Методическая статья

Количественное измерение миграции и инвазии опухолевых клеток в режиме реального времени после синтетической трансфекции мРНК

2.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/64274

⸱

23 июня 2023 г.

 , 
1Children’s Mercy Research Institute, Children’s Mercy Kansas City, 2Department of Pediatrics, University of Missouri-Kansas City School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Многие повышенные гены стимулируют миграцию и инвазию опухолевых клеток, что приводит к неблагоприятному прогнозу. Определение того, какие гены регулируют миграцию и инвазию опухолевых клеток, имеет решающее значение. Данный протокол представляет собой метод исследования влияния повышенной экспрессии гена на миграцию и инвазию опухолевых клеток в режиме реального времени.

Аннотация

Опухолевые клетки очень подвижны и инвазивны и демонстрируют измененные паттерны экспрессии генов. Знания о том, как изменения в экспрессии генов регулируют миграцию и инвазию опухолевых клеток, необходимы для понимания механизмов инфильтрации опухолевых клеток в соседние здоровые ткани и метастазирования. Ранее было продемонстрировано, что нокдаун генов с последующим измерением миграции и инвазии опухолевых клеток в режиме реального времени на основе импеданса позволяет идентифицировать гены, необходимые для миграции и инвазии опухолевых клеток. В последнее время мРНК-вакцины против SARS-CoV-2 вызывают повышенный интерес к использованию синтетических мРНК в терапевтических целях. Здесь метод с использованием синтетической мРНК был пересмотрен для изучения влияния гиперэкспрессии генов на миграцию и инвазию опухолевых клеток. Это исследование демонстрирует, что повышенная экспрессия генов с помощью синтетической трансфекции мРНК с последующим измерением на основе импеданса в режиме реального времени может помочь идентифицировать гены, которые стимулируют миграцию и инвазию опухолевых клеток. В данной методологической работе приводятся важные сведения о процедурах изучения влияния измененной экспрессии генов на миграцию и инвазию опухолевых клеток.

Введение

Подвижность опухолевых клеток играет решающую роль в метастазировании 1,2. Распространение опухолевых клеток на соседние и отдаленные здоровые ткани затрудняет лечение рака и способствует рецидиву 3,4. Поэтому важно понимать механизмы подвижности опухолевых клеток и разрабатывать соответствующие терапевтические стратегии. Поскольку многие опухолевые клетки имеют измененные профили экспрессии генов, крайне важно понять, какие изменения в профиле экспрессии генов приводят к изменению подвижности опухолевых клеток 5,6.

Было разработано несколько тестов для измерения миграции клеток in vitro. Некоторые анализы предоставляют только ограниченную информацию из-за того, что позволяют проводить измерения только в определенные моменты времени, в то время как другие предоставляют исчерпывающую информацию о подвижности опухолевых клеток в режиме реального времени7. Несмотря на то, что многие из этих анализов подвижности клеток могут дать количественные результаты в данный момент времени или в конечной точке, они не могут предоставить достаточно подробную информацию о динамических изменениях скорости миграции клеток в течение экспериментального периода. Кроме того, может быть трудно изучить потенциальные изменения скорости миграции клеток в зависимости от дизайна эксперимента, типов и количества клеток. Кроме того, эффекты неосложненного лечения могут быть исследованы с помощью простой количественной оценки традиционных анализов подвижности, но для изучения комплексных эффектов различных комбинированных методов лечения может потребоваться более сложная количественная оценка8.

Разработан прибор для контроля электрического тока микротитровой пластины на дне лунки, покрытой микроэлектродами9. Адгезия ячеек к поверхности лунки затрудняет поток электронов, а импеданс коррелирует с количественным и качественным связыванием клеток. Наличие микроэлектродов на дне скважины позволяет измерять адгезию, распространение и пролиферацию клеток. Наличие микроэлектродов под микропористой мембраной верхней камеры позволяет измерять миграцию клеток и инвазию в нижнюю камеру, при этом верхняя камера покрыта белками внеклеточного матрикса (ECM) для обеспечения инвазии10.

Ранее было продемонстрировано, что импедансные измерения миграции и инвазии опухолевых клеток в режиме реального времени позволяют получать данные в режиме реального времени в течение всего эксперимента, а также мгновенные сравнения и количественные оценки в различных экспериментальных условиях11. В этой методической работе нокдаун генов был индуцирован для проверки роли интересующих белков в миграции и инвазии опухолевых клеток. Поскольку полномасштабный эффект нокдауна генов в тестируемых экспериментальных условиях происходил через 3-4 дня после электропорации с малыми интерферирующими РНК (миРНК)8, клетки переделывали после электропорации и повторно собирали через 3 дня для измерения миграции и инвазии опухолевых клеток в режиме реального времени на основе импеданса.

CT10 регулятор киназы (Crk) и Crk-подобный (CrkL) представляют собой адапторные белки, которые опосредуют белок-белковые взаимодействия после различных путей рецептор-киназы факторов роста и нерецепторных путей тирозинкиназы12. Повышенные уровни белков Crk и CrkL способствуют плохому прогнозу при нескольких видах рака человека, включая глиобластому13. Однако неясно, как повышенное содержание белков Crk и CrkL приводит к неблагоприятному прогнозу. Поэтому важно определить влияние гиперэкспрессии Crk и CrkL на функции опухолевых клеток. Ранее было проведено исследование нокдауна генов, чтобы продемонстрировать, что эндогенные уровни белков Crk и CrkL необходимы для миграции и инвазии клеток глиобластомы8. Здесь была разработана модифицированная система анализа для изучения влияния гиперэкспрессии Crk и CrkL на миграцию и инвазию опухолевых клеток.

В последнее время синтез мРНК in vitro и его терапевтическое применение вновь привлекли внимание в связи с разработкой мРНК-вакцин против SARS-CoV-2 (обзор Verbeke et al.14). Кроме того, были достигнуты значительные успехи в использовании синтетической мРНК при раке и других заболеваниях15,16. Электропорация клеток является эффективным методом доставки синтетической мРНК и индуцирования транзиторной генетической модификации (рассмотрено Campillo-Davo et al.17), а использование синтетической мРНК обеспечивает быструю и эффективную экспрессию генов в иммортализированных фибробластах18. Этот метод сочетает в себе гиперэкспрессию генов с использованием синтетической мРНК с клеточным анализом в режиме реального времени для изучения миграции и инвазии опухолевых клеток. Однако экспериментальная схема, используемая для миРНК, не работает с трансфекцией синтетической мРНК, так как уровень экзогенных белков быстро возрастает и постепенно снижается при трансфекции синтетической мРНК18. Поэтому метод был модифицирован для проведения анализа миграции и инвазии клеток в режиме реального времени сразу после трансфекции без дополнительного культивирования клеток.

В этом методологическом документе показано, что сочетание измерений в реальном времени на основе импеданса с трансфекцией опухолевых клеток синтетическими мРНК обеспечивает быстрый и всесторонний анализ влияния регуляции генов на миграцию и инвазию опухолевых клеток. В данной методологической статье подробно описаны процедуры измерения влияния гиперэкспрессии Crk и CrkL на миграцию и инвазию клеток глиобластомы. Изучая концентрационно-зависимое влияние синтетической мРНК на миграцию опухолевых клеток, в статье четко описывается, как повышение уровня белка стимулирует миграцию опухолевых клеток. Кроме того, представлен подход варьирования концентрации геля ECM для оценки влияния изменений экспрессии генов на инвазию опухолевых клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Синтез мРНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Для синтеза мРНК все реагенты и оборудование должны быть специально обработаны для инактивации РНКаз перед использованием. Подробные сведения обо всех материалах, инструментах и реагентах, используемых в этом протоколе, см. в таблице материалов .

  1. Линеаризация ДНК
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мышиные кДНК CrkI и CrkL клонировали в вектор экспрессии pFLAG-CMV-5a для добавления эпитопной метки FLAG на С-конце и субклонировали в вектор pcDNA3.1/myc-His для включения промотора T7, как описано ранее18,19.
    1. Добавьте 10 мкл 10-кратного реакционного буфера, 1,5 мкл PmeI (10 000 ед/мл) и 10 мкг плазмидной ДНК в микроцентрифужную пробирку для линеаризации плазмидной ДНК с ферментом рестрикции. Добавьте воду, не содержащую нуклеаз, чтобы довести объем реакции до 100 мкл.
    2. Перемешайте постукиванием, отжмите и инкубируйте реакционную смесь при 37 °C в течение ночи.
    3. Отжим и добавьте в реакционную смесь 5 мкл 10% додецилсульфата натрия (SDS) и 1 мкл протеиназы K (20 мг/мл, класс РНК). Перемешайте постукиванием, отжмите и инкубируйте при температуре 50 °C в течение 30 минут.
    4. Под вытяжным шкафом добавьте 100 мкл донной фазы фенол:хлороформ:изоамиловый спирт в плазмидную реакционную смесь для экстракции. Вихрьте, а затем центрифугируйте при 18 800 × г в течение 5 мин при комнатной температуре. Переместите верхнюю фазу в новую трубку.
    5. Повторите шаг 1.1.4 с хлороформом:изоамиловым спиртом в соотношении 24:1.
    6. В новой пробирке доведите объем реакции до 300 мкл, добавив 200 мкл воды, не содержащей нуклеазы, а затем добавьте 30 мкл 3 М ацетата натрия и 600 мкл 100% этанола.
    7. Перемешайте путем вихряния, а затем поместите при температуре −20 °C на 30-60 мин для осаждения этанола в ДНК.
    8. Центрифугу при 18 800 × г в течение 20 мин при 4 °C, выбросьте надосадочную жидкость и промойте гранулу 1 мл 70% этилового спирта. Повторите центрифугирование в течение 10 мин, а затем полностью удалите надосадочную жидкость.
    9. Высушите при открытой крышке в течение 2 минут, добавьте 30 мкл воды, не содержащей нуклеаз, и снова суспендируйте гранулу ДНК.
    10. Определите концентрацию ДНК с помощью спектрофотометра.
    11. Проверьте размер и количество линеаризованной ДНК с помощью электрофореза в агарозном геле.
  2. Синтез РНК с использованием РНК-полимеразы Т7
    1. Добавьте по 2 мкл 10-кратного транскрипционного буфера, АТФ, ГТФ, УТФ, КТФ и Т7 и 1 мкг линеаризованной ДНК в микроцентрифужную пробирку. Добавьте воду, не содержащую нуклеаз, чтобы довести объем реакции до 20 мкл.
    2. Перемешайте путем постукивания, отжимите и инкубируйте реакционную смесь при 37 °C в течение 2 ч для синтеза РНК.
    3. Отжим, добавьте 1 мкл ДНКазы (2 Ед/мкл) и инкубируйте при 37 °C в течение 15 мин, чтобы удалить матричную ДНК.
  3. Осаждение хлорида лития РНК
    1. Добавьте в реакционную смесь 10 мкл хлорида лития (7,5 М). Перемешайте постукиванием, отжмите и инкубируйте реакционную смесь при −20 °C в течение 30 мин.
    2. Центрифугу при 18 800 × г в течение 20 мин при 4 °C, выбросьте надосадочную жидкость и промойте гранулу 500 мкл 70% этанола. Повторите центрифугирование в течение 10 мин, а затем полностью удалите надосадочную жидкость.
    3. Сушить при открытой крышке в течение 2 минут, добавить 30 мкл воды, не содержащей нуклеаз, и повторно суспендировать гранулу РНК.
  4. Головка
    1. Нагрейте образец РНК при 65 °C в течение 10 мин, а затем поместите его на лед для охлаждения.
    2. Добавьте по 5 мкл 10-кратного укупорочного буфера, 10 мМ ГТФ и 1 мМ (10-кратного) S-аденозилметионина (SAM), по 2 мкл смеси ферментов укупорки и смеси ферментов O-метилтрансферазы и 1,25 мкл ингибитора РНКазы. Перемешайте постукиванием, отжмите и инкубируйте реакционную смесь при 37 °C в течение 1 ч.
  5. Поли(А) хвостохранилище
    1. Открутите образец, а затем добавьте 6 мкл воды, не содержащей нуклеаз, 20 мкл 5-кратного буфера E-PAP, 10 мкл 25 мМ MnCl2, 10 мкл 10 мМ АТФ и 4 мкл пищеварного фермента E-PAP poly(A). Перемешайте постукиванием, отжмите и инкубируйте реакционную смесь при 37 °C в течение 2 ч.
  6. Осаждение хлорида лития и количественное определение синтетической мРНК
    1. Добавьте 50 мкл хлорида лития (7,5 M) и выполните осаждение хлорида лития, как описано в шагах 1.3.1-1.3.3.
    2. Измерьте концентрацию мРНК с помощью спектрофотометра.
    3. Проверьте размер и количество мРНК с помощью формальдегидного (1%-2%), агарозного (1%) гель-электрофореза.

2. Гелевое покрытие внеклеточного матрикса (ECM) пластин для клеточной инвазии и миграции (CIM)

ПРИМЕЧАНИЕ: Пластина для клеточной инвазии и миграции (CIM) представляет собой коммерчески производимую 16-луночную пластину для анализа клеток на основе импеданса в режиме реального времени. Для анализа клеточной инвазии покройте пластины CIM гелем ECM, как описано выше, но с некоторыми модификациями11.

  1. Достаньте аликвоту гелевого бульона ECM из морозильной камеры и храните его на льду.
  2. Разбавьте гель ECM (10 мг/мл) до рабочей концентрации (100 мкг/мл), смешав 990 мкл модифицированной орлиной среды (DMEM) Dulbecco (без сыворотки или антибиотиков) с 10 мкл геля ECM в пробирке для микроцентрифуги. Смешайте с помощью осторожного пипетирования.
  3. Добавьте 60 мкл разбавленного геля ECM в каждую из 16 лунок верхней камеры пластины CIM. Применяют метод обратного пипетирования, избегая образования пузырьков воздуха20,21.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимизируйте концентрацию геля ECM для каждой клеточной линии. Для клеточных линий глиобластомы для оптимизации использовали гель ECM от 0,1 мкг/мкл до 1 мкг/мкл.
  4. Поместите верхнюю камеру пластины CIM со снятой крышкой пластины на защитный пластиковый лист внутри инкубатора CO2 примерно на 4 часа, чтобы образовался слой геля.
    ВНИМАНИЕ: Во время покрытия пластины КИМ гелем ВКМ электроды верхней камеры пластины КИМ не должны иметь прямого контакта с руками экспериментатора или поверхностями оборудования, включая шкаф биобезопасности или инкубаторСО2 .

3. Подготовка опухолевых клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Все материалы для клеточных культур должны храниться стерильными. Забор и электропорация опухолевых клеток в шкафу биологической безопасности с использованием соответствующих средств индивидуальной защиты (СИЗ), как описано выше, но с некоторыми модификациями11.

  1. Культивирование опухолевых клеток
    1. Культивирование клеток U-118MG в 10 мл ДМЭМ, содержащего 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% антибиотиков на чашку для культивирования полистирольных тканей размером 100 мм х 20 мм при 37 °C в инкубаторе с 5%СО2 (условия культивирования).
  2. Истощение сыворотки опухолевых клеток
    ПРИМЕЧАНИЕ: Воздействие на клетки хемоаттрактантов, присутствующих в FBS, должно быть сведено к минимуму перед анализом миграции и инвазии клеток с использованием высокой концентрации FBS.
    1. Удалите старую среду и добавьте 10 мл предварительно подогретого DMEM, содержащего 0,5% FBS и 1% антибиотиков на чашку (среда с низким содержанием сыворотки).
    2. Повторите шаг 3.2.1.
    3. Инкубируют клетки при 37 °C в инкубаторе с 5%СО2 в течение 4 ч или дольше.
  3. Забор опухолевых клеток
    1. Удалите старую среду, добавьте 8 мл предварительно подогретого фосфатно-солевого буфера Dulbecco (DPBS) на чашку, удалите DPBS, добавьте предварительно подогретый 0,05% трипсин-ЭДТА (2 мл/чашка), чтобы покрыть поверхность, и инкубируйте в инкубатореCO2 в течение 30 с.
    2. Осторожно аспирируйте трипсин-ЭДТА, добавьте среду с низким содержанием сыворотки крови (7 мл/чашку), а затем соберите клетки в центрифужную пробирку объемом 50 мл или 15 мл.
    3. Аликвотируйте небольшой объем клеток и используйте портативный автоматический счетчик клеток для подсчета клеток.
    4. Рассчитайте общее количество клеток и необходимый объем на 10 000 клеток/мкл.
    5. Центрифугируя клетки при 100 × г в течение 5 мин при комнатной температуре, отсасывают надосадочную жидкость, добавляют рассчитанный объем DMEM, содержащий 0,5% FBS (без антибиотиков), и осторожно ресуспендируют клеточную гранулу.
    6. Переносите 110 мкл клеточной суспензии, содержащей 1,1 миллиона клеток, в микроцентрифужную пробирку для каждой обработки.
    7. Повторите шаг 3.3.6, чтобы перенести клетки в четыре пробирки микроцентрифуги для четырех различных процедур.
      Примечание: Пластина CIM имеет в общей сложности 16 лунок. Спроектируйте четыре различных метода обработки для сравнения таким образом, чтобы для каждой обработки можно было назначить четыре лунки пластины CIM. Используйте электропорированные клетки для следующих экспериментов: вестерн-блоттинг-анализ (0,3 миллиона клеток на 35-миллиметровую чашку для культуры тканей), четыре лунки для анализа миграции клеток в реальном времени (0,1 миллиона клеток/лунка) и четыре лунки для анализа клеточной инвазии в реальном времени (0,1 миллиона клеток/лунка) для каждого лечения. Отрегулируйте количество ячеек, которые необходимо электропорировать, если план эксперимента изменится.

4. Электропорация опухолевых клеток

  1. Чтобы удалить среду, добавьте 1 мл DPBS в клеточную суспензию в каждой пробирке, открутите клеточную суспензию три раза в течение 10 с каждый раз, поворачивая пробирку на 180° каждые 10 с с помощью мини-центрифуги, и удалите надосадочную жидкость с помощью микропипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно сформировать компактную, но легко суспендируемую клеточную гранулу.
  2. Добавьте 110 мкл буфера ресуспензии R к клеточной грануле, чтобы получить 0,1 миллиона клеток в 10 мкл.
  3. Добавьте синтетическую мРНК в клеточную гранулу для получения концентрации 0,2-20 нг/мкл в зависимости от желаемого уровня экспрессии. Осторожно перемешайте и ресуспендируйте гранулы клеток путем постукивания или осторожного пипетирования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте различные концентрации синтетической мРНК, исследуйте экспрессию белка с помощью вестерн-блоттинг-анализа и определяйте концентрацию синтетической мРНК, которая приводит к желаемому уровню экспрессии, чтобы исследовать специфическую корреляцию между экспрессией белка и биологическими эффектами.
  4. Электропорируют 10 мкл клеточной суспензии с помощью электропорационной системы при напряжении 1 350 В в течение 10 мс по три импульса каждый раз.
  5. Перенесите электропорированные клетки в новую пробирку микроцентрифуги с 1,1 мл DMEM, содержащего 0,5% FBS.
  6. Повторяйте электропорацию до тех пор, пока остальная часть клеточной суспензии не будет электропорирована. Объедините электропорированные клетки в пробирке микроцентрифуги, чтобы получить 1,1 миллиона клеток в 1,1 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Электропорационные наконечники на 100 мкл и 10 мкл можно использовать для электропорации большого объема клеток, но электропорационные наконечники на 10 мкл и 100 мкл входят в два отдельных комплекта и приобретаются отдельно. Буфер для ресуспензии R входит в оба комплекта.
  7. После завершения всех соответствующих электропораций аккуратно ресуспендируйте объединенные клетки.
  8. Распределите 0,3 миллиона клеток в чашку для культивирования тканей из полистирола размером 35 мм x 10 мм с 2 мл DMEM, содержащего 5% FBS, и культивируйте клетки в течение 1 дня в условиях культивирования для приготовления общего клеточного лизата и вестерн-блоттинга.
  9. Храните остальные электропорированные ячейки при комнатной температуре до тех пор, пока не будет готова система анализа клеток в режиме реального времени.

5. Настройка клеточного анализатора в режиме реального времени, программы и пластин CIM

ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте клеточный анализатор в режиме реального времени и две пластины CIM, как описано ранее11.

  1. Уравновешивание клеточного анализатора в режиме реального времени
    1. Переместите анализатор клеток в режиме реального времени в инкубаторCO2 за несколько часов до использования, чтобы сбалансировать систему в условиях культивирования.
  2. Настройка программы анализа
    1. Откройте программу анализа, дважды щелкнув значок программного обеспечения для анализа клеток в реальном времени на рабочем столе.
    2. Открыв параметр Настройка шаблона эксперимента по умолчанию, выберите параметр для выполнения трех экспериментов по отдельности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая люлька имеет отдельное окно. Существуют различные вкладки для настройки интервала и продолжительности измерений, анализа данных и других условий эксперимента.
    3. Откройте каждую подставку, нажав на вкладку «Номер ».
    4. Перейдите на вкладку Заметки об эксперименте, выберите папку, в которую будут сохранены данные, и введите название эксперимента .
    5. Перейдите на вкладку Layout (Компоновка ), настройте quadruplicate well для каждого условия обработки, выбрав четыре лунки за раз и введя информацию об образце, а затем нажмите Apply (Применить).
    6. Нажмите на вкладку «Расписание » | Добавьте шаг для настройки двухэтапного режима измерения импеданса ячейки. Затем нажмите « Применить », чтобы настроить первый шаг.
    7. Нажмите « Добавить шаг» еще раз, введите 10 минут для интервала и 48 часов для длительности миграции и вторжения, а затем нажмите «Применить », чтобы настроить второй шаг.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На первом этапе выполняется однократное измерение базовой линии (одно сканирование с интервалом 1 минута). На втором этапе измеряется импеданс ячейки для эксперимента (например, 289 разверток с интервалом 10 мин в течение 48 ч) на люльке. Отрегулируйте интервал и продолжительность в зависимости от плана эксперимента.
    8. Перейдите к следующей подставке и настройте ее, повторив шаги 5.2.3-5.2.7.
  3. Подготовка пластин CIM
    1. За час до начала измерения импеданса клеток заполните лунки нижней камеры планшета CIM 160 мкл DMEM, содержащего 10% сыворотки или другие хемоаттрактанты.
    2. Соедините верхнюю камеру, содержащую лунки с гелевым покрытием ECM (для инвазии) или без покрытия (для миграции), с нижней камерой.
    3. Добавьте 50 мкл среды с низким содержанием сыворотки в лунки верхней камеры КИМ-планшета для анализа миграции клеток и поместите КИМ-планшет в колыбель системы.
    4. Перейдите на вкладку « Сообщение » и убедитесь, что отображается сообщение «Подключения в порядке ». Теперь пластина CIM готова к эксперименту.
    5. Предварительно инкубируйте собранную пластину CIM в инкубатореCO2 в течение 30-60 минут перед анализом клеток в режиме реального времени, чтобы акклиматизировать планшет CIM к условиям культуры.

6. Анализ клеток и экспорт данных в режиме реального времени

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните считывание базовых данных, заполнение ячеек, измерение импеданса ячеек и экспорт данных, как описано ранее11.

  1. Базовое чтение
    ПРИМЕЧАНИЕ: Базовая линия должна быть прочитана после того, как пластина CIM будет акклиматизирована, и до того, как ячейки будут добавлены в лунки верхней камеры.
    1. Нажмите кнопку «Пуск» для каждой подставки. Когда появится окно Сохранить как, сохраните экспериментальный файл, чтобы выполнить чтение базового плана.
  2. Посев клеток
    1. Извлеките пластину CIM из подставки и поместите ее в шкаф биобезопасности на держателе пластины.
    2. Добавьте 100 мкл (содержащих 100 000 ячеек) электропорированных ячеек в лунки верхней камеры пластины CIM в соответствии с программой в блоке управления. Применяйте метод обратного пипетирования, избегая пузырьков воздуха.
    3. Оставьте пластину CIM под шкафом биобезопасности на 30 минут при комнатной температуре, чтобы убедиться, что клетки равномерно распределяются по дну лунки.
  3. Измерение импеданса ячейки
    1. Переместите полностью собранную пластину CIM обратно на соответствующую подставку. Нажмите кнопку «Пуск » на базовой станции, чтобы начать измерение импеданса ячейки для второго шага.
    2. Перейдите на вкладку «График », затем нажмите кнопку « Добавить все » и установите флажки « Среднее » и «STD DEV », чтобы визуализировать данные в режиме реального времени.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Опцией построения графиков по умолчанию является Время для оси X и Индекс ячейки для оси Y. В разделе Plot Selection (Выбор графика ) пользователь может выбрать альтернативные параметры для оси Y: Normalized Cell Index (Нормализованный индекс ячейки) или Delta Cell Index (Индекс дельта-ячейки). После того, как будет сделана окончательная проверка, эксперимент будет завершен, и результаты будут сохранены автоматически.
  4. Экспорт данных для анализа
    1. Перейдите на вкладку «График» и установите флажки «Среднее» и «Стандартное отклонение», чтобы скопировать данные для каждой скважины в отдельности.
    2. Щелкните правой кнопкой мыши на области графика и выберите Копировать данные в формате списка.
    3. Откройте пустой файл электронной таблицы, вставьте данные и сохраните файл.
    4. Вернитесь в программу анализа, перейдите на вкладку « Пластина » для каждой подставки и выберите «Отпустить », чтобы закрыть эксперимент для колыбели.
    5. Вернитесь к файлу электронной таблицы и настройте время необработанных данных таким образом, чтобы время начала на втором шаге стало фактическим временем начала измерения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Белки Crk и CrkL играют важную роль в подвижности многих типов клеток, включая нейроны22, Т-клетки23, фибробласты 18,19 и различные опухолевые клетки13. Поскольку сообщалось о повышенном уровне белков Crk и CrkL при глиобластоме24,25,26, в этой работе изучалось влияние гиперэкспрессии CrkI, варианта сплайсинга Crk,

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Миграция и инвазия являются важными особенностями опухолевых клеток. Измерение подвижности опухолевых клеток и понимание основного механизма, контролирующего подвижность опухолевых клеток, дают критически важное представление о терапевтических вмешательствах 2,27. Для изучения миграции клеток было разработано несколько методов7. Ранозаживляющий анализ с использованием царапин или вкладышей для посева является простым и часто используемым м...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Авторы благодарят Центр медицинского письма при Children's Mercy Kansas City за редактирование этой рукописи. Эта работа была поддержана Фондом Натали A.R.T. (Т..) и грантом Консультативного совета партнеров MCA от Детской больницы Милосердия (CMH) и Онкологического центра Университета Канзаса (KUCC) (Т..).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
AlphaImager HPProteinSimple92-13823-00Система визуализации агарозного геля
альфа;-тубулиновое антителоSigmaT9026Используется для обнаружения белка &альфа;-тубулина (разведение 1:3,000)
CIM-пластина 16Agilent Technologies, Inc5665825001Пластины клеточной инвазии и миграции
антитела Crk BDBiosciences610035Используется для обнаружения белков CrkI и CrkII (разведение 1:1,500)
Антитело CrkLSanta Cruzsc-319Используется для обнаружения белка CrkL (разведение 1:1,500)
Dulbecco' s Модифицированный Eagle' s Среда (DMEM)ATCC302002Среда для культивирования клеток
Фосфатно-солевой буфер Дульбекко (DPBS)Corning21-031-CVБуфер, используемый для промывания клеток
Фетальная бычья сыворотка (FBS)HycloneSH30910.03Питательная среда Добавка
Heracell VIOS 160i CO2 инкубаторThermo Scientific51030285CO2
IRDye 800CW для коз вторичное антитело против мышей IgGLi-Cor926-32210Вторичное антитело для анализа вестерн-блота (разведение 1:10 000)
IRDye 800CW козье вторичное антитело против кроликаLi-Cor926-32211Вторичное антитело для вестерн-блот-анализа  (Разбавление 1:10,000)
Хлорид лития InvitrogenAM9480Используется для осаждения РНК
Matrigel matrixCorning354234Гель Extracellular matrix (ECM)
MEGAscript T7 Набор для транскрипцииInvitrogenAM1334Используется для синтеза РНК
Millennium Маркеры РНКInvitrogenAM7150Используется для электрофореза формальдегида агарозного геля
Мини-центрифугаISC BioExpressC1301P-ISCИспользуется для раскручивания клеток
мышиного мозга QUICK-Clone кДНКTaKaRa637301Источник генов (вставок) для клонирования
NanoQuantTecanM200PROСистема количественного определения нуклеиновых кислот
Система электропорации Neon ThermoFisher ScientificMPK5000Система электропорации1
Neon transfection system 10 &микро; L комплектThermoFisher ScientificMPK1025Электропорация Неоновая
трансфекционная система 100 & микро; L наборThermoFisher ScientificMPK10096Набор для электропорации
NorthernMax Буфер денатурирующего геляInvitrogenAM8676Используется для электрофореза формальдегидного агарозного геля
NorthernMax Формальдегидный нагрузочный красительInvitrogenAM8552Используется для электрофореза формальдегидного агарозного геля
NorthernMax беговой буферInvitrogenAM8671Используется для электрофореза формальдегидного агарозного геля
Нуклеаза водаTeknovaW3331Используется для различных реакций при синтезе мРНК
Odyssey CLx ImagerLi-CorImager для вестерн-блоттинга
pcDNA3.1/myc-HisInvitrogenV80020Вектор, в который были клонированы вставки (мышиные CrkI и CrkL кДНК)
pFLAG-CMV-5aMillipore SigmaE7523Источник эпитопной метки FLAG
Фенол:хлороформ:изоамиловый спирт SigmaP2069Используется для экстракции ДНК
PmeINew England BioLabsR0560LИспользуется для линеаризации плазмид для синтеза мРНК
Poly(A) хвостовой наборInvitrogenAM1350Используется для поли(A) хвостовой реакции
Чашка для культивирования полистирольной ткани (стиль 100 x 20 мм)Corning353003Используется для культивирования клеток перед трансфекцией
Чашка для культуры тканей из полистирола (35 x 10 мм)Corning353001Используется для культивирования трансфицированных клеток
Протеиназа KInvitrogen25530049Используется для удаления белка в реакционной смеси
Очиститель Axioma Класс II, тип C1Корпорация Labconco304410001Шкаф биобезопасности для стерильного обращения с клетками
Ресуспензионный буфер RThermoFisher ScientificБуфер, входящий в комплекты для электропорации, MPK1025 и MPK10096. Буфер используется для восстановления клеток перед электропорацией, а его состав является служебной информацией.
РНКазеZapInvitrogenAM9780раствор для обеззараживания РНК
ScepterMilliporeC85360Ручной автоматизированный счетчик клеток 
Набор ScriptCap 2'-O-метилтрансферазыCellscriptC-SCMT0625Используется для реакции укупорки
ScriptCap m7G Система укупоркиCellscriptC-SCCE0625Используется для реакции укупорки
Раствор додецилсульфата натрияInvitrogen15553-035Моющее средство, используемое для реакции протеиназы
К Sorvall Legend XT центрифугаThermo Scientific75004532Настольная центрифуга для раскручивания ячеек
Trypsin-EDTAGibco25300-054Используется для диссоциации ячеек
U-118MG ATCCHTB15Адгезивная клеточная линия, полученная от пациента с глиобластомой
человека Антитело к винкулинуSigmaV9131Используется для обнаружения белка винкулина (разведение 1:100 000)
xCELLigence RTCA DPAgilent Technologies, Inc380601050Инструмент, используемый для анализа
клеток в реальном времени1Параметры электропорации и другая сопутствующая информация для различных клеточных линий доступны на домашней странице производителя (https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/transfection/neon-transfection-system/neon-transfection-system-cell-line-data.html?).
& инкубатор

Ссылки

  1. Palmer, T. D., Ashby, W. J., Lewis, J. D., Zijlstra, A. Targeting tumor cell motility to prevent metastasis. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (8), 568-581 (2011).
  2. Eccles, S. A., Box, C., Court, W. Cell migration/invasion assays and their application in cancer drug discovery. Biotechnology Annual Review. 11, 391-421 (2005).
  3. Kluiver, T. A., Alieva, M., van Vuurden, D. G., Wehrens, E. J., Rios, A. C. Invaders exposed: Understanding and targeting tumor cell invasion in diffuse intrinsic pontine glioma. Frontiers in Oncology. 10, 92(2020).
  4. Xie, Q., Mittal, S., Berens, M. E. Targeting adaptive glioblastoma: An overview of proliferation and invasion. Neuro-Oncology. 16 (12), 1575-1584 (2014).
  5. Wee, Y., Wang, T., Liu, Y., Li, X., Zhao, M. A pan-cancer study of copy number gain and up-regulation in human oncogenes. Life Sciences. 211, 206-214 (2018).
  6. Zhao, M., Liu, Y., Qu, H. Expression of epithelial-mesenchymal transition-related genes increases with copy number in multiple cancer types. Oncotarget. 7 (17), 24688-24699 (2016).
  7. Pijuan, J., et al. In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107(2019).
  8. Park, T., Large, N., Curran, T. Quantitative assessment of glioblastoma phenotypes in vitro establishes cell migration as a robust readout of Crk and CrkL activity. The Journal of Biological Chemistry. 296, 100390(2021).
  9. Urcan, E., et al. Real-time xCELLigence impedance analysis of the cytotoxicity of dental composite components on human gingival fibroblasts. Dental Materials. 26 (1), 51-58 (2010).
  10. Limame, R., et al. Comparative analysis of dynamic cell viability, migration and invasion assessments by novel real-time technology and classic endpoint assays. PLoS One. 7 (10), e46536(2012).
  11. Mudduluru, G., Large, N., Park, T. Impedance-based real-time measurement of cancer cell migration and invasion. Journal of Visualized Experiments. (158), e60997(2020).
  12. Feller, S. M. Crk family adaptors-signalling complex formation and biological roles. Oncogene. 20 (44), 6348-6371 (2001).
  13. Park, T. Crk and CrkL as therapeutic targets for cancer treatment. Cells. 10 (4), 739(2021).
  14. Verbeke, R., Lentacker, I., De Smedt, S. C., Dewitte, H. The dawn of mRNA vaccines: The COVID-19 case. Journal of Controlled Release. 333, 511-520 (2021).
  15. Heine, A., Juranek, S., Brossart, P. Clinical and immunological effects of mRNA vaccines in malignant diseases. Molecular Cancer. 20 (1), 52(2021).
  16. Kwon, H., et al. Emergence of synthetic mRNA: In vitro synthesis of mRNA and its applications in regenerative medicine. Biomaterials. 156, 172-193 (2018).
  17. Campillo-Davo, D., et al. The ins and outs of messenger RNA electroporation for physical gene delivery in immune cell-based therapy. Pharmaceutics. 13 (3), 396(2021).
  18. Park, T., Koptyra, M., Curran, T. Fibroblast growth requires CT10 regulator of kinase (Crk) and Crk-like (CrkL). The Journal of Biological Chemistry. 291 (51), 26273-26290 (2016).
  19. Park, T. J., Curran, T. Essential roles of Crk and CrkL in fibroblast structure and motility. Oncogene. 33 (43), 5121-5132 (2014).
  20. Chou, P. P., Jaynes, P. K., King, B. P., Chapman, E., Bailey, J. L. Precision comparison between conventional (method-I) and reverse (method-Ii) pipetting. Clinical Chemistry. 30 (6), 958(1984).
  21. Pushparaj, P. N. Revisiting the micropipetting techniques in biomedical sciences: A fundamental prerequisite in good laboratory practice. Bioinformation. 16 (1), 8-12 (2020).
  22. Park, T. J., Curran, T. Crk and Crk-like play essential overlapping roles downstream of disabled-1 in the Reelin pathway. The Journal of Neuroscience. 28 (50), 13551-13562 (2008).
  23. Huang, Y., et al. CRK proteins selectively regulate T cell migration into inflamed tissues. The Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 1019-1032 (2015).
  24. Wang, L., et al. Signaling adaptor protein Crk is indispensable for malignant feature of glioblastoma cell line KMG4. Biochemical and Biophysical Research Communications. 362 (4), 976-981 (2007).
  25. Kumar, S., et al. Reciprocal regulation of Abl kinase by Crk Y251 and Abi1 controls invasive phenotypes in glioblastoma. Oncotarget. 6 (35), 37792-37807 (2015).
  26. Kumar, S., et al. Crk tyrosine phosphorylation regulates PDGF-BB-inducible Src activation and breast tumorigenicity and metastasis. Molecular Cancer Research. 16 (1), 173-183 (2018).
  27. Raudenska, M., et al. Engine shutdown: Migrastatic strategies and prevention of metastases. Trends in Cancer. 9 (4), 293-308 (2023).
  28. Decaestecker, C., Debeir, O., Van Ham, P., Kiss, R. Can anti-migratory drugs be screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell migration. Medicinal Research Reviews. 27 (2), 149-176 (2007).
  29. Farasani, A., Darbre, P. D. Long-term exposure to triclosan increases migration and invasion of human breast epithelial cells in vitro. Journal of Applied Toxicology. 41 (7), 1115-1126 (2021).
  30. Hanusova, V., Skalova, L., Kralova, V., Matouskova, P. The effect of flubendazole on adhesion and migration in SW480 and SW620 colon cancer cells. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 18 (6), 837-846 (2018).
  31. Lago-Baameiro, N., et al. PARK7/DJ-1 inhibition decreases invasion and proliferation of uveal melanoma cells. Tumori. 109 (1), 47-53 (2023).
  32. Escalona, R. M., et al. Knock down of TIMP-2 by siRNA and CRISPR/Cas9 mediates diverse cellular reprogramming of metastasis and chemosensitivity in ovarian cancer. Cancer Cell International. 22 (1), 422(2022).
  33. Mosca, L., et al. Effects of S-adenosyl-L-methionine on the invasion and migration of head and neck squamous cancer cells and analysis of the underlying mechanisms. International Journal of Oncology. 56 (5), 1212-1224 (2020).
  34. Zhao, Q., et al. VEGI174 protein and its functional domain peptides exert antitumour effects on renal cell carcinoma. International Journal of Oncology. 54 (1), 390-398 (2019).
  35. Witte, D., et al. TGF-beta1-induced cell migration in pancreatic carcinoma cells is RAC1 and NOX4-dependent and requires RAC1 and NOX4-dependent activation of p38 MAPK. Oncology Reports. 38 (6), 3693-3701 (2017).
  36. Bui, L. C., et al. Regulation of aquaporin 3 expression by the AhR pathway is critical to cell migration. Toxicological Sciences. 149 (1), 158-166 (2016).
  37. Tsuji, K., et al. Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
  38. Frandsen, S. K., McNeil, A. K., Novak, I., McNeil, P. L., Gehl, J. Difference in membrane repair capacity between cancer cell lines and a normal cell line. The Journal of Membrane Biology. 249 (4), 569-576 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи