Количественное измерение миграции и инвазии опухолевых клеток в режиме реального времени после синтетической трансфекции мРНК

Подвижность опухолевых клеток играет решающую роль в метастазировании ^1,2. Распространение опухолевых клеток на соседние и отдаленные здоровые ткани затрудняет лечение рака и способствует рецидиву ^3,4. Поэтому важно понимать механизмы подвижности опухолевых клеток и разрабатывать соответствующие терапевтические стратегии. Поскольку многие опухолевые клетки имеют измененные профили экспрессии генов, крайне важно понять, какие изменения в профиле экспрессии генов приводят к изменению подвижности опухолевых клеток ^5,6.

Было разработано несколько тестов для измерения миграции клеток in vitro. Некоторые анализы предоставляют только ограниченную информацию из-за того, что позволяют проводить измерения только в определенные моменты времени, в то время как другие предоставляют исчерпывающую информацию о подвижности опухолевых клеток в режиме реального времени⁷. Несмотря на то, что многие из этих анализов подвижности клеток могут дать количественные результаты в данный момент времени или в конечной точке, они не могут предоставить достаточно подробную информацию о динамических изменениях скорости миграции клеток в течение экспериментального периода. Кроме того, может быть трудно изучить потенциальные изменения скорости миграции клеток в зависимости от дизайна эксперимента, типов и количества клеток. Кроме того, эффекты неосложненного лечения могут быть исследованы с помощью простой количественной оценки традиционных анализов подвижности, но для изучения комплексных эффектов различных комбинированных методов лечения может потребоваться более сложная количественная оценка⁸.

Разработан прибор для контроля электрического тока микротитровой пластины на дне лунки, покрытой микроэлектродами⁹. Адгезия ячеек к поверхности лунки затрудняет поток электронов, а импеданс коррелирует с количественным и качественным связыванием клеток. Наличие микроэлектродов на дне скважины позволяет измерять адгезию, распространение и пролиферацию клеток. Наличие микроэлектродов под микропористой мембраной верхней камеры позволяет измерять миграцию клеток и инвазию в нижнюю камеру, при этом верхняя камера покрыта белками внеклеточного матрикса (ECM) для обеспечения инвазии¹⁰.

Ранее было продемонстрировано, что импедансные измерения миграции и инвазии опухолевых клеток в режиме реального времени позволяют получать данные в режиме реального времени в течение всего эксперимента, а также мгновенные сравнения и количественные оценки в различных экспериментальных условиях¹¹. В этой методической работе нокдаун генов был индуцирован для проверки роли интересующих белков в миграции и инвазии опухолевых клеток. Поскольку полномасштабный эффект нокдауна генов в тестируемых экспериментальных условиях происходил через 3-4 дня после электропорации с малыми интерферирующими РНК (миРНК)⁸, клетки переделывали после электропорации и повторно собирали через 3 дня для измерения миграции и инвазии опухолевых клеток в режиме реального времени на основе импеданса.

CT10 регулятор киназы (Crk) и Crk-подобный (CrkL) представляют собой адапторные белки, которые опосредуют белок-белковые взаимодействия после различных путей рецептор-киназы факторов роста и нерецепторных путей тирозинкиназы¹². Повышенные уровни белков Crk и CrkL способствуют плохому прогнозу при нескольких видах рака человека, включая глиобластому¹³. Однако неясно, как повышенное содержание белков Crk и CrkL приводит к неблагоприятному прогнозу. Поэтому важно определить влияние гиперэкспрессии Crk и CrkL на функции опухолевых клеток. Ранее было проведено исследование нокдауна генов, чтобы продемонстрировать, что эндогенные уровни белков Crk и CrkL необходимы для миграции и инвазии клеток глиобластомы⁸. Здесь была разработана модифицированная система анализа для изучения влияния гиперэкспрессии Crk и CrkL на миграцию и инвазию опухолевых клеток.

В последнее время синтез мРНК in vitro и его терапевтическое применение вновь привлекли внимание в связи с разработкой мРНК-вакцин против SARS-CoV-2 (обзор Verbeke et ^al.14). Кроме того, были достигнуты значительные успехи в использовании синтетической мРНК при раке и других заболеваниях^15,16. Электропорация клеток является эффективным методом доставки синтетической мРНК и индуцирования транзиторной генетической модификации (рассмотрено Campillo-Davo et ^al.17), а использование синтетической мРНК обеспечивает быструю и эффективную экспрессию генов в иммортализированных фибробластах¹⁸. Этот метод сочетает в себе гиперэкспрессию генов с использованием синтетической мРНК с клеточным анализом в режиме реального времени для изучения миграции и инвазии опухолевых клеток. Однако экспериментальная схема, используемая для миРНК, не работает с трансфекцией синтетической мРНК, так как уровень экзогенных белков быстро возрастает и постепенно снижается при трансфекции синтетической мРНК¹⁸. Поэтому метод был модифицирован для проведения анализа миграции и инвазии клеток в режиме реального времени сразу после трансфекции без дополнительного культивирования клеток.

В этом методологическом документе показано, что сочетание измерений в реальном времени на основе импеданса с трансфекцией опухолевых клеток синтетическими мРНК обеспечивает быстрый и всесторонний анализ влияния регуляции генов на миграцию и инвазию опухолевых клеток. В данной методологической статье подробно описаны процедуры измерения влияния гиперэкспрессии Crk и CrkL на миграцию и инвазию клеток глиобластомы. Изучая концентрационно-зависимое влияние синтетической мРНК на миграцию опухолевых клеток, в статье четко описывается, как повышение уровня белка стимулирует миграцию опухолевых клеток. Кроме того, представлен подход варьирования концентрации геля ECM для оценки влияния изменений экспрессии генов на инвазию опухолевых клеток.

1. Синтез мРНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Для синтеза мРНК все реагенты и оборудование должны быть специально обработаны для инактивации РНКаз перед использованием. Подробные сведения обо всех материалах, инструментах и реагентах, используемых в этом протоколе, см. в таблице материалов .

1. Линеаризация ДНК
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мышиные кДНК CrkI и CrkL клонировали в вектор экспрессии pFLAG-CMV-5a для добавления эпитопной метки FLAG на С-конце и субклонировали в вектор pcDNA3.1/myc-His для включения промотора T7, как описано ранее^18,19.
   1. Добавьте 10 мкл 10-кратного реакционного буфера, 1,5 мкл PmeI (10 000 ед/мл) и 10 мкг плазмидной ДНК в микроцентрифужную пробирку для линеаризации плазмидной ДНК с ферментом рестрикции. Добавьте воду, не содержащую нуклеаз, чтобы довести объем реакции до 100 мкл.
   2. Перемешайте постукиванием, отжмите и инкубируйте реакционную смесь при 37 °C в течение ночи.
   3. Отжим и добавьте в реакционную смесь 5 мкл 10% додецилсульфата натрия (SDS) и 1 мкл протеиназы K (20 мг/мл, класс РНК). Перемешайте постукиванием, отжмите и инкубируйте при температуре 50 °C в течение 30 минут.
   4. Под вытяжным шкафом добавьте 100 мкл донной фазы фенол:хлороформ:изоамиловый спирт в плазмидную реакционную смесь для экстракции. Вихрьте, а затем центрифугируйте при 18 800 × г в течение 5 мин при комнатной температуре. Переместите верхнюю фазу в новую трубку.
   5. Повторите шаг 1.1.4 с хлороформом:изоамиловым спиртом в соотношении 24:1.
   6. В новой пробирке доведите объем реакции до 300 мкл, добавив 200 мкл воды, не содержащей нуклеазы, а затем добавьте 30 мкл 3 М ацетата натрия и 600 мкл 100% этанола.
   7. Перемешайте путем вихряния, а затем поместите при температуре −20 °C на 30-60 мин для осаждения этанола в ДНК.
   8. Центрифугу при 18 800 × г в течение 20 мин при 4 °C, выбросьте надосадочную жидкость и промойте гранулу 1 мл 70% этилового спирта. Повторите центрифугирование в течение 10 мин, а затем полностью удалите надосадочную жидкость.
   9. Высушите при открытой крышке в течение 2 минут, добавьте 30 мкл воды, не содержащей нуклеаз, и снова суспендируйте гранулу ДНК.
   10. Определите концентрацию ДНК с помощью спектрофотометра.
   11. Проверьте размер и количество линеаризованной ДНК с помощью электрофореза в агарозном геле.
2. Синтез РНК с использованием РНК-полимеразы Т7
   1. Добавьте по 2 мкл 10-кратного транскрипционного буфера, АТФ, ГТФ, УТФ, КТФ и Т7 и 1 мкг линеаризованной ДНК в микроцентрифужную пробирку. Добавьте воду, не содержащую нуклеаз, чтобы довести объем реакции до 20 мкл.
   2. Перемешайте путем постукивания, отжимите и инкубируйте реакционную смесь при 37 °C в течение 2 ч для синтеза РНК.
   3. Отжим, добавьте 1 мкл ДНКазы (2 Ед/мкл) и инкубируйте при 37 °C в течение 15 мин, чтобы удалить матричную ДНК.
3. Осаждение хлорида лития РНК
   1. Добавьте в реакционную смесь 10 мкл хлорида лития (7,5 М). Перемешайте постукиванием, отжмите и инкубируйте реакционную смесь при −20 °C в течение 30 мин.
   2. Центрифугу при 18 800 × г в течение 20 мин при 4 °C, выбросьте надосадочную жидкость и промойте гранулу 500 мкл 70% этанола. Повторите центрифугирование в течение 10 мин, а затем полностью удалите надосадочную жидкость.
   3. Сушить при открытой крышке в течение 2 минут, добавить 30 мкл воды, не содержащей нуклеаз, и повторно суспендировать гранулу РНК.
4. Головка
   1. Нагрейте образец РНК при 65 °C в течение 10 мин, а затем поместите его на лед для охлаждения.
   2. Добавьте по 5 мкл 10-кратного укупорочного буфера, 10 мМ ГТФ и 1 мМ (10-кратного) S-аденозилметионина (SAM), по 2 мкл смеси ферментов укупорки и смеси ферментов O-метилтрансферазы и 1,25 мкл ингибитора РНКазы. Перемешайте постукиванием, отжмите и инкубируйте реакционную смесь при 37 °C в течение 1 ч.
5. Поли(А) хвостохранилище
   1. Открутите образец, а затем добавьте 6 мкл воды, не содержащей нуклеаз, 20 мкл 5-кратного буфера E-PAP, 10 мкл 25 мМ MnCl₂, 10 мкл 10 мМ АТФ и 4 мкл пищеварного фермента E-PAP poly(A). Перемешайте постукиванием, отжмите и инкубируйте реакционную смесь при 37 °C в течение 2 ч.
6. Осаждение хлорида лития и количественное определение синтетической мРНК
   1. Добавьте 50 мкл хлорида лития (7,5 M) и выполните осаждение хлорида лития, как описано в шагах 1.3.1-1.3.3.
   2. Измерьте концентрацию мРНК с помощью спектрофотометра.
   3. Проверьте размер и количество мРНК с помощью формальдегидного (1%-2%), агарозного (1%) гель-электрофореза.

2. Гелевое покрытие внеклеточного матрикса (ECM) пластин для клеточной инвазии и миграции (CIM)

ПРИМЕЧАНИЕ: Пластина для клеточной инвазии и миграции (CIM) представляет собой коммерчески производимую 16-луночную пластину для анализа клеток на основе импеданса в режиме реального времени. Для анализа клеточной инвазии покройте пластины CIM гелем ECM, как описано выше, но с некоторыми модификациями¹¹.

1. Достаньте аликвоту гелевого бульона ECM из морозильной камеры и храните его на льду.
2. Разбавьте гель ECM (10 мг/мл) до рабочей концентрации (100 мкг/мл), смешав 990 мкл модифицированной орлиной среды (DMEM) Dulbecco (без сыворотки или антибиотиков) с 10 мкл геля ECM в пробирке для микроцентрифуги. Смешайте с помощью осторожного пипетирования.
3. Добавьте 60 мкл разбавленного геля ECM в каждую из 16 лунок верхней камеры пластины CIM. Применяют метод обратного пипетирования, избегая образования пузырьков воздуха^20,21.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимизируйте концентрацию геля ECM для каждой клеточной линии. Для клеточных линий глиобластомы для оптимизации использовали гель ECM от 0,1 мкг/мкл до 1 мкг/мкл.
4. Поместите верхнюю камеру пластины CIM со снятой крышкой пластины на защитный пластиковый лист внутри инкубатора CO₂ примерно на 4 часа, чтобы образовался слой геля.
   ВНИМАНИЕ: Во время покрытия пластины КИМ гелем ВКМ электроды верхней камеры пластины КИМ не должны иметь прямого контакта с руками экспериментатора или поверхностями оборудования, включая шкаф биобезопасности или инкубатор_СО2 .

3. Подготовка опухолевых клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Все материалы для клеточных культур должны храниться стерильными. Забор и электропорация опухолевых клеток в шкафу биологической безопасности с использованием соответствующих средств индивидуальной защиты (СИЗ), как описано выше, но с некоторыми модификациями¹¹.

1. Культивирование опухолевых клеток
   1. Культивирование клеток U-118MG в 10 мл ДМЭМ, содержащего 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% антибиотиков на чашку для культивирования полистирольных тканей размером 100 мм х 20 мм при 37 °C в инкубаторе с 5%_СО2 (условия культивирования).
2. Истощение сыворотки опухолевых клеток
   ПРИМЕЧАНИЕ: Воздействие на клетки хемоаттрактантов, присутствующих в FBS, должно быть сведено к минимуму перед анализом миграции и инвазии клеток с использованием высокой концентрации FBS.
   1. Удалите старую среду и добавьте 10 мл предварительно подогретого DMEM, содержащего 0,5% FBS и 1% антибиотиков на чашку (среда с низким содержанием сыворотки).
   2. Повторите шаг 3.2.1.
   3. Инкубируют клетки при 37 °C в инкубаторе с 5%_СО2 в течение 4 ч или дольше.
3. Забор опухолевых клеток
   1. Удалите старую среду, добавьте 8 мл предварительно подогретого фосфатно-солевого буфера Dulbecco (DPBS) на чашку, удалите DPBS, добавьте предварительно подогретый 0,05% трипсин-ЭДТА (2 мл/чашка), чтобы покрыть поверхность, и инкубируйте в инкубаторе_CO2 в течение 30 с.
   2. Осторожно аспирируйте трипсин-ЭДТА, добавьте среду с низким содержанием сыворотки крови (7 мл/чашку), а затем соберите клетки в центрифужную пробирку объемом 50 мл или 15 мл.
   3. Аликвотируйте небольшой объем клеток и используйте портативный автоматический счетчик клеток для подсчета клеток.
   4. Рассчитайте общее количество клеток и необходимый объем на 10 000 клеток/мкл.
   5. Центрифугируя клетки при 100 × г в течение 5 мин при комнатной температуре, отсасывают надосадочную жидкость, добавляют рассчитанный объем DMEM, содержащий 0,5% FBS (без антибиотиков), и осторожно ресуспендируют клеточную гранулу.
   6. Переносите 110 мкл клеточной суспензии, содержащей 1,1 миллиона клеток, в микроцентрифужную пробирку для каждой обработки.
   7. Повторите шаг 3.3.6, чтобы перенести клетки в четыре пробирки микроцентрифуги для четырех различных процедур.
      Примечание: Пластина CIM имеет в общей сложности 16 лунок. Спроектируйте четыре различных метода обработки для сравнения таким образом, чтобы для каждой обработки можно было назначить четыре лунки пластины CIM. Используйте электропорированные клетки для следующих экспериментов: вестерн-блоттинг-анализ (0,3 миллиона клеток на 35-миллиметровую чашку для культуры тканей), четыре лунки для анализа миграции клеток в реальном времени (0,1 миллиона клеток/лунка) и четыре лунки для анализа клеточной инвазии в реальном времени (0,1 миллиона клеток/лунка) для каждого лечения. Отрегулируйте количество ячеек, которые необходимо электропорировать, если план эксперимента изменится.

4. Электропорация опухолевых клеток

1. Чтобы удалить среду, добавьте 1 мл DPBS в клеточную суспензию в каждой пробирке, открутите клеточную суспензию три раза в течение 10 с каждый раз, поворачивая пробирку на 180° каждые 10 с с помощью мини-центрифуги, и удалите надосадочную жидкость с помощью микропипетки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно сформировать компактную, но легко суспендируемую клеточную гранулу.
2. Добавьте 110 мкл буфера ресуспензии R к клеточной грануле, чтобы получить 0,1 миллиона клеток в 10 мкл.
3. Добавьте синтетическую мРНК в клеточную гранулу для получения концентрации 0,2-20 нг/мкл в зависимости от желаемого уровня экспрессии. Осторожно перемешайте и ресуспендируйте гранулы клеток путем постукивания или осторожного пипетирования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте различные концентрации синтетической мРНК, исследуйте экспрессию белка с помощью вестерн-блоттинг-анализа и определяйте концентрацию синтетической мРНК, которая приводит к желаемому уровню экспрессии, чтобы исследовать специфическую корреляцию между экспрессией белка и биологическими эффектами.
4. Электропорируют 10 мкл клеточной суспензии с помощью электропорационной системы при напряжении 1 350 В в течение 10 мс по три импульса каждый раз.
5. Перенесите электропорированные клетки в новую пробирку микроцентрифуги с 1,1 мл DMEM, содержащего 0,5% FBS.
6. Повторяйте электропорацию до тех пор, пока остальная часть клеточной суспензии не будет электропорирована. Объедините электропорированные клетки в пробирке микроцентрифуги, чтобы получить 1,1 миллиона клеток в 1,1 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Электропорационные наконечники на 100 мкл и 10 мкл можно использовать для электропорации большого объема клеток, но электропорационные наконечники на 10 мкл и 100 мкл входят в два отдельных комплекта и приобретаются отдельно. Буфер для ресуспензии R входит в оба комплекта.
7. После завершения всех соответствующих электропораций аккуратно ресуспендируйте объединенные клетки.
8. Распределите 0,3 миллиона клеток в чашку для культивирования тканей из полистирола размером 35 мм x 10 мм с 2 мл DMEM, содержащего 5% FBS, и культивируйте клетки в течение 1 дня в условиях культивирования для приготовления общего клеточного лизата и вестерн-блоттинга.
9. Храните остальные электропорированные ячейки при комнатной температуре до тех пор, пока не будет готова система анализа клеток в режиме реального времени.

5. Настройка клеточного анализатора в режиме реального времени, программы и пластин CIM

ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте клеточный анализатор в режиме реального времени и две пластины CIM, как описано ранее¹¹.

1. Уравновешивание клеточного анализатора в режиме реального времени
   1. Переместите анализатор клеток в режиме реального времени в инкубатор_CO2 за несколько часов до использования, чтобы сбалансировать систему в условиях культивирования.
2. Настройка программы анализа
   1. Откройте программу анализа, дважды щелкнув значок программного обеспечения для анализа клеток в реальном времени на рабочем столе.
   2. Открыв параметр Настройка шаблона эксперимента по умолчанию, выберите параметр для выполнения трех экспериментов по отдельности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая люлька имеет отдельное окно. Существуют различные вкладки для настройки интервала и продолжительности измерений, анализа данных и других условий эксперимента.
   3. Откройте каждую подставку, нажав на вкладку «Номер ».
   4. Перейдите на вкладку Заметки об эксперименте, выберите папку, в которую будут сохранены данные, и введите название эксперимента .
   5. Перейдите на вкладку Layout (Компоновка ), настройте quadruplicate well для каждого условия обработки, выбрав четыре лунки за раз и введя информацию об образце, а затем нажмите Apply (Применить).
   6. Нажмите на вкладку «Расписание » | Добавьте шаг для настройки двухэтапного режима измерения импеданса ячейки. Затем нажмите « Применить », чтобы настроить первый шаг.
   7. Нажмите « Добавить шаг» еще раз, введите 10 минут для интервала и 48 часов для длительности миграции и вторжения, а затем нажмите «Применить », чтобы настроить второй шаг.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На первом этапе выполняется однократное измерение базовой линии (одно сканирование с интервалом 1 минута). На втором этапе измеряется импеданс ячейки для эксперимента (например, 289 разверток с интервалом 10 мин в течение 48 ч) на люльке. Отрегулируйте интервал и продолжительность в зависимости от плана эксперимента.
   8. Перейдите к следующей подставке и настройте ее, повторив шаги 5.2.3-5.2.7.
3. Подготовка пластин CIM
   1. За час до начала измерения импеданса клеток заполните лунки нижней камеры планшета CIM 160 мкл DMEM, содержащего 10% сыворотки или другие хемоаттрактанты.
   2. Соедините верхнюю камеру, содержащую лунки с гелевым покрытием ECM (для инвазии) или без покрытия (для миграции), с нижней камерой.
   3. Добавьте 50 мкл среды с низким содержанием сыворотки в лунки верхней камеры КИМ-планшета для анализа миграции клеток и поместите КИМ-планшет в колыбель системы.
   4. Перейдите на вкладку « Сообщение » и убедитесь, что отображается сообщение «Подключения в порядке ». Теперь пластина CIM готова к эксперименту.
   5. Предварительно инкубируйте собранную пластину CIM в инкубаторе_CO2 в течение 30-60 минут перед анализом клеток в режиме реального времени, чтобы акклиматизировать планшет CIM к условиям культуры.

6. Анализ клеток и экспорт данных в режиме реального времени

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните считывание базовых данных, заполнение ячеек, измерение импеданса ячеек и экспорт данных, как описано ранее¹¹.

1. Базовое чтение
   ПРИМЕЧАНИЕ: Базовая линия должна быть прочитана после того, как пластина CIM будет акклиматизирована, и до того, как ячейки будут добавлены в лунки верхней камеры.
   1. Нажмите кнопку «Пуск» для каждой подставки. Когда появится окно Сохранить как, сохраните экспериментальный файл, чтобы выполнить чтение базового плана.
2. Посев клеток
   1. Извлеките пластину CIM из подставки и поместите ее в шкаф биобезопасности на держателе пластины.
   2. Добавьте 100 мкл (содержащих 100 000 ячеек) электропорированных ячеек в лунки верхней камеры пластины CIM в соответствии с программой в блоке управления. Применяйте метод обратного пипетирования, избегая пузырьков воздуха.
   3. Оставьте пластину CIM под шкафом биобезопасности на 30 минут при комнатной температуре, чтобы убедиться, что клетки равномерно распределяются по дну лунки.
3. Измерение импеданса ячейки
   1. Переместите полностью собранную пластину CIM обратно на соответствующую подставку. Нажмите кнопку «Пуск » на базовой станции, чтобы начать измерение импеданса ячейки для второго шага.
   2. Перейдите на вкладку «График », затем нажмите кнопку « Добавить все » и установите флажки « Среднее » и «STD DEV », чтобы визуализировать данные в режиме реального времени.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Опцией построения графиков по умолчанию является Время для оси X и Индекс ячейки для оси Y. В разделе Plot Selection (Выбор графика ) пользователь может выбрать альтернативные параметры для оси Y: Normalized Cell Index (Нормализованный индекс ячейки) или Delta Cell Index (Индекс дельта-ячейки). После того, как будет сделана окончательная проверка, эксперимент будет завершен, и результаты будут сохранены автоматически.
4. Экспорт данных для анализа
   1. Перейдите на вкладку «График» и установите флажки «Среднее» и «Стандартное отклонение», чтобы скопировать данные для каждой скважины в отдельности.
   2. Щелкните правой кнопкой мыши на области графика и выберите Копировать данные в формате списка.
   3. Откройте пустой файл электронной таблицы, вставьте данные и сохраните файл.
   4. Вернитесь в программу анализа, перейдите на вкладку « Пластина » для каждой подставки и выберите «Отпустить », чтобы закрыть эксперимент для колыбели.
   5. Вернитесь к файлу электронной таблицы и настройте время необработанных данных таким образом, чтобы время начала на втором шаге стало фактическим временем начала измерения.

Белки Crk и CrkL играют важную роль в подвижности многих типов клеток, включая нейроны22, Т-клетки23, фибробласты 18,19 и различные опухолевые клетки13. Поскольку сообщалось о повышенном уровне белков Crk и CrkL при глиобластоме24,25,26, в этой работе изучалось влияние гиперэкспрессии CrkI, варианта сплайсинга Crk, на миграцию клеток глиобластомы. Клетки U-118MG электропорировали с различными концентрациями синтетической мРНК CrkI и анализировали на уровень белка и миграцию клеток. Электропорация клеток глиобластомы U-118MG с различными концентрациями синтетической мРНК CrkI приводила к концентрационно-зависимому увеличению FLAG-меченого белка CrkI через 1 сутки после трансфекции (рис. 1A). В то время как 0,2 нг/мкл и 2 нг/мкл мРНК приводили к неопределяемой или умеренной экспрессии экзогенного белка CrkI, 20 нг/мкл мРНК приводили к гораздо более высокому уровню экспрессии, чем эндогенный белок CrkI.

Результаты анализа клеточной миграции с использованием системы клеточного анализа в реальном времени показали, что электропорация мРНК CrkI 0,2 нг/мкл или 2 нг/мкл не оказывает существенного влияния на миграцию клеток. Тем не менее, электропорация мРНК CrkI 20 нг/мкл привела к явной стимуляции миграции клеток, при этом большее количество клеток мигрировало между 2 и 13 часами (рис. 1B). Сравнение уровня белка CrkI с клеточной миграцией показало, что миграция клеток глиобластомы стимулировалась повышением уровня белка CrkI. По-видимому, уровень белка CrkI должен быть выше определенного порога, чтобы вызвать существенную стимуляцию миграции клеток. Если бы миграция клеток измерялась различными способами для подсчета или наблюдения за мигрировавшими клетками в определенные моменты времени, возможно, потребовалось бы гораздо больше усилий для выявления такого рода изменений в миграции клеток.

Чтобы изучить, как гиперэкспрессия CrkL влияет на клеточную инвазию глиобластомы через слои геля ECM с различными концентрациями белков ECM, клетки U-118MG электропорировали синтетической мРНК CrkL и анализировали с точки зрения уровней белка и клеточной инвазии через слой геля ECM. Электропорация клеток глиобластомы U-118MG с синтетической мРНК CrkL приводила к устойчивой экспрессии FLAG-меченого белка CrkL через 1 день после трансфекции (рис. 2A). По мере увеличения концентрации белков ECM инвазия в контрольные клетки замедлялась (рис. 2B). Клетки с гиперэкспрессией CrkL также показали зависимое от концентрации геля ECM снижение клеточной инвазии (рис. 2C). Сравнение контрольных клеток и клеток с гиперэкспрессией CrkL при различных концентрациях геля ECM показало, что гиперэкспрессия CrkL в целом стимулировала клеточную инвазию через слой геля ECM (рис. 2D-G). Однако разница между двумя клеточными популяциями стала очевидной в разные моменты времени в зависимости от концентрации геля ECM.

Для геля ECM в дозе 0,1 мкг/мкл опосредованная гиперэкспрессией CrkL стимуляция клеточной инвазии была очевидна между 8 и 20 ч (рис. 2D), но разница в клеточной инвазии была незначительной через 32 ч. Для геля ECM 0,2 мкг/мкл разница в клеточной инвазии с гиперэкспрессией CrkL и без нее всегда была минимальной (рис. 2E). Для геля ECM 0,5 мкг/мкл разница в клеточной инвазии была очевидна между 24 и 36 ч (рис. 2F). Для геля ECM с концентрацией 1 мкг/мкл эффект гиперэкспрессии CrkL на клеточную инвазию стал слабо выражен через 48 ч (рис. 2G). Полученные результаты свидетельствуют о том, что окно для обнаружения различий между контрольными клетками и клетками, экспрессирующими CrkL, смещается на более позднее время по мере увеличения концентрации геля ECM. Результаты также свидетельствуют о том, что на две клеточные популяции дифференцированно влияло увеличение концентрации геля ECM в разные моменты времени. Например, через 12 ч клетки, экспрессирующие CrkL-сверхэкспрессию, показали значительно более высокую инвазию только при концентрации 0,1 мкг/мкл геля ECM (рис. 2H). Тем не менее, через 24 ч клетки, экспрессирующие CrkL, показали несколько более высокую или аналогичную инвазию при протестированных концентрациях геля ECM (рис. 2I). Таким образом, важно исследовать как зависящие от времени, так и зависящие от концентрации геля ECM различия в клеточной инвазии, чтобы получить всестороннее представление о различиях между двумя клеточными популяциями с гиперэкспрессией CrkL и без нее. Эти результаты показывают, что сочетание транзиторной гиперэкспрессии с использованием синтетической мРНК с анализом клеток в реальном времени на основе импеданса предоставляет мощный инструмент для анализа потенциальной корреляции между гиперэкспрессией генов и миграцией и инвазией опухолевых клеток. Изучение эффектов вариаций концентрации в синтетической мРНК и геле ECM позволит получить более точную и подробную информацию.

Рисунок 1: Влияние гиперэкспрессии CrkI на миграцию клеток глиобластомы. Клетки U-118MG электропорировали с указанными концентрациями (нг/мкл) мРНК CrkI , меченной FLAG. (А) Для вестерн-блоттинг-анализа электропорированные клетки культивировали в течение 1 дня перед приготовлением общего клеточного лизата. Сравнивали уровни белка при трансфекции синтетической мРНК CrkI . Антитела к Crk и CrkL использовались для обнаружения как эндогенных, так и меченых FLAG белков, а также для сравнения соотношения между эндогенными белками и белками, меченными FLAG. Винкулин и α-тубулин использовали в качестве контроля нагрузки. (B) Для анализа миграции клеток электропорированные клетки наносили на КИМ-планшет без дальнейшего культивирования. Для каждой пробы были получены значения индекса ячейки из четырех лунок и приведены их средние значения ± SD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Влияние гиперэкспрессии CrkL на клеточную инвазию глиобластомы. Клетки U-118MG электропорировали мРНК CrkL, не содержащейнуклеаз, или мРНК CrkL, меченной FLAG. (А) Для вестерн-блоттинг-анализа электропорированные клетки культивировали в течение 1 дня перед приготовлением общего клеточного лизата. Сравнивали уровни белка при трансфекции синтетической мРНК CrkL. Антитела к Crk и CrkL использовались для обнаружения как эндогенных, так и меченых FLAG белков, а также для сравнения соотношения между эндогенными белками и белками, меченными FLAG. Винкулин и α-тубулин использовали в качестве контроля нагрузки. (Б-Г) Для анализа клеточной инвазии электропорированные клетки наносили на пластину CIM с гелевым покрытием ECM без дальнейшего культивирования. Для каждой пробы были получены значения индекса ячейки из четырех лунок и приведены их средние значения ± SD. (B) Сравнивали данные клеточной инвазии контрольных клеток с различными концентрациями геля ECM. (C) Сравнивали данные клеточной инвазии клеток с гиперэкспрессией CrkL с различными концентрациями геля ECM. (Д-Г) Сравнивали данные клеточной инвазии между контрольными клетками и клетками с гиперэкспрессией CrkL для указанной концентрации геля ECM. (H) Сравнение клеточной инвазии через 12 ч между контрольными клетками и клетками, экспрессирующими CrkL. (I) Сравнение клеточной инвазии через 24 ч между контрольными клетками и клетками с гиперэкспрессией CrkL. Сокращения: ECM = внеклеточный матрикс; CIM = клеточная инвазия и миграция. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Схематические диаграммы экспериментальных процедур после нокдауна или гиперэкспрессии генов . (A) Экспериментальная процедура клеточного анализа в реальном времени после трансфекции миРНК. Поскольку для индуцирования полного нокдауна гена после трансфекции миРНК в экспериментальных условиях требуется 3-4 дня, клетки переделывали и культивировали в течение 3 дней после электропорации, прежде чем они были готовы к клеточному анализу в режиме реального времени. (B) Экспериментальная процедура анализа клеток в режиме реального времени после трансфекции синтетической мРНК. Поскольку экспрессия белка при трансфекции синтетической мРНК происходит быстро, электропорированные клетки были использованы для анализа клеток в режиме реального времени в тот же день. Обратите внимание на разницу между двумя экспериментальными процедурами; В то время как анализ клеток в реальном времени проводился через 3 дня после электропорации на нокдаун генов с использованием миРНК, анализ клеток в реальном времени проводился сразу после электропорации на предмет гиперэкспрессии генов синтетической мРНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.