 8, более низкий рН (например, рН 7), по-видимому, лучше работает в анализах, описанных в этой статье, возможно, потому, что низкий рН усиливает деполимеризацию¹⁹. Другим недостатком использования G-актина является то, что после помещения в солевые условия, разрешающие полимеризацию, происходит спонтанное зарождение и F-актин образуется в массе, а также на поверхности шарика. Комплексирование G-актина с профилином подавляет спонтанное зарождение в объемной и заостренной концевой полимеризации, тем самым фокусируя как нуклеацию, так и колючую концевую полимеризацию на поверхности²⁰. Профилин-G-актин физиологически актуален, так как большая часть актина в клетке присутствует в этой форме²¹. Здесь используется соотношение профилин:актин 1:1; однако более высокие соотношения (например, 3:1) более тщательно ингибируют полимеризацию в массе, хотя более высокие соотношения также ингибируют комплекс Arp2/3 и колючее конечное удлинение в некоторой степени^22,23.

Укупорочная активность также является ключевой для образования комет, поскольку она обеспечивает введение нового актина на поверхность посредством циклов нуклеации поверхностно-активированным комплексом Arp2/3^24,25. Без укупорки актиновые облака не нарушают симметрию, образуя кометы, потому что полимеризация на поверхности не создает достаточного напряжения, чтобы разорвать облако²⁶. В прошлом мы использовали очищенный в домашних условиях рекомбинантный мышиный укупорочный белок¹³, но тесты, проведенные для этой статьи, показывают, что коммерчески доступный рекомбинантный человеческий укупорочный белок одинаково эффективен, как и коммерчески доступный гельсолин, хотя необходимо использовать в 10 раз больше гельсолина, и для некоторых применений он может быть нецелесообразным, поскольку он обладает актиновой разрывной активностью, а также колпачком²⁷.

Наконец, надежность этого метода заключается в использовании очень активного активатора комплекса Arp2/3, стрептавидин-pVCA (SpVCA)²⁸. SpVCA включает профилин-G-актиновый связывающий домен WASP (домен p) в дополнение к комплексному домену связывания Arp2/3, поскольку это наиболее эффективно в условиях²⁹ профилина-G-актина. Что еще более важно, использование метки стрептавидина, первоначально введенной для обеспечения функционализации поверхности через связь биотин-стрептавидин, имеет дополнительный эффект увеличения активации комплекса Arp2/3, по-видимому, из-за того, что стрептавидин является тетрамером и, таким образом, кластеризует активатор, который, как известно, увеличивает комплексную активность Arp2/3³⁰ . Коммерчески производимая SpVCA в настоящее время находится в разработке и скоро будет доступна для покупки. Следует также отметить, что, хотя 40 мкл 2 мкМ SpVCA обычно используется для покрытия 3^см2 поверхности шарика, другие концентрации покрытия (выше и ниже) также работают, и игра с этими условиями дает различные скорости роста кометы и морфологию. Действительно, когда кометы не образуются или размер кометы не является однородным на слайде, должны быть проверены различные условия покрытия, а также различные концентрации KCl и профилина в смеси подвижности. Концентрации актина, комплекса Arp2/3 и белка в смеси подвижности также могут быть изменены для оптимизации образования комет, но в наших руках изменение этих пропорций часто дает запутанные результаты.

В заключение, методы, описанные здесь, производят актиновую сборку на поверхностях бусин и подвижность, но можно использовать любую поверхность, которая может быть функционализирована с помощью SpVCA. В тех случаях, когда адсорбция, описанная здесь, не работает, фрагмент стрептавидина может быть использован для прикрепления SpVCA к интересующей поверхности после биотинилирования. Сформированные таким образом актиновые структуры, кометы или иным образом, могут быть использованы для тестирования различных биохимических и биофизических аспектов актиновых сетей и особенно подходят для физических манипуляций с микропипетками, оптическими пинцетами и лазерными абляциями ^15,26,31,32. В дополнение к его использованию для исследовательского сообщества, подход, описанный здесь, подходит в качестве учебного пособия для студентов бакалавриата по биофизике для изучения концепций активной материи, таких как нарушение симметрии и самоорганизация.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Актин, мышцы кролика, конъюгат Alexa Fluor 488	Invitrogen (ThermoFisher Scientific)	A12373 (недавно снят с производства)	Этот продукт можно заменить на ATTO-488 актин от Hypermol.
Актин, мышцы кролика, ATTO-488	Hypermol	8153
Актин, скелетные мышцы кролика	Цитоскелет	AKL99
Arp2/3 комплекс	Цитоскелет	RP01P
ATP	Sigma	A7699
BioSpectrometer, базовый	Eppendorf	035739
Bradford Реактив	Bio-Rad	500-0006
BSA, высококачественный	Sigma	A3059
BSA стандартный 2 мг/мл (Pierce)	Thermo Scientific	23209
Capping protein (a1b2, мышиный рекомбинант)	Очищенный в домашних условиях (Ссылка 13)		Этот продукт скоро будет коммерчески доступен в Cytoskeleton.
Укупорочный белок (a1b2, рекомбинантный для человека)	Hypermol	8322
Cube, GFP: U-MNIBA3 или U-MWB2	Olympus	снят с производства	Можно использовать любой кубик GFP, адаптированный к используемому микроскопу.
Сухой блок, перемешивание: ThermoMixer C (охлаждаемый)	Eppendorf	035963
** с SmartBlock, 24 микропробирки 2 мл	Eppendorf	035969
Gelsolin (человеческий рекомбинантный, His-tagged)	Цитоскелет	HPG6
Lanolin	Sigma	49909
Микроцентрифуга 5427R + ротор	Eppendorf	934126
Микроскоп, вертикальный: BX51	Olympus	снят с производства	Можно использовать любой эпифлуоресцентный вертикальный микроскоп, оснащенный фазово-контрастной оптикой.
Микроскоп, инвертированный: IX70	Olympus	снят с производства	Можно использовать любой эпифлуоресцентный инвертированный микроскоп, оснащенный фазово-контрастной оптикой.
Парафин	Sigma	76244
Вазелин: вазелин	Пипетки Sigma	16415
Research Plus	Пипетки Eppendorf		Gilson не так хорошо подходят для доставки очень малых объемов (0,5 & микро; L, например).
**10 & микро; L		933954
**2.5 &микро; L		933953	Эти два размера необходимы, но рекомендуется использовать высококачественные пипетки (например, полный набор Research Plus).
Гранулы полистиролькарбоксилата	Polysciences
**ок. 1 &; m диаметр		08226
**ок. 4,5 &; m диаметр		17140-5
Профилин 1 (человеческий рекомбинантный, немеченный)	Цитоскелет	PR02
SpVCA (человеческий домен WASP pVCA, N-ter His-метка, C-ter стрептавидиновая метка)	Очищенный в домашних условиях (ссылка 14)		Этот продукт скоро будет коммерчески доступен в компании Cytoskeleton.
VCA (человеческий домен WASP VCA, GST-меченный)	Цитоскелет	VCG03