Method Article

Технические применения микроэлектродных массивов и записей зажимов пластырей на кардиомиоцитах, полученных из человеческих плюрипотентных стволовых клеток

DOI:

10.3791/64265

⸱

August 4th, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 2Division of Cardiovascular Medicine, Department of Medicine, Stanford University School of Medicine, 3Department of Radiology, Stanford University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Индуцированные человеком плюрипотентные кардиомиоциты, полученные из стволовых клеток (hiPSC-CMs), стали многообещающей моделью in vitro для скрининга кардиотоксичности, вызванной лекарственными препаратами, и моделирования заболеваний. Здесь мы подробно описываем протокол измерения сократимости и электрофизиологии hiPSC-CM.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Медикаментозная кардиотоксичность является основной причиной истощения и вывода лекарств с рынка. Поэтому использование соответствующих доклинических моделей оценки сердечной безопасности является критическим шагом при разработке лекарств. В настоящее время оценка сердечной безопасности по-прежнему сильно зависит от исследований на животных. Тем не менее, животные модели страдают от плохой трансляционной специфичности для людей из-за видовых различий, особенно с точки зрения электрофизиологических характеристик сердца. Таким образом, существует острая необходимость в разработке надежной, эффективной и основанной на человеке модели доклинической оценки сердечной безопасности. Индуцированные человеком плюрипотентные кардиомиоциты, полученные из стволовых клеток (hiPSC-CMs), стали бесценной моделью in vitro для скрининга кардиотоксичности, вызванной лекарственными средствами, и моделирования заболеваний. hiPSC-CMs могут быть получены от людей с различным генетическим фоном и различными заболеваниями, что делает их идеальным суррогатом для оценки лекарственно-индуцированной кардиотоксичности индивидуально. Поэтому необходимо разработать методологии всестороннего изучения функциональных характеристик hiPSC-CM. В этом протоколе мы подробно описываем различные функциональные анализы, которые могут быть оценены на hiPSC-CM, включая измерение сократимости, потенциала поля, потенциала действия и обработки кальция. В целом, включение hiPSC-CM в доклиническую оценку сердечной безопасности может революционизировать разработку лекарств.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Разработка лекарств является длительным и дорогостоящим процессом. Исследование новых терапевтических препаратов, одобренных Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) в период с 2009 по 2018 год, показало, что средняя стоимость капитализированных исследований и клинических испытаний составила 985 миллионов долларов США за продукт1. Медикаментозная кардиотоксичность является основной причиной истощения и изъятия лекарств с рынка2. Примечательно, что кардиотоксичность сообщается среди нескольких классов терапевтических препаратов3. Поэтому оценка серд....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка носителей и решений

  1. Подготовьте поддерживающую среду hiPSC-CM, смешав бутылку объемом 10 мл добавки 50x B27 и 500 мл среды RPMI 1640. Храните среду при температуре 4 °C и используйте ее в течение месяца. Уравновешивайте среднюю температуру до комнатной температуры (RT) перед использованием.
  2. Подготовьте посадочную среду hiPSC-CM, смешав 20 мл сыворотки и 180 мл поддерживающей среды hiPSC-CM (10% разбавление, v/v). В то время как свежеприготовленная посадочная среда является предпочтительной, ее можно хранить при 4 °C не более 2 недель. Уравновешивайте среду до RT перед использованием.
  3. Готовят раствор для покр....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает, как измерить движение сжатия, потенциал поля, потенциал действия и переходный процесс Ca2+ hiPSC-CM. Принципиальная схема, включающая ферментативное пищеварение, посев клеток, поддержание и проведение функционального анализа, показана на рисунке 1. Образование монослоя hiPSC-CM необходимо для измерения движения сжатия (рисунок 2B). Репрезентативный след сжимающе-релаксационного движения hiPSC-CM показан на.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Технология iPSC человека стала мощной платформой для моделирования заболеваний и скрининга лекарств. Здесь мы описываем подробный протокол для измерения сократимости hiPSC-CM, потенциала поля, потенциала действия и переходного периода Ca2+. Этот протокол обеспечивает комплексную характеристику сократимости hiPSC-CM и электрофизиологии. Эти функциональные анализы были применены в нескольких публикациях из нашей группы 12,13,18,24,25,26,27.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

J.C.W. является соучредителем Greenstone Biosciences, но не имеет конкурирующих интересов, поскольку представленная здесь работа полностью независима. Другие авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Блейка Ву за корректуру рукописи. Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (NIH) R01 HL113006, R01 HL141371, R01 HL163680, R01 HL141851, U01FD005978 и NASA NNX16A069A (JCW), а также AHA Postdoctoral Fellowship 872244 (GMP).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Стеклянная нижняя чашка 35 мм с микролункой 20 мм #1.5 крышное стеклоCellvisD35-20-1.5-NПатч-зажим
50x B27 дополненияLife Technologies17504-044hiPSC-CM культуральная среда
6-луночная культуральная тарелкаE & K ScientificEK-27160hiPSC-CM культура
96-луночный плоский прозрачный дно черный полистирол обработанные микропланшетыCorning3603Измерение сократительного движения
AccutaseSigma-AldrichA6964Ферментативная диссоциация
Axion's Integrated Studio (AxIS)Навигаторное программное обеспечениеAxion Biosystems
Капилляры из боросиликатного стеклаГарвардский аппаратBF 100-50-10,патч-зажим
CaCl2 1 M in H2OSigma-Aldrich21115Tyrode' s
раствор Камера подсчета клеток слайдыThermoFisher ScientificC10228Подсчет клеток
CytoView 48-луночные пластины MEAAxion BiosystemsM768-tMEA-48BMEA
DMEM/F12Gibco/Life Technologies12634028Внеклеточный матрикс среда
DPBS, без кальция, без магнияFisher Scientific14-190-250
EGTASigma-AldrichE3889Раствор для внутриклеточного дозатора
EPC 10 USB  патч хомут усилительWarner Instruments89-5000патч хомут
Фура-2, АМ, ячейка перминированнаяThermoFisher ScientificF1221Ca2+ переходное измерение глюкозы
Sigma-AldrichG8270Tyrode' s раствор
HEPESSigma-AldrichH3375Tyrode' s решение
hiPSCsСтэнфордский институт сердечно-сосудистых заболеваний iPSC Biobank
KClSigma-Aldrich529552Tyrode' s раствор
KnockOut Serum ReplacementThermoFisher Scientific10828-028hiPSC-CM посевная среда
KOH 8  MSigma-AldrichP4494Внутриклеточный пипеточный раствор
Lambda DG 4Sutter Instrument CompanyCa2+ измерение переходных процессов; сверхскоростное переключение длины волны источник света
Luna-FL автоматизированный счетчик флуоресцентных клетокWISBIOMEDLB-L20001Подсчет клеток
Maestro Pro  Система MEAAxion BiosystemsMEA
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Базальная мембранаMatrix Corning356231Внеклеточный матрикс среда
MgATPSigma-AldrichA9187Внутриклеточный раствор пипетки
MgCl2Sigma-AldrichM8266Tyrode' s solution
NaClSigma-AldrichS9888Tyrode' s решение
NaOH 10  MSigma-Aldrich72068Tyrode' s раствор
NIS Elements AR
Pluronic F-127 (20% раствор в ДМСО)ThermoFisher ScientificP3000MPCa2+ измерение переходных процессов
RPMI 1640 mediumLife Technologies11875-119hiPSC-CM культуральная среда
Sony SI8000 Система визуализации движения клетокSony BiotechnologyИзмерение сократительного движения
Sutter Съемник микропипеток SutterInstrumentsP-97Патч-зажим
Трипан синее пятноLife TechnologiesT10282Подсчет клеток

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wouters, O. J., McKee, M., Luyten, J. Estimated research and development investment needed to bring a new medicine to market, 2009-2018. Journal of the American Medical Association. 323 (9), 844-853 (2020).
  2. Pang, L., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microelectrode ArrayPatch Clamp RecordingHuman iPSC CardiomyocytesCardiac Safety AssessmentDrug Induced CardiotoxicityCalcium Transient MeasurementField Potential RecordingAction Potential RecordingWhole Cell RecordingCardiac Electrophysiology

Related Articles