Method Article

Картирование абсолютной плотности ДНК в ядрах клеток с помощью микроскопии локализации одиночных молекул

DOI:

10.3791/64268

⸱

November 11th, 2025

 , 
1Institute of Molecular Biology (IMB), 2Max Planck Institute for Polymer Research

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В настоящем протоколе описан метод измерения абсолютных плотностей ДНК в адгезивных клеточных ядрах с использованием тесселяции Вороного данных микроскопии локализации одиночных молекул, известного объема, размера генома и стадии клеточного цикла.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В клеточном ядре молчащие гены обычно расположены в областях хроматина высокой плотности, называемых гетерохроматином, в то время как активные гены в основном могут быть обнаружены на границе между хроматином и интерхроматиновым пространством, называемым эухроматином. В настоящее время характеристика эу- и гетерохроматина в основном основана на эпигенетических модификациях белков-гистонов вдоль последовательности ДНК, в то время как об абсолютных плотностях ДНК в ядре клетки и их функциональном значении известно мало. Модели ядра, основанные исключительно на биохимических данных и предположениях о природе хроматина как полимера, по-прежнему принципиально отличаются от данных визуализации, полученных с помощью микроскопии высокого разрешения. Это указывает на то, что по-прежнему отсутствует важная структурно значимая информация. Мы считаем, что пространственные ограничения могут быть вовлечены в регуляцию генов, и поэтому разработали метод, который позволяет измерять абсолютную плотность ДНК в ядрах клеток млекопитающих путем преобразования данных локализации сверхвысокого разрешения в карты плотности с точностью до масштаба с помощью тесселяции Вороного.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

С первых дней клеточной биологии клеточное ядро — вместилище генетической информации — очаровывало биологов. Применив самостоятельно разработанные методы цитологического окрашивания, Эмиль Хайц в 1928 году обнаружил иные, интенсивно окрашенные участки в ядреклетки. Он называл более сильно окрашенные, плотные участки «гетерохроматином», в то время как менее сильно окрашенные, менее плотные участки он называл «эухроматином». Со временем стало очевидно, что активные гены в основном расположены в эухроматине, в то время как более плотные участки были богаты повторяющимися элементами и молчаливыми генами. Термины «гетерохроматин» и «эухроматин» сохранились до наших дней, хотя их определение изменилось со структурных на молекулярные свойства (см. ниже). Сегодня мы знаем, что клеточное ядро делится на две основные фазы. Одна жидкость (интерхроматиновый компартмент), в которой находятся ядерные тела, сплайсинговый компартмент и нуклеоплазма, а другая твердая, гидрогелеподобная хроматиновая область, которая включает в себя территории хромосом и ядрышки2. На границе раздела с интерхроматиновым пространством хроматин менее плотный, и именно здесь в основном происходят генетически активные процессы, такие как транскрипция, репликация и репарация3,4,5, в то время как рядом с пластинкой, вокруг ядрышек и вблизи центромер, хроматин демонстрирует высокий уровень уплотнения и в целом транскрипционно довольнонеактивен.

На молекулярном уровне хроматин строится из ДНК, обернутой вокруг нуклеосом (октамер основных белков-гистонов). Гистоны обладают внутренне неупорядоченными хвостовыми доменами, которые могут быть модифицированы посттрансляционно путем добавления нескольких химических групп (метил-, ацетил, фосфор-, биотин), аминокислот (аргинин) или даже белков (SUMO, убиквитин)7. Эти модификации могут быть прочитаны и притягивать другие белки (например, ремоделирующий хроматин, HP1, белки репарации, РНК) и тем самым определять физиологическое состояние последовательности ДНК (транскрипционно разрешающее/рестриктивное), не изменяя непосредственно ее последовательность (следовательно, «эпи»генетическое)7. Тип и количество модификаций вокруг определенной последовательности могут сильно различаться между типами клеток, являются обратимыми и могут меняться на протяжении развития, старения и болезни 8,9,10. Существуют модификации хвостов гистонов, которые более распространены в областях с высокой транскрибацией, и модификации, которые преобладают в областях генома, которые имеют небольшую транскрипционную активность или вообще не имеют ее.

Например, сильно транскрибируемые участки, богатые модификациями H3K4 или хвосты гистонов которых ацетилированы, обычно описываются как эухроматин, в то время как области, богатые репрессивными модификациями гистонов (H3K9me3, H3K27me3 или H4K20me3), называются гетерохроматином, который далее подразделяется на конститутивный гетерохроматин (транскрипционно неактивный во всех клетках) (например, H4K20me3) и факультативный гетерохроматин (хроматин подавляется в зависимости от типа клетки, например, H3K27me3)6. Хотя биохимические и молекулярно-биологические методы очень хорошо подходят для измерения химических изменений на уровне последовательностей, с их помощью гораздо сложнее делать заявления о пространственных свойствах в мезомасштабе с помощью этих методов.

Например, были предприняты попытки с использованием информации о близости из экспериментов Hi-C, которые обнаруживают и картируют близость ДНК между областями последовательности, для реконструкции пространственных моделей генома11. Однако прямое сравнение с изображениями с высоким разрешением, полученными в свете и электронной микроскопии, показывает, что это возможно лишь в ограниченной степени (рис. 1). Хотя такие методы, как Hi-C12, могут правильно обнаруживать территории хромосом в интерфазных клетках как отдельные объекты, эти модели довольно «близоруки», потому что близость последовательностей ДНК сама по себе слепа для отражения пространственных отношений между более отдаленными частями генома и, таким образом, не очень хорошо подходит для правильной 3D-реконструкции генома. Следовательно, разница в плотности также не может быть должным образом отражена в информации о частоте контакта. Это приводит к «спагеттифицированным» представлениям о геноме в ядре (см. рис. 1B), которые, по-видимому, происходят в виде клубка шерстяных, свободно доступных петель.

Чтобы проложить путь к интегративной, более реалистичной картине ядра, сочетающей биохимическую информацию с биофизическими и структурными данными, необходимо разработать методы, позволяющие получать данные по различным аспектам организации ядерного оружия. До недавнего времени также было трудно определить абсолютную плотность ДНК в ядрах клеток по данным визуализации. Причинами этого были ограниченное разрешение обычных световых микроскопов, проблемы в электронной микроскопии с специфическим окрашиванием ДНК и малые объемы наблюдений в электронной микроскопии.

Разрешение обычных флуоресцентных микроскопов ограничено дифракцией света. Изображение точечного источника света распространяется из-за дифракционного предела и может быть описано функцией точечного расширения (PSF). Согласно PSF, изображение флуорофора, которое в хорошем приближении можно рассматривать как точечный источник света, занимает объем определенного размера вокруг своего источника происхождения (флуорофора)13. Когда многие флуорофоры, расположенные гораздо ближе друг к другу, чем размеры их изображений, ограниченных дифракцией, возбуждаются одновременно, распределения интенсивности изображения накладываются друг на друга, и расположение отдельных флуорофоров не может быть определено. Последовательное, стохастическое излучение света от флуорофоров (мигающее) позволяет оптически изолировать отдельные молекулы и, таким образом, находить их точное местоположение, определяя интенсивность центров тяжести их сигналов.

Это может быть использовано для реконструкции структурной информации образцов путем накопления данных о локализации флуорофоров из многих записанных изображений. Этот метод обычно называют одномолекулярной локализационной микроскопией (SMLM) (для получения дополнительной информации см.14). Чем больше фотонов флуорофор испускает во время своего «включения», тем точнее можно определить интенсивность центров гравитации. Астигматические линзы на пути луча преобразуют сигналы флуорофоров выше или ниже оптической фокальной плоскости в эллипсы, которые могут быть использованы для определения их положения вдоль оптической оси. Длинные оси эллипсов, исходящих от флуоресцентных сигналов ниже фокальной плоскости, повернуты на 90° по сравнению с осями эллипсов, исходящих от флуорофоров над фокальной плоскостью. Кроме того, отношение осей этих эллипсов позволяет определить положение молекулы вдоль оптической оси относительно фокальной плоскости в диапазоне ±300 нм15.

Качество изображений со сверхвысоким разрешением, получаемых при реконструкции стохастических событий мигания, сильно зависит от плотности маркировки и количества событий мигания. Последние зависят от фотостабильности флуорофоров и количества событий мигания, прежде чем они в конечном итоге выйдут из строя (количество циклов включения/выключения). Описанный здесь метод получения изображений внутриядерного распределения ДНК со сверхвысоким разрешением называется fBALM (микроскопия локализации с флуктуацией структуры ДНК с помощью связывания-активации). Он основан на флуорофорах, которые временно интеркалируются в нуклеиновые кислоты и флуоресцируют только после того, как связываются с ДНК16,17. Благодаря заряженным остаткам фосфор-диэфирного остова ДНК является сильно отрицательно заряженным полимером. Стабилизация комплементарных нитей ДНК в живых клетках требует нейтрализации положительно заряженными белками (например, гистонами) и ионами. При снижении рН снижается стабильность комплементарной пары оснований, что позволяет интеркалирующим красителям диффундировать внутрь и наружу 16,17.

В зависимости от интеркалирующего флуоресцентного красителя, это состояние может быть достигнуто в определенном диапазоне pH. Флуоресцентные красители, такие как YoYo-1 и SYTOX Orange, флуоресцируют только тогда, когда связываются с ДНК, и поскольку интеркалирующие красители (в отличие от красителей, связывающих малую борозду ДНК, таких как Hoechst и 4',6-диамидино-2-фенилиндол [DAPI]) обычно связываются последовательно-независимым образом, они хорошо подходят для картирования распределения ДНК в ядрах клеток с помощью локализационной микроскопии.

Тесселяция Вороного – это математический метод, позволяющий разделить пространство на различные разбиения в зависимости от расположения точек. В 2D-Space размер получаемых тайлов отражает обратную плотность точек18. Поскольку локализационная микроскопия реконструирует изображения в виде набора точек, которые представляют расположение флуорофоров, тесселяция Вороного может помочь определить плотность сигналов локализации (рис. 2). Таким образом, использование ДНК-специфичного красителя в качестве флуорофора позволяет измерять плотность ДНК.

Априорные знания о содержании ДНК (числе пар оснований) и пространственной размерности ядра позволяют трансформировать относительные плотности ДНК в абсолютные плотности ДНК. Следующий протокол показывает картирование абсолютных плотностей ДНК в адгезивных клетках с использованием SMLM с очень высоким разрешением и демонстрирует, что эти плотности подвержены большим вариациям.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 3 представлен обзор рабочего процесса, описанного в этом разделе. Подробную информацию о реагентах, материалах, оборудовании и программном обеспечении, используемых в этом протоколе, см. в Таблице материалов . Код, использованный для этой публикации, можно посмотреть и скачать здесь: https://github.com/irradiator/Mapping-absolute-DNA-density-in-cell-nuclei-using-SMLM-microscopy.

1. Культура клеток

  1. Культивируйте клетки C3H10T1/2, HFB и HeLa в DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки при 37 °C во влажной атмосфере с добавлением 5%CO2. Когда клетки близки к слиянию, субкультивируйте клетки, разделяя их в соотношении 1:3 (C3H10T1/2, HFB) и 1:10 (HeLa) соответственно.
  2. За день до проведения измерений высадите клетки экспоненциально растущих культур на 35-миллиметровую решетку. Убедитесь, что смотровые чашки обеспечивают отличное оптическое качество для флуоресцентной микроскопии (стеклянное дно толщиной 170 мкм, #1,5) и имеют сетку для однозначного расположения клеток. Убедитесь также, что клетки находятся в одноклеточной суспензии и что вся поверхность чашки равномерно покрыта клетками.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать тарелки с впечатанной сеткой, чтобы еще раз найти именно те клетки, которые были отнесены к определенной стадии клеточного цикла.
  3. Если это требуется для эксперимента, добавьте 100 нМ трихостатина А (TSA) в среду для культивирования клеток и инкубируйте клетки в условиях, ранее описанных на шаге 1.1.

2. Подготовка образцов

  1. В день измерения промойте клетки один раз 1x DPBS перед фиксацией в течение 30 минут в 4% параформальдегиде (PFA) в 1x DPBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения воспроизводимых результатов убедитесь, что каждый раз готовится свежий раствор PFA, и обратите особое внимание на то, чтобы концентрация PFA была точной.
  2. После снятия фиксатора снова промойте клетки 2 раза 1x DPBS перед тем, как пропитать их в течение 20 минут в 1x DPBS, содержащем 0,4% Triton X-100.
  3. Удалите пермеабилизационный буфер с помощью пипетки и выполните дополнительный этап промывки 1x DPBS перед обработкой клеток коктейлем РНКазы (разведение 1:1000 в 1x DPBS). Поместите клетки в инкубатор на 30 минут при температуре 37 °C в увлажненную камеру.
  4. Приготовьте раствор для окрашивания, разбавив стоковый раствор SYTOX Orange, совместимый с fBALM (5 мМ в 1x DPBS при разведении 1:10 000).
  5. Удалите буфер РНКазы с помощью пипетки и примените дополнительный этап промывки 1x DPBS перед добавлением раствора для окрашивания. Инкубируйте клетки при комнатной температуре во влажной камере в течение 5 минут.
  6. Удалите окрашивающий раствор SYTOX Orange из клеток с помощью пипетки, промойте 1x DPBS и храните клетки в 1x DPBS, защищенном от интенсивного света.

3. Цитометрическое определение клеточного цикла

ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе здесь использовался инвертированный скрининговый микроскоп с высоким содержанием содержимого, но можно использовать любой автоматизированный инверсный широкопольный флуоресцентный микроскоп. Интенсивность всего ядра является мерой содержания в нем ДНК; Следовательно, убедитесь, что отверстие полностью открыто, если вы используете конфокальную систему. Воздушные объективы с низкой числовой апертурой (NA) предпочтительнее масляных иммерсионных объективов.

  1. Поместите чашку с клетками на инверсный флуоресцентный микроскоп, оснащенный моторизованным столиком и программным обеспечением, позволяющим реконструировать большие участки на образце путем сшивания автоматически записанных изображений.
  2. Выберите линзу объектива, которая позволяет регистрировать достаточное количество клеток в поле зрения (всего не менее 900 одиночных ядер [подробнее см. Roukos et al.19]), чтобы получение изображений для определения клеточного цикла могло быть выполнено в разумные сроки. Используйте линзу, которая не показывает больших различий в интенсивности между центром и границами. Если такой объектив недоступен, примените к изображениям коррекцию плоского поля (см. шаг 7). Чтобы следовать этому протоколу, используйте широкоугольный флуоресцентный микроскоп, оснащенный 20-кратной воздушной линзой NA 0,4 с глубиной резкости = 8 мкм.
  3. Во время получения изображения закройте центральную область чашки с помощью фильтров, соответствующих используемому флуорофору. Делайте снимки в светлом поле в режиме проходящего света.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения светлого поля важны для перемещения ячеек на сетке на шаге 4.6.
  4. Поместите тарелку с ячейками в холодильник при температуре 4 °C до шага 4.4.
  5. Реконструируйте отсканированную область по отдельным изображениям, объединив записанные отдельные изображения.
  6. Перенесите данные изображения флуоресцентного окрашивания ДНК на компьютер с программным обеспечением с открытым исходным кодом CellProfiler4.2.120.
  7. Если необходима коррекция флуоресцентных изображений в плоском поле, сгенерируйте эталонное изображение используемого микроскопа на основе записанных изображений. Откройте конвейер Illumination Correction.cpproj (включен в качестве дополнительного файла 1); Обратите внимание, что конвейер отображается на экране в виде последовательности, в которой можно щелкать различные шаги. Перетащите изображения в указанное поле на первом шаге Изображения конвейера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что вы исключите все данные, не относящиеся к изображениям, в перечисленных файлах, используя параметры фильтра в нижней части окна.
  8. На последнем шаге конвейера коррекции освещенности нажмите « Сохранить изображения », чтобы определить место, где будут храниться эталонные изображения, а затем нажмите кнопку «Проанализировать изображения ».
  9. Откройте конвейер CellCycleAnalysis.cpproj (включен в качестве дополнительного файла 2). Перетащите изображения, записанные на шаге 3.3 (см. рисунок 4A в качестве примера), включая эталонное изображение (шаг 3.8), в специальное поле на первом шаге Изображения конвейера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что вы исключите все данные, не относящиеся к изображениям, в перечисленных файлах, используя параметры фильтра в нижней части окна.
  10. На шаге CorrectIlluminationApply конвейера выберите эталонное изображение в раскрывающемся меню, выбрав функцию Select the Illumination.
  11. На последнем шаге конвейера анализа клеточного цикла определите место, где было сохранено эталонное изображение на шаге 3.7, и нажмите кнопку «Проанализировать изображения », чтобы начать массовое измерение интегральных интенсивностей флуоресценции всех ядер в изображениях, записанных на шаге 3.3.
    ПРИМЕЧАНИЕ: CellProfiler4.2.1 сгенерирует текстовый файл "CellCycleAnalysis_Nuclei.txt", который содержит данные каждого измеренного ядра (Image, ObjectID, интенсивность интегрированной флуоресценции, координаты изображения) в формате CSV.
  12. Убедитесь, что элемент DisplayHistogram конвейера отмечен как активный.
  13. Обратите внимание на интегрированные интенсивности флуоресценции на гистограмме для пиков G1 и G2 (см. рис. 4B в качестве примера) и введите интервалы вокруг них в элементы конвейера FilteredObjects . Активируйте элементы конвейера, нажав на флажки.
  14. Активируйте соответствующие элементы конвейера DisplayDataOnImage , чтобы создать изображение, выделяющее ячейки в фазе G1 или G2 , и запустите конвейер снова (см. пример на рисунке 4C ).
  15. Выберите до пяти клеток, представляющих желаемую фазу клеточного цикла из сгенерированного изображения в отмеченной области камеры наблюдения, и попробуйте переместить клетки на микроскопе SMLM.
    Примечание: Поскольку здесь используются две клеточные линии с неизвестным размером генома, размеры генома были определены путем сравнения пиков G1 клеточной линии фибробластов человека с пиками G1 клеток HeLa и C3H10T1/2. Гистограммы и пропорциональное соотношение между размерами их генома можно посмотреть на дополнительном рисунке S1.

4. СМЛМ-фБАЛЬЗАМ

Примечание: Хотя чистая сумма кислорода в этих комбинированных биохимических реакциях равна нулю, рекомендуется проводить реакцию в негерметичной посуде, так как ограниченные концентрации кислорода могут замедлить выработку D-глюконо-1,5-лактона. Увеличение концентрации D-глюконо-1,5-лактона постепенно снижает pH, что необходимо, поскольку немедленное снижение pH изменяет ультраструктуру образца.

  1. Приготовьте 1 мл буфера для визуализации, смешав следующие ингредиенты: 900 мкл глюкозы (1 г/мл глюкозы в 1x DPBS), 50 мкл глюкозооксидазы (0,5 мг/мл в 1x DPBS) и 50 мкл каталазы (40 мкг/мл в 1x DPBS).
  2. Извлеките 1x DPBS из образца с помощью пипетки и добавьте 1 мл буфера для визуализации в чашку, содержащую клетки.
  3. Установите чашку на предметный столик микроскопа с поддержкой SMLM. Используйте объектив с высоким NA объективом и большим оптическим увеличением.
  4. Найдите одно из выбранных ядер (из шага 3.15) с помощью системы координат тарелки и центрируйте его в поле зрения камеры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ферментативная реакция занимает ~60-180 минут до тех пор, пока не будет достигнут правильный pH для метода fBALM, что будет способствовать соответствующему миганию. Рекомендуется как можно скорее установить смотровую чашку, чтобы обеспечить достаточное время для адаптации образца к температуре прибора, поскольку изменения температуры могут привести к осевому дрейфу. Убедитесь, что температура в помещении, в котором находится микроскоп SMLM, стабильна на протяжении всего измерения.
  5. Определите высоту ядра, изменив фокус с помощью z-привода микроскопа и записав положение верхнего и нижнего пределов.
  6. В разные моменты времени проверяйте правильность мигания, производимого процессом fBALM, увеличивая мощность лазера. Как только образец покажет правильное стохастическое мигание, начните получение серии изображений, необходимой для реконструкции SMLM со сверхвысоким разрешением.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Микроскоп, используемый для fBALM, должен быть оснащен возбуждающими лазерами, подходящими для возбуждения используемого флуорофора и способными генерировать достаточно высокую плотность фотонов для обеспечения достаточного количества фотонов на кадр. Проверьте это в пилотном эксперименте перед всеми остальными экспериментами.
  7. После того, как процесс fBALM будет обеспечен в правильном мигании, начните получение серии изображений с выдержкой 50 мс, что приведет к частоте кадров ~20 кадров в секунду.
  8. Проведите z-стек через ядро (около среднего сечения) с интервалом 200 нм и всего 500 кадров на световой оптический участок. Вернитесь к средней части, сделайте серию изображений из 50 000 кадров, чтобы собрать достаточное количество мигающих событий для хорошей реконструкции структурных деталей с высокой точностью локализации (это займет ~45 минут).
    Примечание: z-стек важен для определения доли сигнала ДНК в среднем участке по отношению ко всему ядру. Убедитесь, что эффективный размер пикселя хорошо подходит для SMLM22 и сигнал на камере не насыщает сенсор.
  9. Убедитесь, что выполнены следующие требования
    1. Убедитесь, что компьютер сбора данных содержит достаточно места на диске, так как в зависимости от количества и размера 16-разрядных образов размеры файлов стеков изображений могут стать довольно большими.
    2. Убедитесь, что компьютер, на котором установлено программное обеспечение для сбора данных, может работать с файловой системой на используемом устройстве хранения данных, способной обрабатывать файлы большого размера (>4 ГБ), и что скорость передачи данных на устройство хранения достаточна для записи файлов в режиме реального времени при непосредственной записи данных изображения на устройство хранения.
    3. При сохранении данных после получения изображения убедитесь, что компьютер оснащен достаточным объемом оперативной памяти (например, 64 ГБ).

5. Подготовка и запись чашки с флуоресцентными шариками для z-калибровки микроскопа SMLM

ПРИМЕЧАНИЕ: Для правильной осевой калибровки астигматических линз микроскопа для назначения правильных мест вдоль оптической оси следует учитывать запись z-стеков флуоресцентных шариков с длиной волны 100 нм.

  1. Разбавьте гранулы 1:10 000 в 1x DPBS и засейте гранулы 100 нм на чашку того же типа, которая использовалась для измерений SMLM.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте только лучшее оптическое качество и технические характеристики, такие как покровные накладки #1.5.
  2. Установите калибровочную чашку на микроскоп; Записывайте изображения в фокальную плоскость бусин (всего ~1,5 мкм; здесь используется шаг 10 нм)15.
  3. Передайте данные на компьютер для анализа данных.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не храните и не используйте калибровочные стекла в течение длительного времени.

6. Обработка данных SMLM

ПРИМЕЧАНИЕ: Для регистрации локализаций использовался плагин ImageJ23 "ThunderSTORM"24 (например, преобразование мигающих пятен в стеке изображений в список, содержащий координаты локализации, номер кадра и т.д.). ImageJ или Fiji25 работает на всех основных настольных операционных системах (Linux/Windows/macOS) и может быть загружен и использован бесплатно.

  1. Чтобы использовать ThunderSTORM в FijI, обязательно добавьте сайт обновлений лаборатории Хольбейна в раздел СПРАВКА | Обновление | Управляйте сайтами обновления, установите флажок для лаборатории Холбейна и перезапустите Fiji. Убедитесь, что программа имеет доступ к достаточному объему памяти.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Данные изображения должны быть в формате файла, который может быть прочитан ImageJ/Fiji. При записи данных в стандартную коммерческую систему откройте данные непосредственно с помощью плагина Bio-Formats для ImageJ (который автоматически поставляется с Fiji). В данном случае скрипт MATLAB h52tif.m (предоставленный на странице GitHub, упомянутой в начале протокола) был использован для преобразования данных, записанных нашей пользовательской установкой, из формата hdf5 в формат TIFF.
    1. В зависимости от объема памяти, доступной в используемой системе, и количества записываемых кадров разделите данные на несколько сабстеков, чтобы избежать нехватки памяти.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В дальнейшем используются настройки, которые использовались для извлечения данных, показанных в разделе результатов. Для более подробного объяснения настроек ThunderSTORM обратитесь к руководствам по ThunderSTORM, которые можно найти в Интернете.
  2. Оптимизируйте настройки для обнаружения мигающих сигналов, адаптировав настройки ThunderSTORM в соответствии с желаемыми условиями записи. Нажмите на ThunderSTORM | Запустите Analysis, выберите Camera Setup (Настройка камеры ) и введите правильный размер изображения в пикселях , количество A/D, квантовую эффективность используемой камеры, базовый уровень и EM-усиление (для этой настройки размер пикселя: 65 нм, A/D (Количество A/D): 0,64, квантовая эффективность: 0,8).
  3. Далее выберите алгоритм определения координат локализации путем подгонки мигающих сигналов. В разделе «Фильтрация изображений » используйте вейвлет-фильтр (B-Spline) с порядком B-Spline 3 и масштабом B-Spline 2.0. Для остальных настроек установите метод Приблизительная локализация молекул на Локальный максимум, Порог пиковой интенсивности на 2*std(Wave.F1) и Связность на 8-окрестность. В разделе Субпиксельная локализация молекул выберите PSF: Интегрированный Гауссов, Радиус аппроксимации [px]: 3, Метод аппроксимации: Максимальное правдоподобие и Начальная сигма [px]: 1.6.
  4. Запустите плагин, чтобы создать таблицу, содержащую запись для каждой обнаруженной локализации и ее свойства. Сохраните таблицу на жесткий диск.
  5. Если необходимо проанализировать несколько стеков изображений или разделить их на несколько стеков (например, для анализа больших наборов данных или если на компьютере для анализа данных недостаточно памяти), автоматизируйте обнаружение локализации с помощью макроса.
  6. Если данные сбора данных должны быть разделены на несколько стеков изображений, объедините таблицы локализации в ThunderSTORM, импортируя один файл за другим. Убедитесь, что параметр «Добавить в текущую таблицу» в меню «Импорт » активирован и что используется правильный начальный номер, чтобы избежать перезаписи локализаций в таблице.
  7. После создания полной таблицы локализации проверьте результат, восстановив изображение из местоположений в таблице результатов. Нажмите кнопку «Визуализация » в окне результатов ThunderSTORM и дождитесь появления восстановленного изображения (например, гистограммы локализаций).
  8. Проверьте восстановленное изображение на наличие таких проблем, как боковой дрейф и другие артефакты изображения. Измерьте и исправьте дрейф в подменю «Дрейф », определив взаимную корреляцию суммированных подразделов стека данных (используется здесь) или используя реперные маркеры в выборке. После нажатия на меню >> введите 5 бинов и коэффициент увеличения (6,5 в этом протоколе). Подождите, пока не появится окно, показывающее дрейф по осям x и y.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Первые изображения после записи могут по-прежнему страдать от сильной фоновой флуоресценции (при переводе флуорофоров в темное состояние); следовательно, может потребоваться исключить из анализа первые пару сотен изображений (например, введите «кадр >500» в поле «Фильтр » в главном окне ThunderSTORM).
  9. Чтобы избежать пересчета сигналов, видимых на протяжении нескольких последовательных кадров, примените слияние к данным локализации с использованием радиуса, учитывающего среднюю точность локализации (в данном случае 20 нм), 1 темный кадр и 0 максимальных кадров (без ограничений на максимальное время включения молекулы).
  10. Если необходимо проанализировать только тонкий световой оптический ультратонкий срез, исключите из набора данных все локализации выше и ниже фокальной плоскости. Сначала найдите точку в z, которая содержит наибольшую локализацию, нажав Построить гистограмму в окне с таблицей результатов, а затем отбросьте локализации на 50 нм выше и ниже этой точки с помощью команды фильтрации:
    z > "пик гистограммы" - 50 & z < "пик гистограммы" + 50
  11. Для определения доли ДНК в записанном участке определите локализации в каждой плоскости стека изображений (толщина 200 нм; 100 нм с каждой стороны), записанных на шаге 4.7.1. Откройте первую таблицу результатов локализации стека, выбрав плагины | Гроза | Импорт/экспорт | Импортируйте результаты и отфильтруйте каждый записанный срез до 200 нм. Для этого нажмите на кнопку «Применить » после ввода в поле фильтра:
    z > -100 и z < 100
  12. Нажмите « Визуализация» и выберите опцию «Гистограммы », чтобы сгенерировать изображение каждого среза. Сохраните полученное изображение в папке в формате TIFF. Закройте все открытые изображения. Повторите это для всех плоскостей изображения.
  13. Откройте все фрагменты и объедините их с помощью Изображение | Стеки | Изображения для стопки. Выбрать изображение | Стеки | Z-Project и выберите опцию «Сумма ». Откройте диспетчер ROI в ImageJ (Анализ | Инструменты | ROI-менеджер); затем выберите инструмент «Выделение многоугольника » на панели инструментов ImageJ в главном окне ImageJ и обведите контуром ядро. Нажмите на кнопку «Добавить » в ROI-менеджере.
    1. Нажмите на «Анализ» | Задайте Измерения и выберите Интегрированная плотность. Нажмите на «Анализ» | Измерьте. В ThunderSTORM откройте таблицу результатов центральной плоскости, как описано выше, и отфильтруйте ее до толщины 100 нм, используя следующую команду в поле фильтра:
      z > -50 и z < 50
  14. Сгенерируйте гистограмму отфильтрованных локализаций, как описано выше, активируйте определенный ROI, выбрав его в Менеджере ROI и нажмите на кнопку Анализ | Измерьте.
  15. Определите долю локализаций в промежуточном срезе толщиной 100 нм относительно общего числа локализаций путем деления измеренных интегральных плотностей - коэффициента преобразования, необходимого на шаге 8.2 для расчета абсолютной плотности ДНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Содержание ДНК пропорционально количеству локализаций. Таким образом, для оценки доли ДНК в визуализируемом изображении со сверхвысоким разрешением (среднем срезе) достаточно определить общее число локализаций по всему объему всего ядра и определить общее число локализаций в интересующем участке. Это может быть достигнуто путем создания 2D-гистограмм локализаций.

7. Z-калибровка микроскопа SMLM

  1. Откройте стопки изображений, записанные в разделе 5 на Фиджи.
  2. В меню плагина ThunderSTORM выберите подменю 3D-калибровки | Калибровка цилиндрического объектива.
  3. Введите размер шага , используемого для записи данных калибровки (10 нм), и определите область стека изображений , которая будет использоваться для калибровки.
  4. Укажите место для сохранения файла калибровки.
  5. Используйте данные калибровки в диалоговом окне «Выполнить анализ », выбрав PSF: Эллиптический гауссов (3D-астигматизм) на панели «Субпиксельная локализация молекул» и настроив путь к файлу калибровки, созданному в разделе 5.

8. Тесселяция Вороного

ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как таблица локализации создана и обработана, переходите к последнему этапу анализа изображения - тесселяции Вороного. Используйте для этого шага MATLAB 2021; скрипты MATLAB являются частью программного пакета "Localization Analyzer for Nanoscale Distributions" (LAND) и могут быть загружены по ссылкам в Таблице материалов. Подобно записи данных и созданию таблицы локализации, важно использовать систему, которая хорошо оснащена памятью и вычислительной мощностью. Система, используемая для генерации изображений для этой публикации, была оснащена 128 ГБ оперативной памяти и 9-ядерным процессором Intel i9.

  1. Преобразуйте таблицу локализации ThunderSTORM из формата .csv в формат Orte , запустив скрипт MATLAB "TS2Orte.m", который преобразует таблицу локализации в матрицу MATLAB и сохраняет ее в формате ".mat".
  2. После того, как данные будут в правильном формате, начните подготовку к тесселяции Вороного и расчету плотности ДНК. Рассчитайте коэффициент пересчета, разделив число пар оснований в ядре на относительное число локализаций в визуализируемом участке по отношению к объему (см. шаг 6.15). Заходим в папку LAND-Voronoi и в подпапке /coreAlgorithm открываем файл voronoiCluster.m и настраиваем коэффициент преобразования для расчетов абсолютной плотности в строке 13.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 5 приведен пример ядра G1 HeLa; Коэффициент пересчета составил 265.
  3. Отредактируйте скрипт, запускающий анализ "VonoRoi.m". Настройте путь к данным локализации Orte и выходную папку для файлов результатов. В списке координат укажите координаты, определяющие область, в которой должна быть выполнена тесселяция. Поскольку вычисление тесселяции Вороного может занять много времени (в зависимости от характеристик используемого компьютера), определите несколько областей для вычисления в одном входном наборе данных.
  4. После запуска скрипта найдите изображение, показывающее абсолютную плотность ДНК, вместе с другими файлами, содержащими графики, показывающие гистограмму распределения площади, и файл "densities.mat", содержащий плотности каждой отдельной рассчитанной ячейки Вороного в выходной папке.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ядро HeLa, показанное на рисунке 5 , было выбрано из таблицы, сгенерированной CellProfiler4.2.1 в разделе 3, чтобы иметь интегральную интенсивность флуоресценции, близкую к первому пику на гистограмме, показанной на рисунке 5 , которая представляет ядра в фазе G1 . Учитывая его небольшой размер и ярко выраженную внутреннюю структуру, вероятно, это раннее ядроG1 , которое все еще находится в процессе деконде...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье описывается, как измерить абсолютную плотность ДНК в ядрах клеток млекопитающих с помощью SMLM. Кроме того, мы продемонстрировали, как определить стадию клеточного цикла культивируемых клеток и как использовать эту информацию для оценки количества ДНК, присутствующей в легком оптическом ультратонком срезе. Также подробно описаны подготовка адгезивных клеток к микроскопии fBALM SMLM и способы обработки данных SMLM для получения микроскопических изображений геномной ДНК в ядр...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим д-ра Сандру Ритц за предоставленную нам возможность использовать IMB Imaging Core Facility, д-ра Ши-Я Чен за то, что позволила нам использовать ее специально изготовленный микроскоп SMLM, д-ра Леонарда Куббена (IMB) за предоставление человеческих фибробластов, д-ра Кристофа Нерса (Christof Niehrs) (IMB) за предоставление клеточной линии C3H10T1/2 и д-ра Яна Неймана за MATLAB-Script, который мы модифицировали для этой работы. Мы также хотим поблагодарить д-ра Марион Кремер, д-ра Томаса Кремера и д-ра Кристофа Кремера за плодотворные дискуссии.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<Сильная>Клеточная культура
µ-Чашка 35 мм, высокое стеклянное дно Grid-500Ибиди81168
C3H 10T1/2IMB (Лаборатория Ниера)
DMEMThermoFisher12320032
dPBSThermoFisher14190144
FBSЖизненные технологии16000-044
HeLaМикроскопический центр (IMB)
HFBIMB (лаборатория Куббена)
L-глутаминСигма-ОлдричG7513
Незаменительные аминокислоты и витамины для HFB
Пируват натрияS8636
Sample Prep
КаталазыМерк2593710
ГлюкозаThermoFisher241922500
ГлюкозооксидазаМерк49180
ПараформальдегидСигма-Олдрич158127
Коктейль RNaseThermoFisherAM2286
SYTOX OrangeThermoFisherS11368
Комплект для пробообразования флуоресцентных микросфер TetraSpeckThermoFisherT7284
Triton X-100ThermoFisher327372500
<Сильный>Софт
BioFormatsOpenMicroscopy.orgОткрытое программное обеспечение https://www.openmicroscopy.org/bio-formats/
CellProfiler v4.2.1CellProfiler.orgОткрытое программное обеспечение https://cellprofiler.org
Фиджиnih.govПрограммное обеспечение с открытым исходным кодом https://imagej.net/software/fiji/?Downloads
ЗЕМЛЯnih.govПрограммное обеспечение с открытым исходным кодом https://github.com/Jan-NM/LAND
MatLab 2021Math Worksкоммерческое программное обеспечение — требуется «Набор инструментов обработки изображений»
R v.4.. 0.3r-project.orgОткрытое программное обеспечение https://www.r-project.org
ThunderSTORM v1.3Программное обеспечение с открытым исходным кодом https://zitmen.github.io/thunderstorm/
Microscopes:
AF 7000Leica
Leica GSDLeica
Микроскоп SMLMЛаборатория КремераИзготовлен на заказ доктором С-Й. Чен

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Passarge, E. Emil Heitz and the concept of heterochromatin: longitudinal chromosome differentiation was recognized fifty years ago. American Journal of Human Genetics. 31 (2), 106-115 (1979).
  2. Cremer, T., Cremer, M. Chromosome territories. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (3), 003889(2010).
  3. Vecchio, L., Solimando, L., Biggiogera, M., Fakan, S. Use of halogenated precursors for simultaneous DNA and RNA detection by means of immunoelectron and immunofluorescence microscopy. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (1), 45-55 (2008).
  4. Solimando, L., et al. Spatial organization of nucleotide excision repair proteins after UV-induced DNA damage in the human cell nucleus. Journal of Cell Science. 122, 83-91 (2009).
  5. Niedojadlo, J., et al. Transcribed DNA is preferentially located in the perichromatin region of mammalian cell nuclei. Experimental Cell Research. 317 (4), 433-444 (2011).
  6. Padeken, J., Heun, P. Nucleolus and nuclear periphery: velcro for heterochromatin. Current Opinion in Cell Biology. 28, 54-60 (2014).
  7. Zhang, Y., et al. Overview of histone modification. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1283, 1-16 (2021).
  8. Ilango, S., Paital, B., Jayachandran, P., Padma, P. R., Nirmaladevi, R. Epigenetic alterations in cancer. Frontiers in Bioscience (Landmark Ed). 25 (6), 1058-1109 (2020).
  9. Saul, D., Kosinsky, R. L. Epigenetics of aging and aging-associated diseases). International Journal of Molecular Sciences. 22 (1), 401(2021).
  10. Eckersley-Maslin, M. A., Alda-Catalinas, C., Reik, W. Dynamics of the epigenetic landscape during the maternal-to-zygotic transition. Nature Reviews, Molecular Cell Biology. 19 (7), 436-450 (2018).
  11. Stevens, T. J., et al. 3D structures of individual mammalian genomes studied by single-cell Hi-C. Nature. 544 (7648), 59-64 (2017).
  12. Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
  13. Cremer, C., Masters, B. R. Resolution enhancement techniques in microscopy. The European Physical Journal H. 38 (3), 281-344 (2013).
  14. Lelek, M., et al. Single-molecule localization microscopy. Nature Reviews Methods Primers. 1 (1), 39(2021).
  15. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
  16. Szczurek, A., et al. Super-resolution binding activated localization microscopy through reversible change of DNA conformation. Nucleus. 9 (1), 182-189 (2018).
  17. Szczurek, A., et al. Imaging chromatin nanostructure with binding-activated localization microscopy based on DNA structure fluctuations. Nucleic Acids Research. 45 (8), 56(2017).
  18. Levet, F., et al. SR-Tesseler: a method to segment and quantify localization-based super-resolution microscopy data. Nature Methods. 12 (11), 1065-1071 (2015).
  19. Roukos, V., Pegoraro, G., Voss, T. C., Misteli, T. Cell cycle staging of individual cells by fluorescence microscopy. Nature Protocols. 10 (2), 334-348 (2015).
  20. Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433(2021).
  21. Team, R. C. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , (2016).
  22. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).
  23. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  24. Ovesny, M., Krizek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
  25. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  26. Maeshima, K., et al. The physical size of transcription factors is key to transcriptional regulation in chromatin domains. Journal of Physics. Condensed Matter. 27 (6), 064116(2015).
  27. Itoh, Y., Woods, E. J., Minami, K., Maeshima, K., Collepardo-Guevara, R. Liquid-like chromatin in the cell: What can we learn from imaging and computational modeling. Current Opinion in Structural Biology. 71, 123-135 (2021).
  28. Strickfaden, H., Xu, Z. Z., Hendzel, M. J. Visualization of miniSOG tagged DNA repair proteins in combination with Electron Spectroscopic Imaging (ESI). Journal of Visualized Experiments. (103), e52893(2015).
  29. Xie, L., et al. BRD2 compartmentalizes the accessible genome. Nature Genetics. 54 (4), 481-491 (2022).
  30. Heo, S. J., et al. Nuclear softening expedites interstitial cell migration in fibrous networks and dense connective tissues. Science Advances. 6 (25), (2020).
  31. Gelléri, M., et al. True-to-scale DNA-density maps correlate with major accessibility differences between active and inactive chromatin. bioRxiv. , (2022).
  32. Derenzini, M., Olins, A. L., Olins, D. E. Chromatin structure in situ: the contribution of DNA ultrastructural cytochemistry. European Journal of Histochemistry. 58 (1), 2307(2014).
  33. Cremer, T., et al. The 4D nucleome: Evidence for a dynamic nuclear landscape based on co-aligned active and inactive nuclear compartments. FEBS Letters. 589, 2931-2943 (2015).
  34. Shah, F. A., Johansson, B. R., Thomsen, P., Palmquist, A. Ultrastructural evaluation of shrinkage artefacts induced by fixatives and embedding resins on osteocyte processes and pericellular space dimensions. Journal of Biomedical Materials Research A. 103 (4), 1565-1576 (2015).
  35. Gavelis, G. S., et al. Dinoflagellate nucleus contains an extensive endomembrane network, the nuclear net. Scientific Reports. 9 (1), 839(2019).
  36. Rouquette, J., et al. Revealing the high-resolution three-dimensional network of chromatin and interchromatin space: a novel electron-microscopic approach to reconstructing nuclear architecture. Chromosome Research. 17 (6), 801-810 (2009).
  37. Gorisch, S. M., Richter, K., Scheuermann, M. O., Herrmann, H., Lichter, P. Diffusion-limited compartmentalization of mammalian cell nuclei assessed by microinjected macromolecules. Experimental Cell Research. 289 (2), 282-294 (2003).
  38. Lenart, P., et al. Nuclear envelope breakdown in starfish oocytes proceeds by partial NPC disassembly followed by a rapidly spreading fenestration of nuclear membranes. The Journal of Cell Biology. 160 (7), 1055-1068 (2003).
  39. Verschure, P. J., et al. Condensed chromatin domains in the mammalian nucleus are accessible to large macromolecules. EMBO Reports. 4 (9), 861-866 (2003).
  40. Strickfaden, H., et al. Condensed chromatin behaves like a solid on the mesoscale in vitro and in living cells. Cell. 183 (7), 1772-1784 (2020).
  41. Lin, Y. R., et al. M33 condenses chromatin through nuclear body formation and methylation of both histone H3 lysine 9 and lysine 27. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1868 (11), 119100(2021).
  42. Strickfaden, H., Sharma, A. K., Hendzel, M. J. A charge-dependent phase transition determines interphase chromatin organization. bioRxiv. , (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

DNA Density MappingCell NucleiSingle Molecule LocalizationSuper Resolution MicroscopyChromatin StructureVoronoi TessellationFPALM ImagingEpigenetic ModificationsCell Cycle StagesHeterochromatin Euchromatin

Related Articles