Method Article

Технические применения микроэлектродных массивов и записей зажимов пластырей на кардиомиоцитах, полученных из человеческих плюрипотентных стволовых клеток

DOI:

10.3791/64265

⸱

August 4th, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 2Division of Cardiovascular Medicine, Department of Medicine, Stanford University School of Medicine, 3Department of Radiology, Stanford University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Индуцированные человеком плюрипотентные кардиомиоциты, полученные из стволовых клеток (hiPSC-CMs), стали многообещающей моделью in vitro для скрининга кардиотоксичности, вызванной лекарственными препаратами, и моделирования заболеваний. Здесь мы подробно описываем протокол измерения сократимости и электрофизиологии hiPSC-CM.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Медикаментозная кардиотоксичность является основной причиной истощения и вывода лекарств с рынка. Поэтому использование соответствующих доклинических моделей оценки сердечной безопасности является критическим шагом при разработке лекарств. В настоящее время оценка сердечной безопасности по-прежнему сильно зависит от исследований на животных. Тем не менее, животные модели страдают от плохой трансляционной специфичности для людей из-за видовых различий, особенно с точки зрения электрофизиологических характеристик сердца. Таким образом, существует острая необходимость в разработке надежной, эффективной и основанной на человеке модели доклинической оценки сердечной безопасности. Индуцированные человеком плюрипотентные кардиомиоциты, полученные из стволовых клеток (hiPSC-CMs), стали бесценной моделью in vitro для скрининга кардиотоксичности, вызванной лекарственными средствами, и моделирования заболеваний. hiPSC-CMs могут быть получены от людей с различным генетическим фоном и различными заболеваниями, что делает их идеальным суррогатом для оценки лекарственно-индуцированной кардиотоксичности индивидуально. Поэтому необходимо разработать методологии всестороннего изучения функциональных характеристик hiPSC-CM. В этом протоколе мы подробно описываем различные функциональные анализы, которые могут быть оценены на hiPSC-CM, включая измерение сократимости, потенциала поля, потенциала действия и обработки кальция. В целом, включение hiPSC-CM в доклиническую оценку сердечной безопасности может революционизировать разработку лекарств.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Разработка лекарств является длительным и дорогостоящим процессом. Исследование новых терапевтических препаратов, одобренных Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) в период с 2009 по 2018 год, показало, что средняя стоимость капитализированных исследований и клинических испытаний составила 985 миллионов долларов США за продукт1. Медикаментозная кардиотоксичность является основной причиной истощения и изъятия лекарств с рынка2. Примечательно, что кардиотоксичность сообщается среди нескольких классов терапевтических препаратов3. Поэтому оценка сердечной безопасности является важным компонентом в процессе разработки препарата. Нынешняя парадигма оценки сердечной безопасности по-прежнему сильно зависит от животных моделей. Тем не менее, видовые различия от использования животных моделей все чаще признаются в качестве основной причины неточных прогнозов лекарственно-индуцированной кардиотоксичности у пациентов с человеческими заболеваниями4. Например, морфология потенциала сердечного действия существенно различается между людьми и мышами из-за вклада различных реполяризующих токов5. Кроме того, дифференциальные изоформы сердечного миозина и круговых РНК, которые могут влиять на физиологию сердца, были хорошо задокументированы среди видов 6,7. Чтобы восполнить эти пробелы, необходимо создать надежную, эффективную и основанную на человеке модель доклинической оценки сердечной безопасности.

Новаторское изобретение технологии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) создало беспрецедентные платформы для скрининга лекарств и моделирования заболеваний. За последнее десятилетие методы получения индуцированных человеком плюрипотентных кардиомиоцитов, полученных из стволовых клеток (hiPSC-CMs), стали хорошо известными 8,9. hiPSC-CMs привлекли большой интерес к их потенциальному применению в моделировании заболеваний, скрининге кардиотоксичности, вызванном лекарственными средствами, и прецизионной медицине. Например, hiPSC-CM были использованы для моделирования патологических фенотипов сердечных заболеваний, вызванных генетическим наследованием, таких как синдром удлиненного интервала QT10, гипертрофическая кардиомиопатия 11,12 и дилатационная кардиомиопатия 13,14,15. Следовательно, были выявлены ключевые сигнальные пути, участвующие в патогенезе сердечных заболеваний, которые могут пролить свет на потенциальные терапевтические стратегии эффективного лечения. Кроме того, hiPSC-CMs использовались для скрининга лекарственно-индуцированной кардиотоксичности, связанной с противоопухолевыми агентами, включая доксорубицин, трастузумаб и ингибиторы тирозинкиназы 16,17,18; изучаются стратегии смягчения результирующей кардиотоксичности. Наконец, генетическая информация, хранящаяся в hiPSC-CM, позволяет проводить скрининг и прогнозировать медикаментозную кардиотоксичность как на индивидуальном, так и на популяционном уровнях19,20. В совокупности hiPSC-CM оказались бесценным инструментом для персонализированного прогнозирования сердечной безопасности.

Общей целью этого протокола является разработка методологий для всестороннего и эффективного исследования функциональных характеристик hiPSC-CMs, которые имеют большое значение для применения hiPSC-CM для моделирования заболеваний, скрининга кардиотоксичности, вызванного лекарственными средствами, и прецизионной медицины. Здесь мы подробно описываем массив функциональных анализов для оценки функциональных свойств hiPSC-CM, включая измерение сократимости, потенциала поля, потенциала действия и обработки кальция (Ca2+) (рисунок 1).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка носителей и решений

  1. Подготовьте поддерживающую среду hiPSC-CM, смешав бутылку объемом 10 мл добавки 50x B27 и 500 мл среды RPMI 1640. Храните среду при температуре 4 °C и используйте ее в течение месяца. Уравновешивайте среднюю температуру до комнатной температуры (RT) перед использованием.
  2. Подготовьте посадочную среду hiPSC-CM, смешав 20 мл сыворотки и 180 мл поддерживающей среды hiPSC-CM (10% разбавление, v/v). В то время как свежеприготовленная посадочная среда является предпочтительной, ее можно хранить при 4 °C не более 2 недель. Уравновешивайте среду до RT перед использованием.
  3. Готовят раствор для покрытия внеклеточного матрикса путем размораживания одного флакона (10 мл) матрицы базальной мембраны при 4 °C в течение ночи и аликвотирования 500 мкл матрицы базальной мембраны в стерильных трубках объемом 1,5 мл. Хранить при -20 °C для дальнейшего использования. Смешайте 500 мкл матрицы базальной мембраны и 100 мл ледяной среды DMEM/F12 (разбавление 1:200, v/v) для получения раствора для покрытия фундаментной мембраны.
  4. Готовят 50 мл раствора Тирода, содержащего 135 мМ NaCl, 5,4 мМ KCl, 1 мМ MgCl2, 1,8 мМ CaCl2, 5 мМ глюкозы и 10 мМ HEPES. Отрегулируйте pH до 7,4 с naOH. Приготовьте свежий раствор Тирода в день эксперимента.
  5. Готовят 50 мл внутриклеточного пипеточного раствора, содержащего 120 мМ KCl, 1 мМ MgCl2, 10 мМ EGTA и 10 мМ HEPES. Отрегулируйте pH до 7,2 с помощью KOH. Аликвотируют внутриклеточный раствор пипетки в стерильных пробирках по 5 мл и хранят при -20 °С. В день эксперимента заново добавляют MgATP в раствор для достижения конечной концентрации 3 мМ.
  6. Готовят 1 мл Фура-2 АМ загрузочного раствора, содержащего 2 мкМ Фура-2 АМ и 0,1% Плуронический F-127. Приготовьте свежий погрузочный раствор в день эксперимента и защитите его от света.

2. Измерение движения сжатия hiPSC-CM

  1. Готовят пластины с матричным покрытием базальной мембраны, добавляя 100 мкл раствора внеклеточного матрикса в каждую скважину из 96-луночных пластин. Инкубируйте 96-луночные пластины в увлажненном инкубаторе клеточных культур при 37 °C, 5% CO2 в течение ночи.
  2. Ферментативная диссоциация hiPSC-CM
    1. Запросите hiPSCs в Стэнфордском сердечно-сосудистом институте iPSC Biobank (http://med.stanford.edu/scvibiobank.html). Генерация hiPSC-CM согласно предыдущим публикациям 8,9. Наблюдайте за hiPSC-CM, культивируемыми в шестилуночных пластинах под микроскопом при 10-кратном увеличении.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не диссоциируйте клетки, когда они все еще пролиферативны. В противном случае клетки перерастут на скважинах после повторного покрытия и приведут к неточным результатам функциональных анализов. Обычно hiPSC-CM останавливают пролиферацию на 18-23 день.
    2. Убедитесь, что hiPSC-CM сильно бьются и имеют чистоту более 95%. Оценивают чистоту путем иммуноокрашивания против сердечного тропонина Т, специфического маркера кардиомиоцитов 8,9.
    3. Аспирируйте поддерживающую среду и дважды промывайте клетки 1x DPBS. Добавляют 1 мл раствора клеточного отслоения в каждую лунку шестилуночных пластин и инкубируют в течение 10 мин при 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность инкубации должна регулярно контролироваться. Убедитесь, что клетки не перевариваются, так как это снизит жизнеспособность клеток.
    4. Осторожно пипетку hiPSC-CM вверх и вниз несколько раз, используя пипетку 5 мл, чтобы создать одноэлементную суспензию. Добавьте равный объем посевной среды hiPSC-CMs для нейтрализации раствора отслоения клеток.
    5. Центрифуга hiPSC-CMs при 300 х г в течение 3 мин при RT. Аспирировать супернатант и повторно суспендировать ячейку гранулы в 1-2 мл посевной среды hiPSC-CM.
    6. Количественно оцените плотность и жизнеспособность клеток с помощью метода исключения трипан-синего цвета. Вкратце смешайте 10 мкл клеточной суспензии с равным объемом трипанового синего цвета, переведите на слайд подсчета клеток, а затем подсчитайте с помощью счетчика клеток, как описано ранее21.
  3. Посев hiPSC-CM
    1. Удалите раствор покрытия внеклеточного матрикса с 96-луночных пластин.
    2. Посейте 50 000 клеток на лунку в 100 мкл посевной среды hiPSC-CM и поместите 96-луночные пластины в увлажненный инкубатор клеточной культуры при 37 °C, 5% CO2 на ночь.
    3. Замените посевную среду hiPSC-CM на 100 мкл поддерживающей среды hiPSC-CM через 1 день после нанесения покрытия. Меняйте носитель обслуживания hiPSC-CM каждые 2 дня до записи.
  4. Сбор данных
    1. Измерьте движение сокращения hiPSC-CM не менее чем через 10 дней после нанесения покрытия (рекомендуется).
    2. Включите регулятор температуры и установите 37 °C в качестве предпочтительной температуры. Включите микроскоп, камеру и источник питания CO2 .
    3. Наполните водяную рубашку держателя пластины соответствующим количеством стерильной деионизированной воды (рисунок 2А). Поместите 96-луночную пластину на держатель пластины и дайте ячейкам акклиматизироваться в течение не менее 5 минут.
    4. Откройте программное обеспечение для просмотра, установите частоту кадров камеры на 75 кадров в секунду (fps) и разрешение видео / изображения на 1024 × 1024 пикселей. Примените функции автофокусировки и автояркости. Запись видео и изображений hiPSC-CM.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте вибрации стола микроскопа во время записи.
    5. Откройте программное обеспечение анализатора для автоматического анализа.

3. Измерение потенциала поля hiPSC-CM

  1. Подготовка пластин с матричным покрытием из базальной мембраны
    1. Осторожно поместите каплю 8 мкл раствора внеклеточного матричного покрытия на площадь регистрирующего электрода каждой скважины пластин 48-луночного микроэлектродного массива (MEA). См. рисунок 3А для соответствующей области электрода для размещения капель. Этот шаг имеет решающее значение для сохранения монослоя hiPSC-CM, сосредоточенного на электродах. Избегайте прикосновения к электродам в любых обстоятельствах.
    2. Добавьте 3 мл стерильной деионизированной воды в область, окружающую скважины (рисунок 3А) плит MEA из 48 скважин, чтобы предотвратить испарение раствора покрытия. Инкубируют 48-луночные МЭА-пластины в увлажненном инкубаторе клеточных культур при 37 °C, 5% CO2 в течение 45-60 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не инкубируйте слишком долго, чтобы предотвратить высыхание матрицы базальной мембраны.
  2. Выполните ферментативную диссоциацию hiPSC-CM, как описано в шаге 2.2.
  3. Посев hiPSC-CM
    1. Удалите большую часть среды внеклеточного матрикса с поверхности скважины, не касаясь электродов, используя наконечник пипетки 200 мкл в пределах одного ряда или столбца.
    2. Посеять 50 000 клеток на скважину в каплю посевной среды hiPSC-CM объемом 8 мкл над площадью регистрирующего электрода каждой скважины одного ряда или столбца.
    3. Повторяйте последние два шага до тех пор, пока все колодцы не будут покрыты ячейками. Проверьте под микроскопом, что все скважины имеют суспензию hiPSC-CM. Желаемую плотность см. на рисунке 3B.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Присоединение hiPSC-CM будет скомпрометировано, если матрица базальной мембраны полностью высохнет, что сделает присоединение клеток неоптимальным.
    4. Инкубируйте 48-луночные пластины MEA в увлажненном инкубаторе клеточных культур при 37 °C, 5% CO2 в течение 60 мин.
    5. Медленно и осторожно добавляйте 150 мкл посевной среды hiPSC-CM в каждую лунку 48-луночных пластин MEA. Чтобы добавить среду без диспергирования ранее засеянных hiPSC-CM, держите пластину под углом 45°, прислоните кончик пипетки к стенке каждой скважины и медленно отпустите среду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление среды слишком быстро или с высоким давлением вытеснит прилипшие кардиомиоциты. Избегайте прямого контакта с каплевидной подвеской hiPSC-CM.
    6. Инкубируйте 48-луночные пластины MEA в увлажненном инкубаторе клеточных культур при 37 °C, 5% CO2 в течение ночи.
    7. Обновите посадочную среду hiPSC-CM 300 мкл поддерживающей среды hiPSC-CM через 1 день после нанесения покрытия. Меняйте носитель обслуживания hiPSC-CM каждые 2 дня перед записью.
  4. Сбор данных
    1. Выполняйте измерение МЭА не менее чем через 10 дней после нанесения покрытия (рекомендуется). На 10 день после нанесения покрытия проверьте плотность спонтанного биения монослоя hiPSC-CM под микроскопом при 10-кратном увеличении, которое должно быть таким, как показано на рисунке 3C.
    2. Поместите 48-луночную пластину MEA в записывающий инструмент. Сенсорный экран позволяет наблюдать температуру (37 °C) и состояние CO2 (5%).
    3. Откройте программное обеспечение навигатора. В окне экспериментальной настройки выберите Конфигурация сердца в реальном времени и Записи потенциала поля. Применяйте спонтанные или темповые конфигурации биения.
    4. В параметрах обнаружения биения установите порог обнаружения 300 мкВ, минимальный период биения - 250 мс, а максимальный период биения - 5 с. Выберите Полиномиальная регрессия для вычисления длительности потенциала поля (FPD).
    5. Проверьте, является ли базовый сигнал электрической активности зрелым и стабильным.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Зрелые формы сигналов, регистрируемые каждым электродом с многолуночной пластины MEA, должны отражать потенциал сердечного поля с легко идентифицируемыми характеристиками, совпадающими со всплеском деполяризации сердца и фазой реполяризации, как показано на рисунке 3D-F.
    6. Приобретайте базовую сердечную деятельность в течение 1-3 мин. Если требуется медикаментозное лечение, добавляют соединения в лунки после базовой регистрации. Поместите пластину в инкубатор не менее чем на 30 минут до следующей записи.

4. Измерение потенциала действия hiPSC-CM

  1. Готовят посуду с матричным покрытием из базальной мембраны, помещая 500 мкл раствора внеклеточного матриксного покрытия на стеклянно-нижнюю часть посуды диаметром 35 мм (рисунок 4А). Инкубируйте 35-миллиметровые чашки в увлажненном инкубаторе клеточных культур при 37 °C, 5% CO2 в течение ночи.
  2. Выполните ферментативную диссоциацию hiPSC-CM, как описано в шаге 2.2.
  3. Посев hiPSC-CM
    1. Снимите раствор покрытия внеклеточного матрикса с посуды толщиной 35 мм. Посейте 50 000 клеток на лунку в 500 мкл посевной среды hiPSC-CM на стеклянной нижней части посуды 35 мм.
    2. Инкубируйте 35-миллиметровые чашки в увлажненном инкубаторе клеточных культур при 37 °C, 5% CO2 в течение ночи. Удалите посадочную среду hiPSC-CM и добавьте 2 мл поддерживающей среды hiPSC-CM на посуду диаметром 35 мм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется положить нефильтрованный наконечник объемом 200 мкл на аспирационную пипетку объемом 2 мл, чтобы удалить отработанную среду, чтобы избежать прикосновения к клеткам.
    3. Меняйте культурную среду hiPSC-CM каждые 2 дня перед записью.
  4. Сбор данных
    1. Выполняйте измерение потенциала действия не менее чем через 10 дней после нанесения покрытия (рекомендуется). Приготовьте свежий раствор Tyrode, как описано в шаге 1.4. Разморозить одну аликвоту внутриклеточного раствора пипетки и заново добавить MgATP до конечной концентрации 3 мМ.
    2. Вытащите микропипетки из боросиликатных стеклянных капилляров с помощью съемника микропипетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтительным является сопротивление 2-5 МОм микропипетт.
    3. Замените поддерживающую среду hiPSC-CM раствором Tyrode и позвольте ячейкам акклиматизироваться к раствору Tyrode в течение 15 минут (рисунок 4C). Вставьте датчики температуры в камеру, поместите 35-миллиметровую чашку в камеру, как показано на рисунке 4C, и отрегулируйте температуру до 37 °C (рисунок 4D).
    4. Заполните микропипетки внутриклеточным раствором и вставьте их в держатель, соединенный с патч-зажимным усилителем головной ступени (рисунок 4Е). Откройте программное обеспечение для стимуляции/сбора, загрузите протокол записи потенциала действия и выберите конфигурацию напряжения-зажима.
    5. Вставьте микропипетку в раствор для ванны, выберите соответствующие одиночные hiPSC-CM, а также отрегулируйте и опустите положение микропипетки рядом с выбранной ячейкой с помощью микроманипулятора. Когда наконечник пипетки вставлен в раствор ванны, проверьте сопротивление пипетки, которое можно наблюдать на мониторе осциллографа.
    6. Расположите пипетку близко к ячейке, и импульсы тока немного уменьшатся, чтобы отразить растущее сопротивление уплотнения. Применяют мягкое всасывание с отрицательным давлением для увеличения сопротивления, которое будет образовывать гигазеал. Примените функцию Уплотнение .
    7. Примените дополнительное всасывание, чтобы сломать мембрану, чтобы получить конфигурацию записи всей клетки. Как только мембранная часть в области пипетки разрывается путем всасывания, внутренний раствор находится в равновесии с цитоплазмой клетки. На этом этапе переключитесь из режима зажима напряжения (V-зажим) в режим тока-зажима или без впрыска тока (C-Clamp) с помощью диалогового окна усилителя. Нажмите кнопку Запись , чтобы создать и сохранить файлы записи потенциального действия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Изменение режима обеспечивает непрерывную запись потенциалов спонтанного действия hiPSC-CM с помощью протокола записи без триггера и без стимуляции, который можно контролировать на выходе V-mon усилителя патч-зажима.

5. Измерение переходного процесса hiPSC-CM Ca2+

  1. Обратитесь к предыдущему протоколу для подготовки индивидуальных клеточных камер для визуализации Ca2+ 21. Для приготовления клеточной камеры с матричным покрытием базальной мембраны поместите в клеточные камеры 200 мкл раствора внеклеточного матриксного покрытия. Инкубируют клеточные камеры в увлажненном инкубаторе клеточной культуры при 37 °C, 5% CO2 в течение ночи.
  2. Выполните ферментативную диссоциацию hiPSC-CM, как описано в шаге 2.2.
  3. Посев hiPSC-CM
    1. Удалите раствор покрытия внеклеточного матрикса из клеточных камер. Посейте 20 000 клеток на лунку в 200 мкл посевной среды hiPSC-CM.
    2. Замените посевную среду hiPSC-CM на 200 мкл поддерживающей среды hiPSC-CM через 1 день после нанесения покрытия. Меняйте носитель обслуживания hiPSC-CM каждые 2 дня перед записью.
  4. Сбор данных
    1. Выполните переходное измерение Ca2+ не менее чем через 10 дней после нанесения покрытия (рекомендуется). Приготовьте свежий раствор Tyrode, как описано в шаге 1.4. Приготовьте свежий загрузочный раствор Fura-2 AM, как описано в шаге 1.6.
    2. Аспирировать среду технического обслуживания hiPSC-CM и дважды промыть раствором Tyrode. Применяют 100 мкл раствора Фура-2 АМ и инкубируют в течение 10 мин при РТ.
    3. Замените загрузочный раствор Fura-2 AM раствором Tyrode и подождите не менее 5 минут для полной деэтерификации Fura-2 AM.
    4. Добавьте каплю погружного масла на 40-кратный объектив перевернутого эпифлуоресцентного микроскопа, оснащенного 40-кратным масляным погружным объективом (0,95 NA). Поместите клеточную камеру в сценический адаптер микроскопа (рисунок 5А).
    5. Установите провода регулятора температуры в камеру ванны и установите ее на 37 °C. Установите электроды для стимуляции электрического поля и установите импульсы на частоту 0,5 Гц с длительностью 20 мс.
    6. Включите сверхскоростной источник света с переключением длин волн и установите его в режим быстрого переключения 340 нм и 380 нм в соответствии с инструкциями прибора.
    7. Примените время экспозиции 20 мс для обеих длин волн и время записи 20 с в программном обеспечении. Запишите видео, отражающее изменения в реальном времени переходного периода Ca2+ в hiPSC-CM. Экспортируйте данные в электронную таблицу и проанализируйте данные, какописано ранее 23.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает, как измерить движение сжатия, потенциал поля, потенциал действия и переходный процесс Ca2+ hiPSC-CM. Принципиальная схема, включающая ферментативное пищеварение, посев клеток, поддержание и проведение функционального анализа, показана на рисунке 1. Образование монослоя hiPSC-CM необходимо для измерения движения сжатия (рисунок 2B). Репрезентативный след сжимающе-релаксационного движения hiPSC-CM показан на...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Технология iPSC человека стала мощной платформой для моделирования заболеваний и скрининга лекарств. Здесь мы описываем подробный протокол для измерения сократимости hiPSC-CM, потенциала поля, потенциала действия и переходного периода Ca2+. Этот протокол обеспечивает комплексную характеристику сократимости hiPSC-CM и электрофизиологии. Эти функциональные анализы были применены в нескольких публикациях из нашей группы 12,13,18,24,25,26,27.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

J.C.W. является соучредителем Greenstone Biosciences, но не имеет конкурирующих интересов, поскольку представленная здесь работа полностью независима. Другие авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Блейка Ву за корректуру рукописи. Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (NIH) R01 HL113006, R01 HL141371, R01 HL163680, R01 HL141851, U01FD005978 и NASA NNX16A069A (JCW), а также AHA Postdoctoral Fellowship 872244 (GMP).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Стеклянная нижняя чашка 35 мм с микролункой 20 мм #1.5 крышное стеклоCellvisD35-20-1.5-NПатч-зажим
50x B27 дополненияLife Technologies17504-044hiPSC-CM культуральная среда
6-луночная культуральная тарелкаE & K ScientificEK-27160hiPSC-CM культура
96-луночный плоский прозрачный дно черный полистирол обработанные микропланшетыCorning3603Измерение сократительного движения
AccutaseSigma-AldrichA6964Ферментативная диссоциация
Axion's Integrated Studio (AxIS)Навигаторное программное обеспечениеAxion Biosystems
Капилляры из боросиликатного стеклаГарвардский аппаратBF 100-50-10,патч-зажим
CaCl2 1 M in H2OSigma-Aldrich21115Tyrode' s
раствор Камера подсчета клеток слайдыThermoFisher ScientificC10228Подсчет клеток
CytoView 48-луночные пластины MEAAxion BiosystemsM768-tMEA-48BMEA
DMEM/F12Gibco/Life Technologies12634028Внеклеточный матрикс среда
DPBS, без кальция, без магнияFisher Scientific14-190-250
EGTASigma-AldrichE3889Раствор для внутриклеточного дозатора
EPC 10 USB  патч хомут усилительWarner Instruments89-5000патч хомут
Фура-2, АМ, ячейка перминированнаяThermoFisher ScientificF1221Ca2+ переходное измерение глюкозы
Sigma-AldrichG8270Tyrode' s раствор
HEPESSigma-AldrichH3375Tyrode' s решение
hiPSCsСтэнфордский институт сердечно-сосудистых заболеваний iPSC Biobank
KClSigma-Aldrich529552Tyrode' s раствор
KnockOut Serum ReplacementThermoFisher Scientific10828-028hiPSC-CM посевная среда
KOH 8  MSigma-AldrichP4494Внутриклеточный пипеточный раствор
Lambda DG 4Sutter Instrument CompanyCa2+ измерение переходных процессов; сверхскоростное переключение длины волны источник света
Luna-FL автоматизированный счетчик флуоресцентных клетокWISBIOMEDLB-L20001Подсчет клеток
Maestro Pro  Система MEAAxion BiosystemsMEA
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Базальная мембранаMatrix Corning356231Внеклеточный матрикс среда
MgATPSigma-AldrichA9187Внутриклеточный раствор пипетки
MgCl2Sigma-AldrichM8266Tyrode' s solution
NaClSigma-AldrichS9888Tyrode' s решение
NaOH 10  MSigma-Aldrich72068Tyrode' s раствор
NIS Elements AR
Pluronic F-127 (20% раствор в ДМСО)ThermoFisher ScientificP3000MPCa2+ измерение переходных процессов
RPMI 1640 mediumLife Technologies11875-119hiPSC-CM культуральная среда
Sony SI8000 Система визуализации движения клетокSony BiotechnologyИзмерение сократительного движения
Sutter Съемник микропипеток SutterInstrumentsP-97Патч-зажим
Трипан синее пятноLife TechnologiesT10282Подсчет клеток

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wouters, O. J., McKee, M., Luyten, J. Estimated research and development investment needed to bring a new medicine to market, 2009-2018. Journal of the American Medical Association. 323 (9), 844-853 (2020).
  2. Pang, L., et al. Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms. Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).
  3. Mamoshina, P., Rodriguez, B., Bueno-Orovio, A. Toward a broader view of mechanisms of drug cardiotoxicity. Cell Reports Medicine. 2 (3), 100216(2021).
  4. Paik, D. T., Chandy, M., Wu, J. C. Patient and disease-specific induced pluripotent stem cells for discovery of personalized cardiovascular drugs and therapeutics. Pharmacological Reviews. 72 (1), 320-342 (2020).
  5. Kaese, S., Verheule, S. Cardiac electrophysiology in mice: a matter of size. Frontiers in Physiology. 3, 345(2012).
  6. Clark, W. A., Chizzonite, R. A., Everett, A. W., Rabinowitz, M., Zak, R. Species correlations between cardiac isomyosins. A comparison of electrophoretic and immunological properties. Journal of Biological Chemistry. 257 (10), 5449-5454 (1982).
  7. Werfel, S., et al. Characterization of circular RNAs in human, mouse, and rat hearts. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 98, 103-107 (2016).
  8. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  9. Sharma, A., et al. Derivation of highly purified cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells using small molecule-modulated differentiation and subsequent glucose starvation. Journal of Visualized Experiments. (97), e52628(2015).
  10. Itzhaki, I., et al. Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells. Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).
  11. Lan, F., et al. Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).
  12. Wu, H., et al. Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients. European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).
  13. Lee, J., et al. Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy. Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).
  14. Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).
  15. Chen, S. N., et al. Activation of PDGFRA signaling contributes to filamin C-related arrhythmogenic cardiomyopathy. Science Advances. 8 (8), (2022).
  16. Sharma, A., et al. High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells. Science Translational Medicine. 9 (377), (2017).
  17. Burridge, P. W., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes recapitulate the predilection of breast cancer patients to doxorubicin-induced cardiotoxicity. Nature Medicine. 22 (5), 547-556 (2016).
  18. Kitani, T., et al. Human-induced pluripotent stem cell model of trastuzumab-induced cardiac dysfunction in patients with breast cancer. Circulation. 139 (21), 2451-2465 (2019).
  19. Matsa, E., et al. Transcriptome profiling of patient-specific human iPSC-cardiomyocytes predicts individual drug safety and efficacy responses in vitro. Cell Stem Cell. 19 (3), 311-325 (2016).
  20. Stillitano, F., et al. Modeling susceptibility to drug-induced long QT with a panel of subject-specific induced pluripotent stem cells. Elife. 6, (2017).
  21. Zhang, J. Z., et al. Protocol to measure contraction, calcium, and action potential in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. STAR Protocols. 2 (4), 100859(2021).
  22. Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
  23. Greensmith, D. J. Ca analysis: an Excel based program for the analysis of intracellular calcium transients including multiple, simultaneous regression analysis. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 113 (1), 241-250 (2014).
  24. Ma, N., et al. Determining the pathogenicity of a genomic variant of uncertain significance using CRISPR/Cas9 and human-induced pluripotent stem cells. Circulation. 138 (23), 2666-2681 (2018).
  25. Lam, C. K., et al. Identifying the transcriptome signatures of calcium channel blockers in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 125 (2), 212-222 (2019).
  26. Seeger, T., et al. A premature termination codon mutation in MYBPC3 causes hypertrophic cardiomyopathy via chronic activation of nonsense-mediated decay. Circulation. 139 (6), 799-811 (2019).
  27. Zhang, J. Z., et al. Effects of cryopreservation on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for assessing drug safety response profiles. Stem Cell Reports. 16 (1), 168-181 (2021).
  28. Yu, B., Zhao, S. R., Yan, C. D., Zhang, M., Wu, J. C. Deconvoluting the cells of the human heart with iPSC technology: cell types, protocols, and uses. Current Cardiology Reports. 24 (5), 487-496 (2022).
  29. Thomas, D., Cunningham, N. J., Shenoy, S., Wu, J. C. Human-induced pluripotent stem cells in cardiovascular research: current approaches in cardiac differentiation, maturation strategies, and scalable production. Cardiovascular Research. 118 (1), 20-36 (2022).
  30. Zhu, R., et al. Physical developmental cues for the maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Research & Therapy. 5 (5), 117(2014).
  31. Feyen, D. A. M., et al. Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (3), 107925(2020).
  32. Gintant, G., et al. Use of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in preclinical cancer drug cardiotoxicity testing: a scientific statement from the American Heart Association. Circulation Research. 125 (10), 75-92 (2019).
  33. Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. hiPSCs Derived cardiac cells for drug and toxicity screening and disease modeling: what micro- electrode-array analyses can tell us. Cells. 8 (11), (2019).
  34. Ng, C. A., et al. High-throughput phenotyping of heteromeric human ether-a-go-go-related gene potassium channel variants can discriminate pathogenic from rare benign variants. Heart Rhythm. 17 (3), 492-500 (2020).
  35. Obergrussberger, A., Friis, S., Bruggemann, A., Fertig, N. Automated patch clamp in drug discovery: major breakthroughs and innovation in the last decade. Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (1), 1-5 (2021).
  36. Kozek, K. A., et al. High-throughput discovery of trafficking-deficient variants in the cardiac potassium channel KV11.1. Heart Rhythm. 17 (12), 2180-2189 (2020).
  37. Heyne, H. O., et al. Predicting functional effects of missense variants in voltage-gated sodium and calcium channels. Science Translational Medicine. 12 (556), (2020).
  38. Li, W., et al. Establishment of an automated patch-clamp platform for electrophysiological and pharmacological evaluation of hiPSC-CMs. Stem Cell Research. 41, 101662(2019).
  39. Li, W., Luo, X., Ulbricht, Y., Guan, K. Blebbistatin protects iPSC-CMs from hypercontraction and facilitates automated patch-clamp based electrophysiological study. Stem Cell Research. 56, 102565(2021).
  40. Milligan, C. J., Möller, C. Ion Channels: Methods and Protocols. Gamper, N. , Humana Press. 171-187 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microelectrode ArrayPatch Clamp RecordingHuman iPSC CardiomyocytesCardiac Safety AssessmentDrug Induced CardiotoxicityCalcium Transient MeasurementField Potential RecordingAction Potential RecordingWhole Cell RecordingCardiac Electrophysiology

Related Articles